Summary
Anestezi uygulanan farelerde rafine kuyruk veni transeksiyonu (TVT) kanama modeli, hemofilik kanamanın değerlendirilmesinde duyarlı bir in vivo yöntemdir. Bu optimize edilmiş TVT kanama modeli, kan kaybını ve kanama süresini bitiş noktaları olarak kullanır, diğer modelleri rafine eder ve son nokta olarak ölümden kaçınır.
Abstract
Kuyruk kanaması modelleri, hemofili araştırmalarında, özellikle prokoagülan etkilerin değerlendirilmesinde önemli araçlardır. Kuyruk veni transeksiyonu (TVT) sağkalım modeli, klinik olarak ilgili FVIII dozlarına duyarlılık nedeniyle birçok ortamda tercih edilirken, kuyruk klipsi modeli gibi diğer yerleşik modeller daha yüksek seviyelerde prokoagülan bileşikler gerektirir. Sağkalımı son nokta olarak kullanmaktan kaçınmak için, tüm deney boyunca kan kaybını ve kanama süresini son nokta ve tam anestezi olarak belirleyen bir TVT modeli geliştirdik. Kısaca, anestezi uygulanan fareler, ılıman saline (37 ° C) batırılmış kuyruk ile yerleştirilir ve sağ lateral kuyruk damarındaki test bileşiği ile dozlanır. 5 dakika sonra, sol lateral kuyruk damarı bir şablon kılavuzu kullanılarak transekte edilir, kuyruk saline geri döndürülür ve kan toplanırken tüm kanama bölümleri izlenir ve 40 dakika boyunca kaydedilir. Yaralanma sonrası 10 dakika, 20 dakika veya 30 dakika kanama meydana gelmezse, kesiği ıslak bir gazlı bezle iki kez silerek pıhtıya hafifçe meydan okunur. 40 dakika sonra, kan kaybı, saline kanan hemoglobin miktarı ile ölçülür. Bu hızlı ve nispeten basit prosedür, tutarlı ve tekrarlanabilir kanamalarla sonuçlanır. TVT sağkalım modeline kıyasla, farmakolojik müdahaleye duyarlılıktan ödün vermeden daha insancıl bir prosedür kullanır. Ayrıca, her iki cinsiyeti de kullanmak, yetiştirilmesi gereken toplam hayvan sayısını azaltarak, 3R'lerin ilkelerine bağlı kalarak mümkündür. Kanama modellerinde potansiyel bir sınırlama, hemostazın stokastik doğasıdır ve bu da modelin tekrarlanabilirliğini azaltabilir. Buna karşı koymak için, manuel pıhtı bozulması, izleme sırasında pıhtıya meydan okunmasını sağlar ve primer (trombosit) hemostazın kanamayı durdurmasını önler. Kanama yaralanması modelleri kataloğuna yapılan bu ekleme, prokoagülan etkileri standartlaştırılmış ve insancıl bir şekilde karakterize etme seçeneği sunar.
Introduction
Hayvan modelleri, hemofilinin patogenezini anlamak ve tedavi rejimleri ve terapileri geliştirmek ve test etmek için gereklidir. Faktör VIII nakavt fare (F8-KO), hemofili A 1,2 çalışması için yaygın olarak kullanılan bir modeldir. Bu fareler hastalığın temel özelliklerini özetler ve rekombinant FVIII ürünleri 3,4,5 ve gen terapisi stratejileri 6,7 gibi tedavilerin geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır.
Farklı hemostatik bileşiklerin in vivo farmakolojik etkilerini değerlendirmek için çeşitli kanama hasarı modelleri vardır. Bu pıhtılaşma modellerinden biri, 8,9,10,11,12,13,14 numaralı farelerde kuyruk veni transeksiyonu sağkalım modelidir ve hemofilik farelerin kuyruk transeksiyonu sonrası ekssanguinasyondan kurtulma yeteneğini ölçer. Bu yöntem kırk yıldan fazla bir süre önce15 tanıtıldı ve halakullanılıyor 9,16,17. Bununla birlikte, model hayatta kalmayı bir son nokta olarak kullanır ve hayvanların bilinçli olduğu ve dolayısıyla acı ve sıkıntı yaşayabileceği 24 saate kadar bir süre boyunca hayvanların gözlemlenmesini gerektirir.
Kuyruk klipsi modeli (kuyruk ucu olarak da bilinir) 8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 gibi daha kısa süreli ve tam anestezi altındaki kanama modelleri daha önce tanımlanmıştır. . Bununla birlikte, kanama zorluğundan sonra kan kaybının tamamen normalleşmesi için, bu modeller klinik olarak uygulananlardan çok daha yüksek prokoagülan bileşiklerin (örneğin, FVIII) dozlarını gerektirir29. Anestezi altında farklı bir yaralanma modeli olan vena safena kanama yöntemi, daha düşük dozlarda prokoagülan bileşiklere duyarlıdır30, ancak pıhtıların sık sık bozulması gerektiğinden (sunulan modelde 3 kez aksine) yüksek düzeyde deneyci müdahalesi gerektirir.
Yeni prokoagülan bileşikleri test etmek için ortak bir protokole yönelik standardizasyon, laboratuvarlar arasında veri karşılaştırmasını büyük ölçüde kolaylaştıracaktır31,32,33. TVT modellerinde, çalışılan son noktalar (kan kaybı 7,26, kanama süresi 9,34 ve sağkalım oranı 35,36) konusunda henüz ortak bir anlaşma yoktur ve deneysel uzunluk çalışmalararasında değişmektedir 13.
Birincil hedefimiz, yüksek tekrarlanabilirliğe sahip optimize edilmiş bir modeli, isteğe bağlı çalışma imkanının yanı sıra profilaktik bir tedaviyi, hayatta kalma modeline eşdeğer farmakolojik müdahaleye duyarlılığı, ancak ölümü veya ölüme yakın olanı son nokta olarak kullanmamayı tanımlamak ve karakterize etmektir. Ağrı ve sıkıntıyı azaltmak için hayvanların kanama sırasında bilinçli olmamaları ve daha etik bir son nokta uygulanması gerekmektedir37.
