Summary
Модель кровотечения рафинированной трансекции хвостовой вены (TVT) у анестезируемых мышей является чувствительным методом in vivo для оценки гемофильного кровотечения. Эта оптимизированная модель кровотечения TVT использует кровопотерю и время кровотечения в качестве конечных точек, совершенствуя другие модели и избегая смерти в качестве конечной точки.
Abstract
Модели хвостовых кровотечений являются важными инструментами в исследованиях гемофилии, особенно для оценки эффектов прокоагулянтов. Модель выживания при трансекции хвостовой вены (TVT) была предпочтительной во многих условиях из-за чувствительности к клинически значимым дозам FVIII, тогда как другие установленные модели, такие как модель хвостового зажима, требуют более высоких уровней прокоагулянтных соединений. Чтобы избежать использования выживаемости в качестве конечной точки, мы разработали модель TVT, устанавливающую кровопотерю и время кровотечения в качестве конечных точек и полную анестезию в течение всего эксперимента. Вкратце, обезболенных мышей позиционируют с хвостом, погруженным в умеренный физиологический раствор (37 ° C) и дозированным с испытуемым соединением в правой боковой хвостовой вене. Через 5 мин левую боковую хвостовую вену перекрывают с помощью шаблонной направляющей, хвост возвращают в физиологический раствор, а все эпизоды кровотечения контролируют и регистрируют в течение 40 мин при сборе крови. Если кровотечение не происходит через 10 минут, 20 минут или 30 минут после травмы, сгусток осторожно бросают вызов, дважды протирая разрез влажным марлевым тампоном. Через 40 мин кровопотеря измеряется количеством гемоглобина, поступающего в физиологический раствор. Эта быстрая и относительно простая процедура приводит к последовательным и воспроизводимым кровотечениям. По сравнению с моделью выживания TVT, она использует более гуманную процедуру без ущерба для чувствительности к фармакологическому вмешательству. Кроме того, можно использовать оба пола, уменьшая общее количество животных, которых необходимо разводить, в соответствии с принципами 3R. Потенциальным ограничением в моделях кровотечений является стохастический характер гемостаза, который может снизить воспроизводимость модели. Чтобы противостоять этому, ручное разрушение сгустка гарантирует, что сгусток будет оспорен во время мониторинга, предотвращая первичный (тромбоцитарный) гемостаз от остановки кровотечения. Это дополнение к каталогу моделей кровоточащих травм предоставляет возможность охарактеризовать эффекты прокоагулянтов стандартизированным и гуманным образом.
Introduction
Животные модели необходимы для понимания патогенеза гемофилии и разработки и тестирования схем лечения и терапии. Нокаутирующая мышь фактора VIII (F8-KO) является широко используемой моделью для изучения гемофилии А 1,2. Эти мыши повторяют ключевые особенности заболевания и широко используются для разработки методов лечения, таких как рекомбинантные продукты FVIII 3,4,5 и стратегии генной терапии 6,7.
Существуют различные модели повреждения кровотечением для оценки фармакологических эффектов различных гемостатических соединений in vivo. Одной из таких моделей коагуляции является модель выживания при трансекции хвостовой вены у мышей 8,9,10,11,12,13,14, измеряющая способность гемофильных мышей переживать экссангинацию после трансекции хвоста. Этот метод был введен более четырех десятилетий назад15 и до сих пор используется 9,16,17. Тем не менее, модель использует выживание в качестве конечной точки и требует наблюдения за животными в течение периода до 24 часов, в течение которого животные находятся в сознании и, следовательно, могут испытывать боль и страдания.
Ранее были описаны модели кровотечения более короткой продолжительности и под полной анестезией, такие как модель хвостового зажима (также известная как кончик хвоста)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Тем не менее, для полной нормализации кровопотери после кровотечения эти модели требуют доз прокоагулянтных соединений (например, FVIII) намного выше, чем те, которые вводились клинически29. Другая модель повреждения под анестезией, метод кровотечения вены зафены, чувствительна к более низким дозам прокоагулянтных соединений30, но требует высокого уровня вмешательства экспериментатора, поскольку сгустки должны часто нарушаться (в отличие от 3 раз в представленной модели).
Стандартизация в отношении общего протокола тестирования новых соединений прокоагулянтов значительно облегчила бы сопоставление данных между лабораториями 31,32,33. В моделях TVT еще нет общего согласия по изученным конечным точкам (потеря крови 7,26, время кровотечения 9,34 и выживаемость35,36), а длина эксперимента варьируется между исследованиями13.
Нашей основной целью является описание и характеристика оптимизированной модели с высокой воспроизводимостью, возможностью изучения по требованию, а также профилактическим лечением, чувствительностью к фармакологическому вмешательству, эквивалентному модели выживания, но без использования смерти или околосмертности в качестве конечных точек. Чтобы уменьшить боль и дистресс, животные не должны быть в сознании во время кровотечения, и необходимо реализовать более этичную конечную точку37.
Модели хвостового зажима обычно проводятся в одном из двух вариантов, либо ампутируя кончик хвоста, например, ампутация 1-5 мм 18,19,20,21,23,24 или, в более тяжелом варианте, пересеченная при диаметре хвоста около 1-3 мм 8,22,25 . Это вызывает комбинированное артериовенозное кровотечение, так как боковые и дорсальные вены и вентральная артерия обычно разрываются, и в целом, чем больше ампутация, тем ниже чувствительность к прокоагулянтному соединению. Кроме того, поскольку кончик хвоста ампутируется, артериовенозное повреждение подвергается воздействию без каких-либо противоположных тканей; таким образом, по крайней мере в теории, он отличается от наиболее распространенных гемофильных кровотечений.
