Summary
İnvaziv hücre alt popülasyonlarını gerçek zamanlı olarak tespit etmek ve yakalamak için bir yaklaşım açıklıyoruz. Deneysel tasarım, hücrelerin elektrik empedansındaki değişiklikleri izleyerek Gerçek Zamanlı Hücresel Analiz kullanır. Kompleks dokulardaki invaziv kanser, immün, endotel veya stromal hücreler yakalanabilir ve ko-kültürlerin etkisi değerlendirilebilir.
Abstract
Kanser hücrelerinin invazyonu ve metastatik yayılımı kanserden ölümün başlıca nedenidir. Kanser hücresi popülasyonlarının invaziv potansiyelini ölçmek için erken geliştirilen testler, tipik olarak, farklı invaziv potansiyele sahip kanser hücresi alt popülasyonları arasında ayrım yapmayan tek bir son nokta ölçümü oluşturur. Ayrıca, tümör mikroçevresi, kanser hücrelerinin invaziv davranışını değiştiren ve bunlara katılan farklı yerleşik stromal ve bağışıklık hücrelerinden oluşur. Dokulara invazyon, bağışıklık hücresi alt popülasyonlarının mikroorganizmaları savuşturmada veya doku yeniden şekillenmesi ve anjiyogenez sırasında parankim ve endotel hücrelerinden hastalıklı hücreleri ortadan kaldırmada da rol oynar. Hücre invazyonunu izlemek için empedans biyosensörlerini kullanan Gerçek Zamanlı Hücresel Analiz (RTCA), invazyonun son nokta ölçümünün ötesinde ileriye doğru atılmış büyük bir adımdı: bu, zaman içinde sürekli ölçümler sağlar ve böylece son nokta analizinde kaybolan istila oranlarındaki farklılıkları ortaya çıkarabilir. Mevcut RTCA teknolojisini kullanarak, stromal ve / veya bağışıklık hücreleri içerebilen ve zaman içinde ko-kültürlü stromal veya bağışıklık hücrelerinden salgılanan faktörlerin etkisi altında invazyon oranını ölçmeye izin veren başka bir oda ekleyerek çift odacıklı dizileri genişlettik. Bunun ötesinde, benzersiz tasarım, odaların herhangi bir zamanda ayrılmasına ve en invaziv kanser hücresinin veya test edilen tümör izolatlarının heterojen karışımlarında bulunan diğer hücre alt popülasyonlarının izole edilmesine izin verir. Bu en invaziv kanser hücreleri ve diğer hücre alt popülasyonları, metastatik hastalığa malign ilerlemeyi tetikler ve moleküler özellikleri, derinlemesine mekanik çalışmalar, tespitleri için tanısal probların geliştirilmesi ve kırılganlıkların değerlendirilmesi için önemlidir. Bu nedenle, küçük veya büyük moleküllü ilaçların dahil edilmesi, invaziv davranışı inhibe etmek (örneğin, kanser hücreleri) veya arttırmak (örneğin, bağışıklık hücreleri) amacıyla kanser ve / veya stromal hücre alt popülasyonlarını hedef alan tedavilerin potansiyelini test etmek için kullanılabilir.
Introduction
Hücre invazyonu, stromal hücreler tarafından sağlanan çevresel ipuçlarına yanıt olarak hücrelerin bazal membran bariyerlerini geçmesini sağlayan önemli bir süreçtir. Lokal lezyonlardan invaziv ve metastatik kanserlere ilerleyebilen immün yanıtlar, yara iyileşmesi, doku onarımı ve maligniteler için gelişimin çeşitli aşamalarında çok önemli bir adımdır1. Hücre popülasyonlarının invaziv potansiyelini ölçmek için erken geliştirilen tahliller tipik olarak tek bir son nokta ölçümü oluşturur veya invaziv hücrelerin önceden etiketlenmesini gerektirir2. Mikroelektronik ve mikroakışkan tekniklerinin entegrasyonu, mikroelektrotlar üzerindeki canlı hücrelerin elektrik empedansını kullanarak hücre biyolojisinin canlılık, hareket ve bağlanma gibi farklı yönlerini tespit etmek için geliştirilmiştir 3,4. Empedans ölçümü, hücre durumunun etiketsiz, invaziv olmayan ve kantitatif bir değerlendirmesine izin verir3. Burada, Abassi ve ark.5 tarafından geliştirilen Gerçek Zamanlı Hücresel Analiz (RTCA) sisteminin tasarımına dayanan üç odacıklı bir dizgeyi tanımlıyoruz. Üç odacıklı dizi, ek analizler veya genişleme için hücresel invazyon ve invaziv hücrelerin geri kazanımı üzerine ko-kültürlü hücrelerin değerlendirilmesine izin verir.