Kuyruk klipsi modelleri genellikle kuyruğun ucunu keserek, örneğin 1-5 mm 18,19,20,21,23,24 amputasyonu veya daha şiddetli bir varyantta, 1-3 mm 8,22,25 civarında bir kuyruk çapında transekte edilen iki varyanttan birinde gerçekleştirilir. . Bu, lateral ve dorsal damarlar ve ventral arter genellikle koptuğu için kombine bir arteriyovenöz kanamaya neden olur ve genel olarak, amputasyon ne kadar büyük olursa, prokoagülan bir bileşiğe duyarlılık o kadar düşük olur. Ayrıca, kuyruk ucu kesildiğinden, arteriyovenöz yaralanma herhangi bir karşıt doku olmadan maruz kalır; Bu nedenle, en azından teoride, en yaygın hemofilik kanamalardan farklıdır.
Adından da anlaşılacağı gibi, bu makalede açıklandığı gibi kuyruk veni transeksiyon modellerinde sadece damar yaralanır, böylece sadece venöz kanama ile sonuçlanır. Damar tamamen kopmadığından, yaralanmanın amputasyon modellerinden daha küçük olması beklenir ve bir pıhtının yapışabileceği kesik çevresindeki doku korunur. Ek olarak, arterin aksine damarda daha düşük kan basıncı vardır. Bu faktörler, amputasyon modellerine göre artan bir duyarlılığa katkıda bulunur, böylece kanamanın normalizasyonu, klinik olarak ilgili replasman tedavisi dozlarıyla, örneğin hemofili A'da rFVIII ile, prokoagülan tedavinin etkilerinin büyüklüğünü ve dayanıklılığını değerlendirmek için yararlıdır 26,38,39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde açıklanan tüm prosedürler Novo Nordisk A/S'deki Hayvan Refahı Kurumu ve Danimarka Hayvan Deneyleri Müfettişliği, Danimarka Gıda, Tarım ve Balıkçılık Bakanlığı tarafından onaylanmıştır. Optimize edilmiş 40 dakikalık yöntem, tasarımda anestezi ve dozlama süresini içerir (Şekil 1). Bu işlem için 10-16 haftalıkken her iki cinsiyetten hemofilik fareler gereklidir.
1. Çalışma öncesi hazırlıklar
- Dozaj çözeltilerini doğru konsantrasyonlarda hazırlayın.
- Su banyosunu başlatın ve 37 ° C'ye ısıtın. Kan alımı için 15 mL santrifüj tüplerini salin (% 0.9 NaCl) ile doldurun.
- 15 mL tuzlu su tüplerini, deneyin başlamasından en az 15 dakika önce ısıtılmış taban plakasındaki deliklere yerleştirin.
- Fareleri tanımlayın ve ağırlıklarını kaydedin. Fareleri gerekenden daha fazla kullanmaktan kaçının, çünkü bu strese neden olabilir ve çalışmayı etkileyebilir.
- Devam etmeden önce iş istasyonunu duman davlumbazında hazırlayın, böylece her şey elinizin altında: peçeteler, kuyruk tutucu, gazlı bez, şırıngalar, neşterler, kronometreler ve kan akışı gösterim kağıdı.
- Kuyruk işaretini ve kesme bloklarını ısıtma plakasına yerleştirin - soğuk bloklar damarların büzülmesini sağlar ve böylece kanamayı etkiler.
2. Anestezi
- İzofluran anestezik prosedürü bir duman davlumbazının içinde uygulayın.
- Gaz buharlaştırıcıyı başlangıçta% 5 izofluran'a 1L / dak akışlı anestezi odasında% 30 O 2/70% N2O olarak ayarlayın. Anestezi odasının dolması için yeterli zaman tanıyın (oda hacmine ve gaz akış hızına bağlı olarak yaklaşık 5 dakika). Hızlı indüksiyon sağlayın (bir dakikadan az).
- Fareleri bilinçlerini kaybedene kadar anestezi odasına yerleştirin.
NOT: Bu, oda yeterince doldurulmuşsa bir dakika veya daha kısa bir süre içinde gerçekleşmelidir. - Pedal refleksine ağrılı yanıt verilmemesi ile uygun anestezi sağlayın (sıkı ayak parmağı sıkışması).
- Fareleri ısıtma plakasına yerleştirin ve burnun burun konisinde olduğundan emin olun.
- Anesteziyi% 30 O 2/% N2 O'da%2 izofluran bakım seviyesine düşürün ve ısı kaybını azaltmak için farelerin üzerine plastik bir örtü yerleştirin. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için uygun bir göz merhemi uygulayın.
- Kuyruk işaret bloğunu kullanarak kuyruğu 2,5 mm çapında işaretleyin. Kuyruğu bloktaki yarığa zorlamayın - sıkıca oturmalıdır (Ek Şekil 1)
- İntravenöz (i.v.) dozlama için en uygun olan ılık bir kuyruk damarı sağlamak için kuyruğu en az 5 dakika boyunca tuzlu su tüpüne yerleştirin.
3. Test çözeltisinin dozlanması
- Bir fareyi kuyruk tutucuya, burnu anestezi maskesi içinde olacak şekilde yerleştirin.
- Hayvanı ilgilenilen bileşikle dozlayın (bu durumda, rFVIII) ve hemen kronometreyi başlatın (t = 0).
- Fareyi, kuyruğu tuzlu su tüpünde olacak şekilde ısıtma plakasına geri yerleştirin. Prosedürü diğer farelerle tekrarlayın.
4. Kuyruk damarı transeksiyonunun yapılması
- Kuyruk damarı transeksiyonunu dozlamadan tam 5 dakika sonra gerçekleştirin. Kuyruğu kesme bloğuna yerleştirin ve damarı açığa çıkarmak için 90° döndürün (Ek Şekil 2).
- Test çözeltisinin dozlandığı karşı tarafta/damarda kesimi gerçekleştirin.
- Kanama oluşturmak için #11 neşter bıçağını kuyruğu tutan kesme bloğunun yarığından çekin. Kronometreyi sıfırlayın ve kuyruğu hemen tuzlu suya geri döndürün.
5. Gözlem süresi ve zorluklar
- Kanamayı gözlemleyin ve 40 dakika boyunca kanamanın başlangıcını ve durmasını açıklayın; kan akışı gösterim kağıdına açıklama ekleyin.