Как следует из названия, только вена повреждается в моделях трансекции хвостовой вены, таких как описано в этой статье, что приводит к исключительно венозному кровотечению. Поскольку сосуд не полностью разорван, травма, как ожидается, будет меньше, чем в моделях ампутации, а ткань вокруг разреза, к которой может прилипнуть сгусток, сохраняется. Кроме того, существует более низкое кровяное давление в вене, в отличие от артерии. Эти факторы способствуют повышению чувствительности относительно моделей ампутации, так что нормализация кровотечений может быть достигнута с помощью клинически значимых доз заместительной терапии, например, при rFVIII при гемофилии А, что полезно для оценки величины и длительности эффектов лечения прокоагулянтами 26,38,39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, описанные в этом протоколе, были одобрены Органом по защите животных в Novo Nordisk A/S и Датской инспекцией по экспериментам на животных, Министерством продовольствия, сельского хозяйства и рыболовства Дании. Оптимизированный 40-минутный метод включает анестезию и время дозирования в конструкции (рисунок 1). Для этой процедуры требуются гемофильные мыши обоих полов в возрасте 10-16 недель.
1. Подготовка к исследованию
- Приготовьте дозирующие растворы в правильных концентрациях.
- Запустите водяную баню и нагрейте до 37 °C. Заполните 15 мл центрифужных пробирок для забора крови физиологическим раствором (0,9% NaCl).
- Поместите солевые трубки объемом 15 мл в отверстия в нагретой опорной плите не менее чем за 15 минут до начала эксперимента.
- Идентифицируйте мышей и записывайте их вес. Избегайте обращения с мышами больше, чем необходимо, так как это может вызвать стресс и повлиять на исследование.
- Подготовьте рабочее место в вытяжном шкафу, прежде чем продолжить, чтобы все было в пределах досягаемости: салфетки, держатель хвоста, марля, шприцы, скальпели, секундомеры и бумага для записи кровотока.
- Поместите хвостовую метку и режущие блоки на нагревательную пластину – холодные блоки заставят вены сжиматься и тем самым повлияют на кровотечение.
2. Анестезия
- Проведите процедуру анестезии изофлурана внутри вытяжного капюшона.
- Установите газовый испаритель на первоначально 5% изофлурана в 30% O2/70% N2Oв анестезиологической камере с расходом 1 л/мин. Дайте достаточно времени для заполнения анестезиологической камеры (около 5 минут в зависимости от объема камеры и скорости потока газа). Обеспечьте быструю индукцию (менее одной минуты).
- Поместите мышей в анестезиологическую камеру до тех пор, пока они не потеряют сознание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно произойти в течение минуты или меньше, если камера достаточно заполнена. - Обеспечить правильную анестезию за счет отсутствия болезненной реакции на педальный рефлекс (твердое защемление пальца ноги).
- Поместите мышей на нагревательную пластину, убедившись, что нос находится в носовом конусе.
- Уменьшите анестезию до поддерживающего уровня 2% изофлурана в 30% O2/70%N2Oи поместите пластиковую крышку над мышами, чтобы уменьшить потерю тепла. Нанесите подходящую глазную мазь, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
- Отметьте хвост диаметром 2,5 мм с помощью блока хвостовой метки. Не загоняйте хвост в щель в блоке - он должен плотно прилегать (Дополнительный рисунок 1)
- Поместите хвост в солевой трубочке не менее чем на 5 минут, чтобы обеспечить теплую хвостовую вену, оптимальную для внутривенного (т.е.в.) дозирования.
3. Дозирование тестового раствора
- Поместите одну мышь в держатель хвоста с носом в анестезиологическую маску.
- Дозируйте животное с интересующим соединением (в данном случае rFVIII) и немедленно запустите секундомер (t = 0).
- Поместите мышь обратно на нагревательную пластину с хвостом в соляной трубке. Повторите процедуру с другими мышами.
4. Выполнение трансекции хвостовой вены
- Выполняют трансекцию хвостовой вены ровно через 5 мин после дозирования. Поместите хвост в режущий блок и поверните на 90°, чтобы обнажить вену (дополнительный рисунок 2).
- Выполните разрез на противоположной стороне/вене, откуда был дозирован тестовый раствор.
- Проведите лезвие скальпеля No 11 через щель режущего блока, удерживающего хвост, чтобы создать кровотечение. Сбросьте секундомер и сразу же верните хвост в солевой раствор.
5. Время наблюдения и задачи
- Наблюдать кровотечение и комментировать начало и остановку кровотечения в течение 40 мин; аннотируйте его на бумаге для обозначения кровотока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта визуальная оценка кровотечения может незначительно варьироваться из-за субъективности. - Первичное кровотечение должно прекратиться в течение 3 мин после того, как сделан разрез. Если это не так, дисквалифицируйте мышь, усыпните и замените (неспособность остановить первичное кровотечение может указывать на слишком серьезную травму или отсутствие первичного гемостаза, как у мышей vWF KO).
- Если кровотечение не происходит через 10 мин, 20 мин и 30 мин после травмы, бросьте вызов порезу хвоста, как описано в шагах 4-5.