NOT: Kanamanın bu görsel değerlendirmesi, öznellik nedeniyle biraz değişebilir. - Birincil kanama, kesim yapıldıktan sonra 3 dakika içinde durmalıdır. Durum böyle değilse, fareyi diskalifiye edin, ötenazi yapın ve değiştirin (birincil kanamanın durdurulmaması, vWF KO farelerinde olduğu gibi çok ciddi bir yaralanmaya veya primer hemostaz eksikliğine işaret edebilir).
- Yaralanma sonrası 10 dakika, 20 dakika ve 30 dakika kanama olmazsa, 4-5. adımlarda açıklandığı gibi kuyruk kesimine meydan okuyun.
- Su banyosunda tutulan ayrı bir tüpten ılık saline batırılmış bir gazlı bez kullanın. Kuyruğu salinden çıkarın ve ıslak gazlı bezle kuyruk kesimi üzerinde distal yönde iki kez yumuşak bir şekilde silin.
- Her meydan okumadan sonra, kuyruğu hemen tekrar tuzlu su tüpüne batırın.
- T = 40 dakikada, kuyruğu tuzlu su tüpünden çıkararak kan alımını durdurun.
6. Kan örneklemesi
- t = 40 dakika sonra, supraorbital venden kan örnekleri alın.
7. Ötenazi
- Fareleri hala tam anestezi altındayken servikal çıkık ile ötenazileştirin.
8. Numunelerin işlenmesi
- 15 mL kan toplama tüplerini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 4000 x g'de salin ile santrifüj edin.
- Süpernatantı 15 mL tüplerden atın, peleti 2-14 mL eritrositler (RBC) lize çözeltisi içinde yeniden askıya alın ve daha sonra açık bir kahve rengine ulaşana kadar seyreltin.
- Toplam hacme dikkat edin (kan hacmi + tüp üzerindeki mezuniyet işaretleri kullanılarak eklenen eritrositlerin hacmi (RBC) lize çözeltisi).
- Seyreltmenin 2 mL'sini bir hemoglobin tüpüne aktarın ve hemoglobin analizine kadar soğutun.
- Salin içindeki hemoglobin konsantrasyonunu ölçerek kan kaybını belirleyin. Bir mikroplaka okuyucuda 550 nm'de absorbansı ölçün (Malzeme Tablosu).
- İnsan hemoglobininden (Malzeme Tablosu) hazırlanan standart bir eğri kullanarak absorbansı nmol hemoglobine dönüştürün ve RBC lizing çözeltisi ile seyreltme için düzeltin.
9. İstatistiksel analizler
- Uygun yazılımı kullanarak verileri analiz edin. Burada GraphPad Prism yazılımı kullanılmıştır. Bir dizi çalışmada, aşağıdaki istatistiksel yöntemlerin iyi performans gösterdiği bulunmuştur.
NOT: Kan kaybını, kanama süresini, maruziyeti, trombosit sayılarını ve hematokriti analiz etmek için; Brown-Forsythe ve Welch ANOVA testi kullanıldı (veriler sürekli olduğu ancak artıkların varyans homojenliği olmadığı için), çoklu karşılaştırmalara uyum sağlamak için Dunnett testi uygulandı. Kanama süresi, kan kaybı ve dozlar arasındaki korelasyonları test etmek için bir Pearson testi kullanıldı. ED50 değerlerini belirlemek için, kanama ve kan kaybı verilerine dört parametreli bir ters log (doz) yanıt denklemi yerleştirildi. Cinsiyet etkisini analiz etmek için, çoklu karşılaştırmalara uyum sağlamak için Bonferroni düzeltmesi uygulayan iki yönlü bir ANOVA testi kullanılmıştır. Anlamlılık düzeyi P < 0.05 olarak tanımlanmıştır. Veriler SEM'± araçlar olarak görüntülenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optimize edilmiş modelin uygulanabilirliğini değerlendirmek için, ticari olarak temin edilebilen bir rekombinant faktör VIII replasman tedavisi (rFVIII) ile uygulanan F8-KO (C57BL genetik arka plan) farelerinde bir çalışma yapılmıştır; dört farklı doz test edildi: 1 IU / kg, 5 IU / kg, 10 IU / kg ve 20 IU / kg. Ayrıca, modeldeki yanıt aralığını değerlendirmek için pozitif kontrol grubu olarak C57BL fareleri kullanarak F8-KO farelerde ve vahşi tip (WT) grubunda karşılık gelen araç (negatif) kontrolünü test ettik.
Optimize edilmiş protokolü takiben, rFVIII tedavi grupları için araç grubuna kıyasla kan kaybında anlamlı bir azalma oldu. Ayrıca 5 IU/kg, 10 IU/kg ve 20 IU/kg tedavi gruplarında araç grubuna göre kanama süresinde azalma gözlenmiştir (Şekil 2). WT farelerinde, toplam kan kaybı 201.8-841.9 nmol Hgb (% 95 CI) arasında ve araç farelerinde 5335 ila 7148 nmol Hgb (% 95 CI) arasında değişmiştir. 1000 nmol Hgb ~ 125 μL tam kanın yaklaşık eşdeğerliğini takiben, araçla tedavi edilen farelerde ortalama kanama 780.25 μL iken, 20 IU / kg grubunda 89.95 μL idi. Böylece, 20 IU / kg'lık bir doz kanamayı tamamen normalleştirdi ve 10 IU / kg'lık bir uygulama, kan kaybını WT aralığının üst sınırına kadar azaltarak önemli bir etkiye neden oldu (Şekil 3). WT farelerinin kanama süresi 0.98-9.16 dakika (% 95 CI) arasında değişmekte olup, 10 IU / kg ve 20 IU / kg'lık doz seviyeleri kanama süresini bu aralığa düşürmüştür. Kombine verilerde kan kaybı ile kanama süresi arasında güçlü bir korelasyon gözlendi (r = 0.9357, P < 0.0001) (Şekil 4).
Modelin duyarlılığını değerlendirmek için, kan kaybı ve kanama süresi gözlemlerine dört parametreli bir ters log (doz) yanıt denklemi eklenmiş ve rFVIII uygulamasının kan kaybı ve kanama süresi üzerinde doza bağımlı açık bir etkisi gözlenmiştir (Şekil 3). Kan kaybı ve kanama süresi için tahmini ED 50 değerleri sırasıyla 2.41 ± 1.69 IU / kg ve2.55 ± 2.80 IU / kg idi.