- Используйте марлевой тампон, смоченный в теплом физиологическом растворе из отдельной трубки, хранящейся на водяной бане. Поднимите хвост из соляного раствора и мягко протрите дважды мокрой марлей в дистальном направлении над хвостовым срезом.
- После каждого вызова немедленно снова погружайте хвост в соленую трубку.
- При t=40 мин остановите забор крови, удалив хвост из солевой трубки.
6. Забор крови
- Через t = 40 мин получают образцы крови из надглазничной вены.
7. Эвтаназия
- Усыпляют мышей путем вывиха шейки матки, все еще находясь под полным наркозом.
8. Обработка образцов
- Центрифугировать пробирки для забора крови объемом 15 мл физиологическим раствором при 4000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Выбросьте супернатант из пробирок объемом 15 мл, повторно суспендируйте гранулу в 2-14 мл раствора лизирования эритроцитов (эритроцитов (эритроцитов), а затем разбавьте его до тех пор, пока он не достигнет светлого кофейного цвета.
- Обратите внимание на общий объем (объем крови + объем эритроцитов (эритроцитов( эритроцитов) раствора лизирования, добавленного с помощью градуировочных отметок на пробирке).
- Переложите 2 мл разведения в гемоглобиновую трубку и охладите ее до анализа гемоглобина.
- Определить кровопотерю путем измерения концентрации гемоглобина в физиологическом растворе. Измерьте поглощение при 550 нм на микропластинчатом считывателе (Таблица материалов).
- Преобразуют абсорбцию в нмоль-гемоглобин с помощью стандартной кривой, полученной из гемоглобина человека (Таблица материалов) и корректирующей для разведения раствором эритроцитариевого лизинга.
9. Статистический анализ
- Анализируйте данные с помощью соответствующего программного обеспечения. Здесь использовалось программное обеспечение GraphPad Prism. В ходе ряда исследований было обнаружено, что следующие статистические методы работают хорошо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа кровопотери, времени кровотечения, экспозиции, количества тромбоцитов и гематокрита; Был использован тест Брауна-Форсайта и Уэлча ANOVA (поскольку данные были непрерывными, но без дисперсионной однородности остатков), применяя тест Даннетта для корректировки на множественные сравнения. Тест Пирсона использовался для проверки корреляций между временем кровотечения, кровопотерей и дозами. Для определения значений ED50 к данным о кровотечениях и кровопотерях было установлено четырехпараметрическое уравнение обратного логарифма (дозы). Для анализа гендерного эффекта был использован двусторонний тест ANOVA, в котором применялась коррекция Бонферрони для корректировки на множественные сравнения. Уровень значимости был определен как P < 0,05. Данные отображаются как средства ± SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для оценки применимости оптимизированной модели было проведено исследование на мышах F8-KO (генетический фон C57BL), которым вводили коммерчески доступную заместительную терапию рекомбинантным фактором VIII (rFVIII); были протестированы четыре различные дозы: 1 МЕ/кг, 5 МЕ/кг, 10 МЕ/кг и 20 МЕ/кг. Кроме того, мы протестировали соответствующий транспортный (отрицательный) контроль на мышах F8-KO и группе дикого типа (WT), используя мышей C57BL в качестве положительной контрольной группы для оценки диапазона ответа в модели.
Следуя оптимизированному протоколу, наблюдалось значительное снижение кровопотери для групп лечения rFVIII по сравнению с группой транспортных средств. Кроме того, снижение времени кровотечения наблюдалось в группах лечения 5 МЕ/кг, 10 МЕ/кг и 20 МЕ/кг по сравнению с группой транспортных средств (рисунок 2). У мышей WT общая кровопотеря варьировалась от 201,8-841,9 нмоль Hgb (95% ДИ), а у транспортных мышей варьировалась от 5335 до 7148 нмоль Hgb (95% ДИ). После приблизительной эквивалентности 1000 нмоль Hgb ~ 125 мкл цельной крови, среднее кровотечение у мышей, обработанных транспортным средством, составило 780,25 мкл, в то время как в группе 20 МЕ/кг было 89,95 мкл. Таким образом, доза 20 МЕ/кг полностью нормализовала кровотечение, а введение 10 МЕ/кг вызывало значительный эффект, снижая кровопотерю почти до верхней границы диапазона WT (рисунок 3). Время кровотечения у мышей WT варьировалось от 0,98-9,16 мин (95% ДИ), а уровни дозы 10 МЕ/кг и 20 МЕ/кг уменьшали время кровотечения до предела этого диапазона. Сильная корреляция между кровопотерей и временем кровотечения наблюдалась в комбинированных данных (r = 0,9357, P < 0,0001) (рисунок 4).
Для оценки чувствительности модели к наблюдениям за кровопотерей и временем кровотечения было установлено четырехпараметрическое уравнение обратного логарифмического ответа и наблюдалось четкое дозозависимое влияние введения rFVIII на кровопотерю и на время кровотечения (рисунок 3). Расчетные значения ED50 для кровопотери и времени кровотечения составляли 2,41 ± 1,69 МЕ/кг и 2,55 ± 2,80 МЕ/кг соответственно.