Modelde kanamanın nasıl oluştuğunu göstermek için, kaydedilen tüm kanama bölümleri, her bir fare tarafından kanama uzunluğunun ve sayısının görselleştirilmesini sağlamak üzere çizilmiştir (Şekil 5). Primer kanama tüm gruplarda çok benzerdir. Hemofilik araç grubunun çoğu, 20 dakikada ikinci meydan okumadan önce yeniden kanamaya başlar ve bu hayvanların yaklaşık yarısı için kanama ilk meydan okumadan sonra durmaz. Son olarak, açıklandığı gibi, rFVIII tedavisi, tedavi edilen F8-KO farelerde kanama ataklarının uzunluğunu araca kıyasla azalttı ve en düşük dozda zaten gözlemlenebilir bir değişiklik oldu. En yüksek doz seviyelerinde, farelerin çoğu sadece meydan okunduktan sonra kısa bir süre kanadı.
Plazma rFVIII konsantrasyonu, kan kaybını ve kanama süresini azaltmada gözlenen etkinin konsantrasyona bağlı olduğunu doğrulamak için hFVIII ve analogları tespit eden Luminescent oksijen kanal testi (LOCI) ile ölçüldü (Şekil 6). Her grupta değişkenlik vardır (ortalama CV% 46), ancak yine de, gruplar arasında önemli farklılıklar gözlenebilir, böylece kan kaybı ve kanama süresinde gözlenen etkinin FVIII'nin plazma konsantrasyonuna bağlı olduğunu doğrular. Araçla tedavi edilen tüm fareler, tahlil için alt kantitasyon sınırının (2 U / L) altında ölçülür ve bu değerle temsil edilir. WT fareleri ölçülmemiştir, çünkü uygulanan FVIII testi insan FVIII'sini tespit etmek için spesifiktir.
Kanama sonrası toplanan kan örnekleri kullanılarak tüm gruplar için trombosit sayıları ve hematokrit belirlendi (Şekil 7 ve hematolojik analizör ile ölçüldü (Tablo Materyalleri). Trombosit sayımlarında gruplar arasında herhangi bir değişiklik yoktu, bu da trombosit sayılarının etkilenmediğini ve bu nedenle farelerin primer hemostaz yeteneğine sahip olduğunu gösteriyordu. Hematokrit ölçümleri için, orta ve daha yüksek FVIII dozları (5 IU / kg, 10 IU / kg ve 20 IU / kg) alan hayvanlarda normal seviyeler gözlenirken, araçta ve 1 IU / kg ile tedavi edilen gruplarda (WT hayvanlarına kıyasla) anlamlı derecede daha düşük seviyeler gözlenmiştir. Bu, ağır kanamadan sonra hemofilik hayvanlarda sık görülen bir gözlemdir.
Klasik olarak, hayvan çalışmalarında sadece bir hayvan cinsiyeti (tipik olarak erkek) kullanılmıştır ve bu aynı zamanda TVT hayatta kalma modelleri 8,9,11,12 için de tanımlanmıştır. Gelecekteki çalışmalarda (üreme ve çalışma için) ihtiyaç duyulan toplam hemofilik fare sayısını azaltmaya çalışarak, her iki cinsiyet de kullanılmıştır. Bu optimize edilmiş modelde cinsiyetin etkisini değerlendirmek için (Şekil 8), hem kan kaybı hem de kanama süresi sonuçları, faktörler olarak cinsiyet ve doz ile iki yönlü ANOVA analizine tabi tutulmuştur. Bu analizde, rFVIII dozunun etkisi istatistiksel olarak anlamlıydı (P < 0.0001), ancak fare cinsiyeti sonuçları anlamlı olarak etkilemedi (P 0.35) ve parametreler arasında anlamlı bir etkileşim bulunamadı, bu da tedaviye verilen yanıtların cinsiyetler arasında farklılık göstermediğini gösterdi.
Resim 1: Deney düzeneğinin zamansal tasarımı. Kuyruk damarı transeksiyonundan (TVT) önceki aşama anestezi indüksiyonunu, kuyruğun salin içinde ısıtılmasını ve dozlamayı içerir. TVT yaralanmasından sonra, anestezi altında kanamanın 40 dakika izlenmesi, her 10 dakikada bir sonraki zorluklarla birlikte gerçekleştirilir. Deneysel prosedür, kan örneklerinin toplanması ve ötenazi ile sonuçlandırılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İntravenöz uygulamadan sonra rFVIII'nin etkisi. F8-KO farelerin toplam kan kaybı (sol panel) ve toplam kanama süresi (sağ panel). Her fare ayrı gözlemler olarak gösterilir ve SEM'± ortalamadır. rFVIII'nin farklı test dozları x ekseninde temsil edilir. Veriler, Brown-Forsythe ve Welch ANOVA tarafından Dunnett'in testini çoklu karşılaştırmalara uyum sağlamak için uygulayarak analiz edildi. P < 0.0001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kan kaybı ve kanama süresi için doz-yanıt eğrileri. Kan kaybı (sol panel) ve kanama süresi (sağ panel). Gri alan, işlenmemiş 6 vahşi tip C57BL/6 farenin değerlerinden %95 CI'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kan kaybı ve kanama süresi için korelasyon grafiği. R2 = 0,8755, P < 0,0001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Vahşi tip, araç, 1 IU / kg, 5 IU / kg, 10 IU / kg ve 20 IU / kg rFVIII ile tedavi edilen farelerde bireysel kanama profilleri. Her çizgi tek bir farenin kanama profilini temsil ederken, her noktalı çubuk bir kanama bölümünü temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: rFVIII'e maruz kalma. Plazmadaki FVIII konsantrasyonu, insan FVIII'sinin tespiti için bir Lüminesan oksijen kanal testi (LOCI) ile ölçüldü. Araç fareleri alt kantitasyon sınırının (LLOQ) altındaydı ve bu nedenle LLOQ değeri (2 U / L) ile çizildi. Uygulanan FVIII testi, insan FVIII'sini tespit etmek için spesifik olduğu için WT hayvanları ölçülmemiştir. rFVIII ve WT kontrolünün farklı test dozları x ekseninde temsil edilir. ** P 0,01, *** P 0,001 < ve **** P 0,0001 < <. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Hematolojik veriler. F8-KO farelerin trombosit sayısı (sol panel) ve hematokrit (sağ panel), SEM ile ortalama bireysel gözlemler olarak gösterilmiştir. rFVIII ve WT kontrolünün farklı test dozları x ekseninde temsil edilir. Veriler, Brown-Forsythe ve Welch ANOVA tarafından Dunnett'in testini çoklu karşılaştırmalara uyum sağlamak için uygulayarak analiz edildi. ** P 0,01 < ve *** P 0,001 <. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8. Cinsiyetin etkisi. Tedaviye göre sınıflandırılan kan kaybı (sol panel) ve kanama süresi (sağ panel) ortalama ± SEM ile bireysel gözlemler olarak gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| ED50 kanama süresi (IU/kg) | ED50 kan kaybı (IU/kg) | ED50 sağkalım (IU/kg) | ||
| Anestezi altındaki modeller | Optimize edilmiş kuyruk damarı transeksiyon modeli | 2.6 ± 2.8 | 2.4 ± 1.7 | alakalı değil |
| Vena safen model30 | 8.1 ± 2.2 | 5.1 ± 2.1 | alakalı değil | |
| Orta kuyruk klipsi (L=3mm)27 | bildirilmedi | 4.6 ± 0.5 | alakalı değil | |
| Orta kuyruk klipsi (L=4mm)28 | 39 | 28 | alakalı değil | |
| Orta kuyruk klipsi (L=4mm)20 | bildirilmedi | 53 | alakalı değil | |
| Hayatta kalma modelleri | Kuyruk veni transeksiyonu sağkalım modeli36 | bildirilmedi | bildirilmedi | 58 |
| Kuyruk veni transeksiyonu sağkalım modeli10 | bildirilmedi | bildirilmedi | 21 |
Tablo 1: ED50 değerleri. Farelerde hemofili çalışmaları için mevcut farklı kanama modellerinin ED50 değerlerinin karşılaştırılması. Veriler, atıf yapılan makalelerden [referans üst simgesi] çıkarılır ve ED50 (IU / kg) olarak sunulur
Ek Şekil 1: Ölçüm şablonu. Alüminyumdan üretilmiştir. Boyut özellikleri: 20 mm x 40 mm x 10 mm (U x G x Y). Oluk: 2,5 mm derinlik ve 2,5 mm genişlik; yarıçapı 1.25 mm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: Kesme şablonu. Paslanmaz çelikten üretilmiştir. Boyut özellikleri: 20 mm x 40 mm x 10 mm (U x G x Y). Oluk: 3 mm derinlik ve 3 mm genişlik; yarıçapı 1,5 mm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu optimize edilmiş kuyruk veni transeksiyonu (TVT) yöntemi, TVT sağkalım yöntemine kıyasla birçok avantaja sahiptir. Hayvanlar, tüm çalışma süresi boyunca tamamen anestezi altına alınır, bu da fare kullanımını kolaylaştırır ve hayvan refahını arttırır. Ayrıca, TVT hayatta kalma modelinin aksine, gece boyunca gözlem gerekli değildir ve bu optimize edilmiş model, kan kaybını ölçme ve 40 dakika boyunca tam kanama süresini gözlemleme imkanı sunar. Ayrıca, bilinçli hayvanlarda daha uzun kanama süreleri, ekssanguinasyon yoluyla ölüme neden olabilir, bu da hayvanlarda ağrı ve sıkıntıya ve muhtemelen strese yol açarak, potansiyel olarak varyasyonun artmasına neden olabilir14. Kan kaybı ve kanama süresi, ölüm veya ölüme yakın zamanın yerini alan son noktalar olarak başarıyla karakterize edilmiş ve doğrulanmıştır. Gerçek kuyruk yaralanması iyi tanımlanmış ve standartlaştırılmıştır, çünkü TVT'yi gerçekleştirmek için bir kesme bloğu kılavuzu kullanır, tekrarlanabilir bir kesimi güvence altına alır, prosedürün zorluğunu ve teknik değişkenliği azaltır. Bu nedenle, ihtiyaç duyulan hayvan sayısını azaltarak daha yüksek model sağlamlığı elde edilebilir. Ayrıca, veriler hem erkek hem de dişi farelerin kullanılmasının mümkün olduğunu, böylece 3R ilkelerine uygun olarak yetiştirilecek toplam hayvan sayısının azaltıldığını göstermiştir. Bu gözlemlerle birlikte, dişi farelerin biraz daha az kanama eğilimi vardır ve yüksek kanamalı gruplarda biraz daha fazla değişir, ancak düşük kanamalı gruplarda değildir. Daha düşük kan kaybı önlemleri, daha küçük bir boyuta sahip kadınlarla ve dolayısıyla aynı yaşlı erkeklere kıyasla daha az kan hacmine sahip olmakla ilişkili olabilir.
Hemofilik hastalarda spontan kanamalar genellikle içseldir, özellikle kas-iskelet sistemi, yumuşak doku ve mukokutanöz kanamayı içerirken, dış yaralanmalar (küçük kesikler gibi) uzun süreli kanamaların en yaygın nedeni değildir, ancak daha şiddetli kesikler ve travma hayatı tehdit edici olabilir40,41. Bu optimize edilmiş model sadece venöz kanamayı indüklerken, kuyruk klipsi gibi diğer modeller arteriyo-venöz kanamanın bir karışımını indükler. Tarif edilen model sadece venöz bir model olduğundan, bu TVT modelindeki prokoagülan doz etkisi, daha ciddi bir arteriyel yaralanmadaki etkiyi yansıtmayabilir; Bu nedenle, bu tür kanamalar odakta ise diğer kanama modelleri kullanılmalıdır.