Чтобы проиллюстрировать, как происходит кровотечение в модели, все зарегистрированные эпизоды кровотечения были построены для визуализации длины и количества кровотечений для каждой отдельной мыши (рисунок 5). Первичное кровотечение очень похоже во всех группах. Большая часть гемофильной группы транспортных средств начинает повторно кровоточить перед вторым вызовом через 20 минут, и примерно у половины этих животных кровотечение не прекращается после первого вызова. Наконец, как описано, лечение rFVIII уменьшало продолжительность эпизодов кровотечения у обработанных F8-KO мышей по сравнению с транспортным средством, с уже наблюдаемым изменением при самой низкой дозе. При самых высоких уровнях дозы большинство мышей истекали кровью только на короткое время после того, как им бросили вызов.
Концентрацию rFVIII в плазме измеряли с помощью люминесцентного кислородного канального анализа (LOCI), обнаруживающего hFVIII и аналоги, чтобы убедиться, что эффект, наблюдаемый при снижении кровопотери и времени кровотечения, зависел от концентрации (рисунок 6). Существует вариабельность внутри каждой группы (среднее cv 46%), но все же могут наблюдаться значительные различия между группами, что подтверждает, что эффект, наблюдаемый при кровопотере и времени кровотечения, зависит от концентрации FVIII в плазме. Все обработанные транспортным средством мыши измеряются ниже нижнего предела количественного определения для анализа (2 ЕД/л) и представлены с этим значением. Мышей WT не измеряли, поскольку применяемый анализ FVIII специфичен для обнаружения FVIII человека.
Количество тромбоцитов и гематокрит определяли для всех групп с использованием образцов крови, собранных после кровотечения (рисунок 7 и измеренных с помощью гематологического анализатора (Таблица материалов). Не было никаких различий между группами в количестве тромбоцитов, что указывает на то, что количество тромбоцитов не затрагивается, и мыши, следовательно, остаются способными к первичному гемостазу. Для измерений гематокрита нормальные уровни наблюдались у животных, получавших умеренные и более высокие дозы FVIII (5 МЕ/кг, 10 МЕ/кг и 20 МЕ/кг), тогда как значительно более низкие уровни наблюдались в группах, получавших транспортное средство и 1 МЕ/кг (по сравнению с животными WT). Это частое наблюдение у гемофильных животных после обильных кровотечений.
Классически, только один пол животных (обычно самец) использовался в исследованиях на животных, и это также описано для моделей выживания TVT 8,9,11,12. Стремясь уменьшить общее количество гемофильных мышей, необходимых в будущих исследованиях (для разведения и исследования), использовались оба пола. Чтобы оценить влияние пола в этой оптимизированной модели (рисунок 8), результаты кровопотери и времени кровотечения были подвергнуты двустороннему анализу ANOVA с полом и дозой в качестве факторов. В этом анализе эффект дозы rFVIII был статистически значимым (P < 0,0001), но пол мыши не оказывал существенного влияния на результаты (P 0,35), и не было обнаружено значимого взаимодействия между параметрами, что указывает на то, что ответы на лечение не различались между полами.
Рисунок 1: Временное проектирование экспериментальной установки. Фаза, предшествующая трансекции хвостовой вены (TVT), включает индукцию анестезии, согревание хвоста в физиологическом растворе и дозирование. После травмы ТВТ проводится 40-минутное наблюдение за кровотечением под наркозом, с последующими испытаниями каждые 10 мин. Экспериментальная процедура завершается сбором образцов крови и эвтаназией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Эффект rFVIII после внутривенного введения. Общая кровопотеря (левая панель) и общее время кровотечения (правая панель) мышей F8-KO. Каждая мышь показана как отдельные наблюдения и означает ± SEM. Различные тестовые дозы rFVIII представлены по оси X. Данные были проанализированы Брауном-Форсайтом и Уэлчем ANOVA, применив тест Даннетта для корректировки на множественные сравнения. P < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Кривые доза-реакция для кровопотери и времени кровотечения. Кровопотеря (левая панель) и время кровотечения (правая панель). Серая зона представляет собой 95% ДИ от значений 6 необработанных мышей дикого типа C57BL/6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: График корреляции для кровопотери и времени кровотечения. R2 = 0,8755, P < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Индивидуальные профили кровотечений у мышей дикого типа, транспортных средств, 1 МЕ/кг, 5 МЕ/кг, 10 МЕ/кг и 20 МЕ/кг rFVIII. Каждая линия представляет кровоточащий профиль одной мыши, тогда как каждая пунктирная полоса представляет эпизод кровотечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Воздействие rFVIII. Концентрацию FVIII в плазме измеряли с помощью люминесцентного анализа канала кислорода (LOCI) для обнаружения FVIII человека. Транспортные мыши находились ниже нижнего предела количественного определения (LLOQ) и, следовательно, были построены со значением LLOQ (2 ЕД/л). Животные WT не были измерены, поскольку применяемый анализ FVIII специфичен для обнаружения FVIII человека. Различные тестовые дозы rFVIII и контроль WT представлены в оси X. ** P < 0,01, *** P < 0,001 и **** P < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Гематологические данные. Количество тромбоцитов (левая панель) и гематокрит (правая панель) мышей F8-KO показаны как индивидуальное среднее значение наблюдений с SEM. Различные тестовые дозы rFVIII и контроль WT представлены на оси X. Данные были проанализированы Брауном-Форсайтом и Уэлчем ANOVA, применив тест Даннетта для корректировки на множественные сравнения. ** P < 0,01 и *** P < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8. Влияние пола. Кровопотеря (левая панель) и время кровотечения (правая панель), классифицированные по лечению, показаны как индивидуальные наблюдения со средним ± SEM. Данные были проанализированы с помощью двусторонней ANOVA с применением коррекции Бонферрони для корректировки на множественные сравнения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Время кровотечения ED50 (МЕ/кг) | Кровопотеря ED50 (МЕ/кг) | Выживаемость ED50 (МЕ/кг) | ||
| Модели под наркозом | Оптимизированная модель трансекции хвостовой вены | 2.6 ± 2.8 | 2.4 ± 1.7 | не относится |
| Вена сафена модель30 | 8.1 ± 2.2 | 5.1 ± 2.1 | не относится | |
| Умеренный хвостовой зажим (L = 3 мм)27 | не сообщается | 4.6 ± 0.5 | не относится | |
| Умеренный хвостовой зажим (L=4мм)28 | 39 | 28 | не относится | |
| Умеренный хвостовой зажим (L = 4 мм)20 | не сообщается | 53 | не относится | |
| Модели выживания | Модель выживания при трансекции хвостовой вены36 | не сообщается | не сообщается | 58 |
| Модель выживания при трансекции хвостовой вены10 | не сообщается | не сообщается | 21 |
Таблица 1: Значения ED50 . Сравнение значений ED50 различных доступных моделей кровотечений для исследований гемофилии на мышах. Данные извлекаются из цитируемых статей [надстрочный индекс ссылок] и представляются в виде ED50 (МЕ/кг)
Дополнительный рисунок 1: Шаблон измерения. Производится из алюминия. Размеры: 20 мм x 40 мм x 10 мм (Д x Ш x В). Паз: глубина 2,5 мм и ширина 2,5 мм; радиус 1,25 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Вырезание шаблона. Изготовлен из нержавеющей стали. Размеры: 20 мм x 40 мм x 10 мм (Д x Ш x В). Паз: глубина 3 мм и ширина 3 мм; радиус 1,5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот оптимизированный метод трансекции хвостовой вены (TVT) имеет ряд преимуществ по сравнению с методом выживания TVT. Животные полностью обезболиваются в течение всего периода исследования, что облегчает работу с мышами и повышает самочувствие животных. Кроме того, в отличие от модели выживания TVT, ночное наблюдение не требуется, и эта оптимизированная модель предлагает возможность измерения кровопотери и наблюдения точного времени кровотечения в течение 40 минут. Кроме того, более длительные периоды кровотечения у сознательных животных могут привести к смерти от экссангинации, что приводит к боли и дистрессу у животных и, вероятно, стрессу, что потенциально приводит к увеличению вариации14. Кровопотеря и время кровотечения были успешно охарактеризованы и подтверждены как конечные точки, заменяющие время до смерти или околосмертно. Фактическая травма хвоста хорошо определена и стандартизирована, поскольку она использует направляющую режущего блока для выполнения TVT, обеспечивая воспроизводимый срез, уменьшая сложность процедуры и техническую изменчивость. Следовательно, может быть достигнута более высокая надежность модели, уменьшая количество необходимых животных. Кроме того, данные показали, что можно использовать как самцов, так и самок мышей, тем самым уменьшая общее количество животных, подлежащих разведению, в соответствии с принципами 3R. Наряду с этими наблюдениями, существует тенденция, что самки мышей кровоточат немного меньше и немного больше варьируются в группах с высоким уровнем кровотечения, но не в группах с низким уровнем кровотечения. Более низкие показатели кровопотери могут быть связаны с женщинами, имеющими меньший размер и, следовательно, меньший объем крови по сравнению с мужчинами того же возраста.
Спонтанные кровотечения у пациентов с гемофилами обычно являются внутренними, особенно с участием костно-мышечного, мягкого и слизисто-кожного кровотечения, в то время как внешние травмы (такие как незначительные порезы) не являются наиболее распространенной причиной длительных кровотечений, хотя более тяжелые порезы и травмы могут быть опасными для жизни40,41. Эта оптимизированная модель индуцирует только венозное кровотечение, в то время как другие модели, такие как хвостовой зажим, вызывают смесь артерио-венозного кровотечения. Поскольку описанная модель является моделью только для вен, доза-эффект прокоагулянта в этой модели TVT может не отражать эффект при более тяжелом артериальном повреждении; таким образом, следует использовать другие модели кровотечений, если такие кровотечения находятся в фокусе.
Как показывает индивидуальный профиль кровотечения, первичное кровотечение очень похоже во всех группах, что указывает на то, что первичный гемостаз, т.е. агрегация активированных тромбоцитов, неповрежден в условиях гемофилии А42. При обездвиженной травме, даже при тяжелой гемофилии, агрегация тромбоцитов может быть достаточной для ослабления кровотечения. По этой причине с помощью эмпирических исследований мы обнаружили, что индуцирование кровотечения каждые 10 минут является необходимым шагом в протоколе, чтобы нарушить агрегаты активированных тромбоцитов, которые могут быть достаточно сильными, чтобы предотвратить кровотечение даже без генерации фибрина в результате функциональной коагуляции. Поскольку полностью анестезированные мыши не двигаются и не могут физически оспорить травму, как это происходит в неанестезированной модели выживания TVT, было необходимо ввести шаги вызова, чтобы предотвратить агрегацию тромбоцитов от ослабления кровотечения. Некоторые необработанные гемофильные мыши повторно кровоточат спонтанно до вызова, но после первого вызова спонтанные повторные кровотечения происходят у большинства необработанных гемофильных мышей, а после второго вызова многие кровоточат непрерывно до конца эксперимента. Как и ожидалось, наблюдалось повышенное кровотечение у транспортных мышей F8-KO по сравнению с мышами WT. Мыши, получавшие повышенные дозы rFVIII, показали дозозависимое снижение как кровопотери, так и времени кровотечения. Значительное влияние на кровотечение наблюдалось при дозах 5 МЕ/кг и выше (по сравнению с мышами, получавшими транспортное средство). Две самые высокие дозы уменьшали кровотечение до уровней, довольно близких к реакции кровотечения дикого типа, что указывает на нормализацию или почти нормализацию кровотечения.