Bireysel kanama profilinin gösterdiği gibi, primer kanama, primer hemostazın, yani aktif trombositlerin agregasyonunun, hemofili A ayarı42'de sağlam olduğunu gösteren tüm gruplarda çok benzerdir. İmmobilize bir yaralanmada, şiddetli hemofili altında bile, trombosit agregasyonu kanamayı hafifletmek için yeterli olabilir. Bu nedenle, ampirik çalışmalar yoluyla, her 10 dakikada bir kanama zorluğuna neden olmanın, fibrin üretimi olmadan bile kanamayı önleyecek kadar güçlü olabilen aktif trombositlerin agregalarını bozmak için protokolde gerekli bir adım olduğunu bulduk. fonksiyonel pıhtılaşma. Tamamen anestezi uygulanmış fareler hareket etmediğinden ve anestezi yapılmamış TVT sağkalım modelinde olduğu gibi yaralanmaya fiziksel olarak meydan okuyamadığından, trombosit agregasyonunun tek başına kanamayı zayıflatmasını önlemek için meydan okuma adımlarını tanıtmak gerekiyordu. Bazı tedavi edilmemiş hemofilik fareler, meydan okumadan önce kendiliğinden yeniden kanar, ancak ilk meydan okumadan sonra, tedavi edilmeyen hemofilik farelerin çoğunda kendiliğinden yeniden kanamalar meydana gelir ve ikinci meydan okumadan sonra, birçoğu deneyin sonuna kadar sürekli olarak kanar. Beklendiği gibi, WT farelere kıyasla araç F8-KO farelerinde kanama artışı oldu. Artan dozlarda rFVIII ile tedavi edilen fareler, hem kan kaybında hem de kanama süresinde doza bağlı bir azalma göstermiştir. Kanama üzerinde anlamlı etki, 5 IU / kg ve üzeri dozlarda gözlenmiştir (araçla tedavi edilen farelerle karşılaştırıldığında). En yüksek iki doz, kanamayı vahşi tip kanama yanıtına oldukça yakın seviyelere indirgeyerek kanamanın normalleşmesini veya normalleşmesine yakın olduğunu gösterir.
Tablo 1'de, çalışılan son noktalara göre sınıflandırılmış çeşitli kanama modelleri için farklı ED50 değerlerinin bir karşılaştırmasını sunuyoruz. Bu optimize edilmiş modelde, kan kaybı ve kanama süresi için karşılaştırılabilir ED50 değerlerini gözlemledik (sırasıyla 2.4 ± 1.7 IU / kg ve 2.6 ± 2.8 IU / kg). rFVIIa'yı inceleyen aynı modeli kullanarak, kan kaybı ve kanama süresi için ED50 değerleri sırasıyla 0.42 mg / kg ve 0.39 mg / kgidi 38. Bu, kuyruk klipsi modeli gibi anestezi altında daha önce tarif edilen kanama modellerinden daha fazla farmakolojik müdahaleye karşı daha büyük bir duyarlılıktır, FVIII ED 50 ile 4.6 ± 0.5 IU / kg27, 28 IU / kg28 ve 53 IU / kg20 kan kaybı için. Ayrıca, farklı kuyruk klipsi modelleri 20,27,28'de ED50 değerlerinde yüksek değişkenlik vardır. Anestezi altındaki bir diğer model ise şiddetli kuyruk klipsi modelidir. Gözlem süresi sadece 20 dakika olduğu için daha hızlı bir yöntemdir, ancak prokoagülan aktiviteye karşı daha az hassastır. 200 IU / kg FVIII'den daha yüksek dozlar, araçla tedavi edilen hayvanlara kıyasla kan kaybında istatistiksel olarak anlamlı bir azalma sağlamak için gerekliydi25. Vena safen model 30'da, kanama süresi için ED 50 değeri 8.1 ± 2.2 IU / kg ve ortalama kan kaybı için ED50, her iki parametre açısından da rafine edilmiş modelimizden daha az duyarlı olan 5.1 ± 2.1 IU / kg idi. Ayrıca, bu model, damar yaralanmasını gerçekleştirmek için hassas bir çalışma ve tekrarlanabilir bir şekilde gerçekleştirilmediği takdirde sonucu etkileyebilecek çoklu tekrarlanan müdahaleler gerektirir.
Geleneksel TVT sağkalım modelinde, sağkalım, dozlamadan sonra 24 saatlik bir süre boyunca değerlendirilir ve bu süre zarfında kanama veya yeniden kanama herhangi bir zamanda meydana gelebilir. Bu nedenle, TVT sağkalım modelindeki etkinlik, tedavinin prokoagülan etkisinin 24 saatlik gözlem süresinin en azından çoğunluğu boyunca devam etmesini gerektirir. Burada sunulan yöntemde, dozlamadan 5 dakika ila 40 dakika sonra akut etkileri değerlendiriyoruz; Bu nedenle, gözlem periyodunun ikinci bölümünde hemostatik kapsama alanını korumak için sağkalım modellerinde daha yüksek dozlara ihtiyaç duyulacağından, ED50 değerlerinin doğrudan bir karşılaştırmasını yapmak zordur. Bununla birlikte, istenirse, optimize edilmiş TVT modeli, dozlama ve kanama prosedürü arasında bir gecikme getirerek hemostatik kapsama süresini değerlendirmek için kullanılabilir. Bu, optimize edilmiş TVT modelimizin önceki bir sürümü için açıklanmıştır; dozlamadan 24 saat sonra TVT'nin gerçekleştirilmesi, değiştirilmemiş rFVIII26 için kabaca10-15 IU / kg'lık bir ED 50 ile sonuçlanmıştır. Tablo 1'de belirtildiği gibi, son nokta olarak 24 saatlik sağkalıma sahip kuyruk transeksiyonu modellerinde, 21 IU / kg 9 ED50 ve rFVIII 58 IU / kg36 değerleri bildirilmiştir. Benzer şekilde, kuyruk klipsi sağkalım modelleri8 de akut muadillerinden daha yüksek prokoagülan dozlar gerektirir.