В таблице 1 представлено сравнение различных значений ED50 для нескольких моделей кровотечений, классифицированных по исследуемым конечным точкам. В этой оптимизированной модели мы наблюдали сопоставимые значения ED50 для кровопотери и времени кровотечения (2,4 ± 1,7 МЕ / кг и 2,6 ± 2,8 МЕ / кг соответственно). Используя ту же модель, изучающую rFVIIa, значения ED50 для кровопотери и времени кровотечения составляли 0,42 мг / кг и 0,39 мг / кг соответственно38. Это большая чувствительность к фармакологическому вмешательству, чем ранее описанные модели кровотечений под наркозом, такие как модель хвостового зажима, с FVIII ED50 для кровопотери 4,6 ± 0,5 МЕ/кг27, 28 МЕ/кг28 и 53 МЕ/кг20. Кроме того, существует высокая изменчивость значений ED50 в различных моделях хвостовых зажимов 20,27,28. Другой моделью под наркозом является тяжелая модель хвостового зажима. Это более быстрый метод, так как период наблюдения составляет всего 20 минут, но он менее чувствителен к активности прокоагулянтов. Дозы выше 200 МЕ/кг FVIII были необходимы для достижения статистически значимого снижения кровопотери по сравнению с животными, получавшимитранспортное средство 25. В вене saphena model30 значение ED50 для времени кровотечения составляло 8,1 ± 2,2 МЕ/кг, а ED50 для средней кровопотери составляло 5,1 ± 2,1 МЕ/кг, что также менее чувствительно, чем наша усовершенствованная модель в отношении обоих параметров. Кроме того, эта модель требует тонкой работы для выполнения повреждения сосуда и множественных повторных вмешательств, которые, если они не выполняются воспроизводимо, могут повлиять на результат.
В традиционной модели выживаемости TVT выживаемость оценивается в течение 24 ч после дозирования, во время которого кровотечение или повторное кровотечение может произойти в любое время. Таким образом, эффективность в модели выживаемости TVT требует, чтобы прокоагулянтный эффект лечения сохранялся, по крайней мере, в течение большей части 24-часового периода наблюдения. В методе, представленном здесь, мы оцениваем острые эффекты между 5 мин и 40 мин после дозирования; таким образом, прямое сравнение значений ED50 трудно установить, поскольку в моделях выживаемости потребуются более высокие дозы для поддержания гемостатического покрытия в течение последней части периода наблюдения. Однако при желании оптимизированная модель TVT может быть использована для оценки продолжительности гемостатического покрытия путем введения задержки между дозированием и процедурой кровотечения. Это было описано для предыдущей версии нашей оптимизированной модели TVT, где выполнение TVT 24 часа после дозирования привело к ED50 примерно 10-15 МЕ / кг для немодифицированного rFVIII26. Как отмечено в таблице 1, в моделях хвостовой трансекции с 24-часовой выживаемостью в качестве конечной точки сообщалось о значениях ED50 21 МЕ/кг 9 и 58 МЕ/кг36 rFVIII. Аналогичным образом, модели выживанияхвостового зажима 8 также требуют более высоких доз прокоагулянтов, чем их острые аналоги.
В перспективе несколько различных факторов свертывания крови (FVIII, FVIIa, FIX) и производных, некоторые из которых в настоящее время продаются, были оценены с помощью оптимизированной модели с использованием различных гемофильных штаммов мышей 26,38,43,44,45,46,47. Мы также смогли адаптировать модель к изучению вмешательств по требованию путем дозирования после трансекции, непосредственно перед первым вызовом. Кроме того, мы успешно использовали эту модель для оценки биспецифических антител с прокоагулянтной активностью (Østergaard et al., принятая для публикации в Blood), преодолевая проблемы перекрестной реактивности видов путем дозирования человеческого FIX и человеческого FX. Это демонстрирует универсальность и трансляционную ценность модели при разработке новых лекарственных средств в области гемофилии, таких как стратегии, нацеленные на тромбоциты48. Стратегии редактирования генома на основе AAV или генома также могут быть оценены в тех случаях, когда есть суррогатная мать, которая фармакологически активна у мышей. Таким образом, эта оптимизированная модель кровотечения TVT является альтернативой трансекции хвостовой вены и моделям выживания хвостового зажима, а также ценной альтернативой другим моделям кровотечений под анестезией. Эта модель более гуманна по сравнению с моделью выживания и является примером Утонченности, поскольку животные не испытывают боли и страданий. На наш взгляд, чувствительность к клинически значимым уровням дозы, относительная техническая простота и предотвращение смерти / околосмертности в качестве конечных точек являются значительными преимуществами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы являются или были сотрудниками и/или акционерами Novo Nordisk A/S на момент проведения этого исследования.
Acknowledgments
Эстер Блум и Томас Найгаард признаны за поддержку в измерениях FVIII в плазме. Бо Альстед признан за рисование и обработку шаблона и резку блоков.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 Scalpel blade | Swann-Morton | 503 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One, Austria | 188271 | |
| 30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing | BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe | 320830 | |
| Advate | Takeda, Japan | Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII) | |
| Alcohol pads 70% ethanol | Hartmann, Soft-Zellin | 999 979 | |
| Centrifuge | Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech | ||
| Cutting template (Stainless steel) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm | |
| Erythrocytes (RBC) lysing solution | Lysebio, ABX Diagnostics | 906012 | |
| Gauze | |||
| Haematological analyser | Sysmex | CT-2000iv | |
| Heating lamp on stand | Phillips | IR250 | |
| Heating pad with thermostat | CMA | model 150 | |
| Hemoglobin standards and controls - 8.81 mmol / l batch dependent | HemoCue, Denmark | HemoCue calibrator, 707037 | Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH). |
| Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box | Sigma Delta Dameca | ||
| Isoflurane | Baxter | 26675-46-7 | |
| Magnifier with lights | Eschenbach | ||
| Measuring template (Aluminum) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm | |
| Micropipettes + tips | Finnpipette | ||
| Photometer | Molecular Devices Corporation, CA, USA | SpectraMax 340 photometer | |
| Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | Version 9.0.1 | |
| Saline 0.9% NaCl | Fresenius Kabi, Sweden | 883264 | |
| Special tail marker block for TVT tail cut | |||
| Tail holder | |||
| Vacuum liquid suction | Vacusafe comfort, IBS | ||
| Waterbath and thermostat | TYP 3/8 Julabo |
References
- Bi, L., et al. Targeted disruption of the mouse factor VIII gene produces a model of haemophilia A. Nature Genetics. 10 (1), 119-121 (1995).
- Bi, L., et al. Further characterization of factor VIII-deficient mice created by gene targeting: RNA and protein studies. Blood. 88 (9), 3446-3450 (1996).
- Stennicke, H. R., et al. A novel B-domain O-glycoPEGylated FVIII (N8-GP) demonstrates full efficacy and prolonged effect in hemophilic mice models. Blood. 121 (11), 2108-2116 (2013).
- Shapiro, A. D. Anti-hemophilic factor (recombinant), plasma/albumin-free method (octocog-alpha; ADVATE) in the management of hemophilia A. Vascular Health and Risk Management. 3 (5), 555-565 (2007).
- Recht, M., et al. Clinical evaluation of moroctocog alfa (AF-CC), a new generation of B-domain deleted recombinant factor VIII (BDDrFVIII) for treatment of haemophilia A: demonstration of safety, efficacy, and pharmacokinetic equivalence to full-length recombinant factor VIII. Haemophilia. 15 (4), 869-880 (2009).
- Miao, C. H., et al. CD4+FOXP3+ regulatory T cells confer long-term regulation of factor VIII-specific immune responses in plasmid-mediated gene therapy-treated hemophilia mice. Blood. 114 (19), 4034-4044 (2009).
- Milanov, P., et al. Engineered factor IX variants bypass FVIII and correct hemophilia A phenotype in mice. Blood. 119 (2), 602-611 (2012).
- Dumont, J. A., et al. Prolonged activity of a recombinant factor VIII-Fc fusion protein in hemophilia A mice and dogs. Blood. 119 (13), 3024-3030 (2012).
- Pan, J., et al. Enhanced efficacy of recombinant FVIII in noncovalent complex with PEGylated liposome in hemophilia A mice. Blood. 114 (13), 2802-2811 (2009).
- Liu, T., et al. Improved coagulation in bleeding disorders by Non-Anticoagulant Sulfated Polysaccharides (NASP). Journal of Thrombosis and Haemostasis. 95 (1), 68-76 (2006).
- Brooks, A. R., et al. Glycoengineered factor IX variants with improved pharmacokinetics and subcutaneous efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (9), 1699-1706 (2013).
- Baru, M., et al. Factor VIII efficient and specific non-covalent binding to PEGylated liposomes enables prolongation of its circulation time and haemostatic efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 93 (6), 1061-1068 (2005).
- Molina, E. S., Fujita, A., Sogayar, M. C., Demasi, M. A. A quantitative and humane tail bleeding assay for efficacy evaluation of antihaemophilic factors in haemophilia A mice. Haemophilia. 20 (6), 392-398 (2014).
- Broze, G. J., Yin, Z. F., Lasky, N. A tail vein bleeding time model and delayed bleeding in hemophiliac mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 85 (4), 747-748 (2001).
- Dejana, E., Callioni, A., Quintana, A., de Gaetano, G. Bleeding time in laboratory animals. II - A comparison of different assay conditions in rats. Thrombosis Research. 15 (1-2), 191-197 (1979).
- Girard, T. J., Lasky, N. M., Grunz, K., Broze, G. J. Suppressing protein Z-dependent inhibition of factor Xa improves coagulation in hemophilia A. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (1), 149-156 (2019).
- Zhang, J. P., et al. Curing hemophilia A by NHEJ-mediated ectopic F8 insertion in the mouse. Genome Biology. 20 (1), 276 (2019).
- Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
- Tranholm, M., et al. Improved hemostasis with superactive analogs of factor VIIa in a mouse model of hemophilia A. Blood. 102 (10), 3615-3620 (2003).
- Mei, B., et al. Rational design of a fully active, long-acting PEGylated factor VIII for hemophilia A treatment. Blood. 116 (2), 270-279 (2010).