Perspektifte, bazıları şu anda pazarlanan birkaç farklı pıhtılaşma faktörü (FVIII, FVIIa, FIX) ve türevleri, farklı hemofilik fare suşları 26,38,43,44,45,46,47 kullanılarak optimize edilmiş modelle değerlendirilmiştir. Ayrıca, modeli, ilk meydan okumadan hemen önce, transeksiyondan sonra dozlayarak isteğe bağlı müdahalelerin çalışmasına uyarlayabildik. Ayrıca, bu modeli, prokoagülan aktiviteye sahip bispesifik antikorları değerlendirmek için başarıyla kullandık (Østergaard ve ark., Kan'da yayınlanmak üzere kabul edildi), insan FIX ve insan FX'ini dozlayarak türlerin çapraz reaktivite zorluklarının üstesinden geldik. Bu, trombosit hedefli stratejiler gibi hemofili alanında yeni ilaçların geliştirilmesinde modelin çok yönlülüğünü ve translasyonel değerini göstermektedir48. AAV tabanlı veya genom düzenleme stratejileri, farelerde farmakolojik olarak aktif olan bir vekil olduğu durumlarda da değerlendirilebilir. Bu nedenle, bu optimize edilmiş TVT kanama modeli, kuyruk veni transeksiyonu ve kuyruk klipsi sağkalım modellerine bir alternatifin yanı sıra anestezi altındaki diğer kanama modellerine de değerli bir alternatiftir. Bu model, hayatta kalma modeline kıyasla daha insancıl ve hayvanlar acı ve ıstırap yaşamadıkları için bir İyileştirme örneğidir. Bizim görüşümüze göre, klinik olarak ilgili doz seviyelerine duyarlılık, göreceli teknik basitlik ve son nokta olarak ölümden / ölüme yakın ölümden kaçınma önemli avantajlardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, bu araştırmanın yapıldığı sırada Novo Nordisk A/S'nin çalışanları ve/veya hissedarlarıdır.
Acknowledgments
Esther Bloem ve Thomas Nygaard, plazmadaki FVIII ölçümleri ile destek için kabul edildi. Bo Alsted, şablonu ve kesme bloklarını çizmek ve işlemek için kabul edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 Scalpel blade | Swann-Morton | 503 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One, Austria | 188271 | |
| 30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing | BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe | 320830 | |
| Advate | Takeda, Japan | Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII) | |
| Alcohol pads 70% ethanol | Hartmann, Soft-Zellin | 999 979 | |
| Centrifuge | Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech | ||
| Cutting template (Stainless steel) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm | |
| Erythrocytes (RBC) lysing solution | Lysebio, ABX Diagnostics | 906012 | |
| Gauze | |||
| Haematological analyser | Sysmex | CT-2000iv | |
| Heating lamp on stand | Phillips | IR250 | |
| Heating pad with thermostat | CMA | model 150 | |
| Hemoglobin standards and controls - 8.81 mmol / l batch dependent | HemoCue, Denmark | HemoCue calibrator, 707037 | Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH). |
| Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box | Sigma Delta Dameca | ||
| Isoflurane | Baxter | 26675-46-7 | |
| Magnifier with lights | Eschenbach | ||
| Measuring template (Aluminum) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm | |
| Micropipettes + tips | Finnpipette | ||
| Photometer | Molecular Devices Corporation, CA, USA | SpectraMax 340 photometer | |
| Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | Version 9.0.1 | |
| Saline 0.9% NaCl | Fresenius Kabi, Sweden | 883264 | |
| Special tail marker block for TVT tail cut | |||
| Tail holder | |||
| Vacuum liquid suction | Vacusafe comfort, IBS | ||
| Waterbath and thermostat | TYP 3/8 Julabo |
References
- Bi, L., et al. Targeted disruption of the mouse factor VIII gene produces a model of haemophilia A. Nature Genetics. 10 (1), 119-121 (1995).
- Bi, L., et al. Further characterization of factor VIII-deficient mice created by gene targeting: RNA and protein studies. Blood. 88 (9), 3446-3450 (1996).
- Stennicke, H. R., et al. A novel B-domain O-glycoPEGylated FVIII (N8-GP) demonstrates full efficacy and prolonged effect in hemophilic mice models. Blood. 121 (11), 2108-2116 (2013).
- Shapiro, A. D. Anti-hemophilic factor (recombinant), plasma/albumin-free method (octocog-alpha; ADVATE) in the management of hemophilia A. Vascular Health and Risk Management. 3 (5), 555-565 (2007).
- Recht, M., et al. Clinical evaluation of moroctocog alfa (AF-CC), a new generation of B-domain deleted recombinant factor VIII (BDDrFVIII) for treatment of haemophilia A: demonstration of safety, efficacy, and pharmacokinetic equivalence to full-length recombinant factor VIII. Haemophilia. 15 (4), 869-880 (2009).
- Miao, C. H., et al. CD4+FOXP3+ regulatory T cells confer long-term regulation of factor VIII-specific immune responses in plasmid-mediated gene therapy-treated hemophilia mice. Blood. 114 (19), 4034-4044 (2009).
- Milanov, P., et al. Engineered factor IX variants bypass FVIII and correct hemophilia A phenotype in mice. Blood. 119 (2), 602-611 (2012).
- Dumont, J. A., et al. Prolonged activity of a recombinant factor VIII-Fc fusion protein in hemophilia A mice and dogs. Blood. 119 (13), 3024-3030 (2012).
- Pan, J., et al. Enhanced efficacy of recombinant FVIII in noncovalent complex with PEGylated liposome in hemophilia A mice. Blood. 114 (13), 2802-2811 (2009).
- Liu, T., et al. Improved coagulation in bleeding disorders by Non-Anticoagulant Sulfated Polysaccharides (NASP). Journal of Thrombosis and Haemostasis. 95 (1), 68-76 (2006).
- Brooks, A. R., et al. Glycoengineered factor IX variants with improved pharmacokinetics and subcutaneous efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (9), 1699-1706 (2013).
- Baru, M., et al. Factor VIII efficient and specific non-covalent binding to PEGylated liposomes enables prolongation of its circulation time and haemostatic efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 93 (6), 1061-1068 (2005).
- Molina, E. S., Fujita, A., Sogayar, M. C., Demasi, M. A. A quantitative and humane tail bleeding assay for efficacy evaluation of antihaemophilic factors in haemophilia A mice. Haemophilia. 20 (6), 392-398 (2014).
- Broze, G. J., Yin, Z. F., Lasky, N. A tail vein bleeding time model and delayed bleeding in hemophiliac mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 85 (4), 747-748 (2001).