- Karpf, D. M., et al. Prolonged half-life of glycoPEGylated rFVIIa variants compared to native rFVIIa. Thrombosis Research. 128 (2), 191-195 (2011).
- Ivanciu, L., et al. A zymogen-like factor Xa variant corrects the coagulation defect in hemophilia. Nature Biotechnology. 29 (11), 1028-1033 (2011).
- Ostergaard, H., et al. Prolonged half-life and preserved enzymatic properties of factor IX selectively PEGylated on native N-glycans in the activation peptide. Blood. 118 (8), 2333-2341 (2011).
- Maroney, S. A., et al. Absence of hematopoietic tissue factor pathway inhibitor mitigates bleeding in mice with hemophilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3927-3931 (2012).
- Holmberg, H. L., Lauritzen, B., Tranholm, M., Ezban, M. Faster onset of effect and greater efficacy of NN1731 compared with rFVIIa, aPCC and FVIII in tail bleeding in hemophilic mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (9), 1517-1522 (2009).
- Johansen, P. B., Tranholm, M., Haaning, J., Knudsen, T. Development of a tail vein transection bleeding model in fully anaesthetized haemophilia A mice - characterization of two novel FVIII molecules. Haemophilia. 22 (4), 625-631 (2016).
- Ferrière, S., et al. A hemophilia A mouse model for the in vivo assessment of emicizumab function. Blood. 136 (6), 740-748 (2020).
- Elm, T., et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of a new recombinant FVIII (N8) in haemophilia A mice. Haemophilia. 18 (1), 139-145 (2012).
- Björkman, S. Prophylactic dosing of factor VIII and factor IX from a clinical pharmacokinetic perspective. Haemophilia. 9, Suppl 1 101-108 (2003).
- Pastoft, A. E., et al. A sensitive venous bleeding model in haemophilia A mice: effects of two recombinant FVIII products (N8 and Advate). Haemophilia. 18 (5), 782-788 (2012).
- Saito, M. S., et al. New approaches in tail-bleeding assay in mice: improving an important method for designing new anti-thrombotic agents. International Journal of Experimental Pathology. 97 (3), 285-292 (2016).
- Liu, Y., Jennings, N. L., Dart, A. M., Du, X. J. Standardizing a simpler, more sensitive and accurate tail bleeding assay in mice. World Journal of Experimental Medicine. 2 (2), 30-36 (2012).
- Greene, T. K., et al. Towards a standardization of the murine tail bleeding model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (12), 2820-2822 (2010).
- Cerullo, V., et al. Correction of murine hemophilia A and immunological differences of factor VIII variants delivered by helper-dependent adenoviral vectors. Molecular Therapy. 15 (12), 2080-2087 (2007).
- Shi, Q., et al. Factor VIII ectopically targeted to platelets is therapeutic in hemophilia A with high-titer inhibitory antibodies. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1974-1982 (2006).
- Parker, E. T., Lollar, P. A quantitative measure of the efficacy of factor VIII in hemophilia A mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 89 (3), 480-485 (2003).
- Stokes, W. S. Reducing Unrelieved Pain and Distress in Laboratory Animals Using Humane Endpoints. ILAR Journal. 41 (2), 59-61 (2000).
- Stagaard, R., et al. Abrogating fibrinolysis does not improve bleeding or rFVIIa/rFVIII treatment in a non-mucosal venous injury model in haemophilic rodents. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (7), 1369-1382 (2018).
- Stagaard, R., et al. Absence of functional compensation between coagulation factor VIII and plasminogen in double-knockout mice. Blood Advances. 2 (22), 3126-3136 (2018).
- Bolton-Maggs, P. H., Pasi, K. J.
- Lloyd Jones, M., Wight, J., Paisley, S., Knight, C. Control of bleeding in patients with haemophilia A with inhibitors: a systematic review. Haemophilia. 9 (4), 464-520 (2003).
- Sixma, J. J., vanden Berg, A. The haemostatic plug in haemophilia A: a morphological study of haemostatic plug formation in bleeding time skin wounds of patients with severe haemophilia A. British Journal of Haematology. 58 (4), 741-753 (1984).
- Proulle, V., et al. Recombinant activated factor VII-induced correction of bleeding tendency in genetically engineered von Willebrand disease type 2B mice evaluated using new tail transection bleeding models. International Society on Thrombosis and Haemostasis Congress. , (2017).
- Rode, F., et al. Preclinical pharmacokinetics and biodistribution of subcutaneously administered glycoPEGylated recombinant factor VIII (N8-GP) and development of a human pharmacokinetic prediction model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1141-1152 (2018).
- Holmberg, H., et al. GlycoPEGylated rFVIIa (N7-GP) has a prolonged hemostatic effect in hemophilic mice compared with rFVIIa. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1070-1072 (2011).
- Kawecki, C., et al. Posters Abstracts - Thrombin-mediated Activation of Factor VIII is Insufficient to Produce All Necessary Cofactor Activity in vivo. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3, 1 (2019).
- Johansen, P., et al. In vivo effect of recombinant FVIIA (NOVOSEVEN®) and RFIX in a refined tail vein transection bleeding model in mice with haemophilia A and B: PO147-MON. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13, (2015).
- Enoksson, M., et al. Enhanced potency of recombinant factor VIIa with increased affinity to activated platelets. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (1), 104-113 (2020).