- Dejana, E., Callioni, A., Quintana, A., de Gaetano, G. Bleeding time in laboratory animals. II - A comparison of different assay conditions in rats. Thrombosis Research. 15 (1-2), 191-197 (1979).
- Girard, T. J., Lasky, N. M., Grunz, K., Broze, G. J. Suppressing protein Z-dependent inhibition of factor Xa improves coagulation in hemophilia A. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (1), 149-156 (2019).
- Zhang, J. P., et al. Curing hemophilia A by NHEJ-mediated ectopic F8 insertion in the mouse. Genome Biology. 20 (1), 276 (2019).
- Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
- Tranholm, M., et al. Improved hemostasis with superactive analogs of factor VIIa in a mouse model of hemophilia A. Blood. 102 (10), 3615-3620 (2003).
- Mei, B., et al. Rational design of a fully active, long-acting PEGylated factor VIII for hemophilia A treatment. Blood. 116 (2), 270-279 (2010).
- Karpf, D. M., et al. Prolonged half-life of glycoPEGylated rFVIIa variants compared to native rFVIIa. Thrombosis Research. 128 (2), 191-195 (2011).
- Ivanciu, L., et al. A zymogen-like factor Xa variant corrects the coagulation defect in hemophilia. Nature Biotechnology. 29 (11), 1028-1033 (2011).
- Ostergaard, H., et al. Prolonged half-life and preserved enzymatic properties of factor IX selectively PEGylated on native N-glycans in the activation peptide. Blood. 118 (8), 2333-2341 (2011).
- Maroney, S. A., et al. Absence of hematopoietic tissue factor pathway inhibitor mitigates bleeding in mice with hemophilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3927-3931 (2012).
- Holmberg, H. L., Lauritzen, B., Tranholm, M., Ezban, M. Faster onset of effect and greater efficacy of NN1731 compared with rFVIIa, aPCC and FVIII in tail bleeding in hemophilic mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (9), 1517-1522 (2009).
- Johansen, P. B., Tranholm, M., Haaning, J., Knudsen, T. Development of a tail vein transection bleeding model in fully anaesthetized haemophilia A mice - characterization of two novel FVIII molecules. Haemophilia. 22 (4), 625-631 (2016).
- Ferrière, S., et al. A hemophilia A mouse model for the in vivo assessment of emicizumab function. Blood. 136 (6), 740-748 (2020).
- Elm, T., et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of a new recombinant FVIII (N8) in haemophilia A mice. Haemophilia. 18 (1), 139-145 (2012).
- Björkman, S. Prophylactic dosing of factor VIII and factor IX from a clinical pharmacokinetic perspective. Haemophilia. 9, Suppl 1 101-108 (2003).
- Pastoft, A. E., et al. A sensitive venous bleeding model in haemophilia A mice: effects of two recombinant FVIII products (N8 and Advate). Haemophilia. 18 (5), 782-788 (2012).
- Saito, M. S., et al. New approaches in tail-bleeding assay in mice: improving an important method for designing new anti-thrombotic agents. International Journal of Experimental Pathology. 97 (3), 285-292 (2016).
- Liu, Y., Jennings, N. L., Dart, A. M., Du, X. J. Standardizing a simpler, more sensitive and accurate tail bleeding assay in mice. World Journal of Experimental Medicine. 2 (2), 30-36 (2012).
- Greene, T. K., et al. Towards a standardization of the murine tail bleeding model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (12), 2820-2822 (2010).
- Cerullo, V., et al. Correction of murine hemophilia A and immunological differences of factor VIII variants delivered by helper-dependent adenoviral vectors. Molecular Therapy. 15 (12), 2080-2087 (2007).
- Shi, Q., et al. Factor VIII ectopically targeted to platelets is therapeutic in hemophilia A with high-titer inhibitory antibodies. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1974-1982 (2006).
- Parker, E. T., Lollar, P. A quantitative measure of the efficacy of factor VIII in hemophilia A mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 89 (3), 480-485 (2003).
- Stokes, W. S. Reducing Unrelieved Pain and Distress in Laboratory Animals Using Humane Endpoints. ILAR Journal. 41 (2), 59-61 (2000).
- Stagaard, R., et al. Abrogating fibrinolysis does not improve bleeding or rFVIIa/rFVIII treatment in a non-mucosal venous injury model in haemophilic rodents. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (7), 1369-1382 (2018).
- Stagaard, R., et al. Absence of functional compensation between coagulation factor VIII and plasminogen in double-knockout mice. Blood Advances. 2 (22), 3126-3136 (2018).
- Bolton-Maggs, P. H., Pasi, K. J.
- Lloyd Jones, M., Wight, J., Paisley, S., Knight, C. Control of bleeding in patients with haemophilia A with inhibitors: a systematic review. Haemophilia. 9 (4), 464-520 (2003).
- Sixma, J. J., vanden Berg, A. The haemostatic plug in haemophilia A: a morphological study of haemostatic plug formation in bleeding time skin wounds of patients with severe haemophilia A. British Journal of Haematology. 58 (4), 741-753 (1984).
- Proulle, V., et al. Recombinant activated factor VII-induced correction of bleeding tendency in genetically engineered von Willebrand disease type 2B mice evaluated using new tail transection bleeding models. International Society on Thrombosis and Haemostasis Congress. , (2017).
- Rode, F., et al. Preclinical pharmacokinetics and biodistribution of subcutaneously administered glycoPEGylated recombinant factor VIII (N8-GP) and development of a human pharmacokinetic prediction model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1141-1152 (2018).
- Holmberg, H., et al. GlycoPEGylated rFVIIa (N7-GP) has a prolonged hemostatic effect in hemophilic mice compared with rFVIIa. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1070-1072 (2011).
- Kawecki, C., et al. Posters Abstracts - Thrombin-mediated Activation of Factor VIII is Insufficient to Produce All Necessary Cofactor Activity in vivo. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3, 1 (2019).
- Johansen, P., et al. In vivo effect of recombinant FVIIA (NOVOSEVEN®) and RFIX in a refined tail vein transection bleeding model in mice with haemophilia A and B: PO147-MON. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13, (2015).
- Enoksson, M., et al. Enhanced potency of recombinant factor VIIa with increased affinity to activated platelets. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (1), 104-113 (2020).