Hücre analizörü sisteminde, hücreler gözenekli bir zar üzerine kaplanmış hücre dışı bir matristen istila eder ve bariyerin karşı tarafına yerleştirilmiş interdijitasyonlu bir elektrot dizisine ulaşır. İnvaziv hücreler zamanla bu elektrot dizisini bağlamaya ve işgal etmeye devam ettikçe, elektriksel empedans paralel olarak değişir. Mevcut sistem, iki odacıklı bir hücre invazyonu ve göçü (CIM) 16 kuyucuklu plakadan oluşmaktadır. RTCA-DP (çift amaçlı) (bundan böyle çift amaçlı hücre analizörü olarak adlandırılacaktır) cihazı, empedans ölçümü için sensörler ve empedans verilerini analiz etmek ve işlemek için entegre yazılım içerir. Başlangıçtaki empedans değerleri, kuyucuklardaki ortamın iyonik gücüne bağlıdır ve hücreler elektrotlara bağlandıkça değişir. Empedans değişiklikleri, hücre sayısına, morfolojilerine ve hücrelerin elektrotlara ne ölçüde bağlandığına bağlıdır. Hücreler eklenmeden önce kuyucukların medya ile ölçülmesi, arka plan sinyali olarak kabul edilir. Arka plan, elektrotlara bağlanan ve yayılan hücrelerle dengeye ulaştıktan sonra empedans ölçümlerinden çıkarılır. Hücre İndeksi (CI) olarak adlandırılan bir elektrot üzerindeki hücrelerin durumunun birimsiz bir parametresi aşağıdaki gibi hesaplanır: CI = (dengeden sonra empedans - hücrelerin yokluğunda empedans) / nominal empedans değeri6. Farklı hücre çizgilerinin geçiş oranları karşılaştırıldığında, Delta CI, ilk birkaç ölçümde temsil edilen bağlanma farkından bağımsız olarak hücre durumunu karşılaştırmak için kullanılabilir.
Yeni tasarlanan üç odacıklı dizi, mevcut tasarıma dayanır ve elektrotları içeren çift amaçlı hücre analizörü sisteminin üst odacığını kullanır. Modifiye edilmiş orta ve alt odalar, entegre yazılım kullanılarak empedans ölçümü ve analizi için montajın çift amaçlı hücre analizörüne sığdırılması için uyarlanmıştır. Yeni tasarımın mevcut çift odacıklı CIM-plakası (bundan böyle hücre analizörü plakası olarak adlandırılacaktır) üzerinde sağladığı iki önemli gelişme şunlardır: i) heterojen hücre karışımlarında bulunan invaziv hücre alt popülasyonlarını kurtarma ve daha sonra analiz etme yeteneği ve ii) ko-kültürlü stromal veya bağışıklık hücrelerinden salgılanan faktörlerin hücre invazyonu üzerindeki etkisini değerlendirme seçeneği (Şekil 1).
Bu teknoloji, farklı invaziv kapasitelere sahip hücrelerin alt popülasyonlarını incelemede yararlı olabilir. Bu, (a) çevre dokuları veya kan ve lenfatik damarları istila eden veya uzak organlardaki metastatik tohumlama bölgelerinde ekstravazasyon yapan invaziv kanser hücrelerini, (b) patojenleri veya hastalıklı hücreleri ele almak için dokuları istila eden bağışıklık sisteminden hücreleri, (c) doku yeniden yapılanması veya yara iyileşmesi sırasında yeni kan damarları oluşturmak için dokuları istila eden endotel hücrelerini, ayrıca (d) kanser hücrelerini destekleyen ve istila eden tümör mikro ortamından stromal hücreler. Bu yaklaşım, hücre motilitesini ve invazyonunu modüle edebilen stromal çapraz konuşmanın dahil edilmesine izin verir. Burada gösterilen fizibilite çalışmaları, kanser hücresi invazyonuna ve kanser hücrelerinden gelen diferansiyel sinyallere yanıt olarak endotel invazyonu da dahil olmak üzere stroma ile etkileşime odaklanan bu modifiye diziyi model bir sistem olarak kullanmaktadır. Yaklaşım, kanser hücrelerini ve bağışıklık hücrelerinin alt popülasyonları, fibroblastlar veya endotel hücreleri gibi diğer hücre tiplerini izole etmek için tahmin edilebilir. İnvaziv ve non-invaziv yerleşmiş meme kanseri hücre hatlarını ilkenin bir kanıtı olarak test ettik. Ayrıca, klinik tanı ortamlarında da gelecekteki kullanım için fizibilite göstermek için insan kemik iliğinden bağışıklık hücrelerine yanıt olarak hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) invazyonundan elde edilen hücreleri kullandık. PDX, orijinal hasta için büyüme, progresyon ve tedavi seçeneklerinin incelenmesine izin vermek için bağışıklık sistemi baskılanmış veya insanlaştırılmış fareler modeline implante edilen hasta tümör dokularıdır 7,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma, Georgetown Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından gözden geçirilmiş ve "muaf" olarak kabul edilmiştir (IRB # 2002-022). Taze hasat edilmiş kemik iliği dokuları, tanımlanmamış olan atılmış sağlıklı insan kemik iliği toplama filtrelerinden toplandı.
1. Yeni oda tasarımı (Şekil 2)
- Yeni bir çift odacıklı hücre analizörü plakası açın. Üst odayı elektrotlarla bir kenara koyun.
- Bir freze makinesi kullanarak, hücre analizörü plakasının U şeklindeki alt kuyucuklarının 2 mm'sini tıraş edin.
- UV küratörlüğünde yapıştırıcı kullanarak tıraşlı kuyucukların dibine 0,2 μm gözenek boyutuna sahip 2 cm x 7 cm polietersülfon (PES) membran takın. Tutkalın tamamen kürlendiğinden ve hareketsiz olduğundan emin olmak için 30 dakika kürasyon süresi bekleyin.
- Bir freze makinesi kullanarak, yeni imal edilen üçüncü odanın sırtlarına yapışmak için yanlar boyunca iki uzunlamasına yarık (1,5 mm x 5,6 mm) kesin.
- Bir freze makinesi kullanarak, hücre analizörü plakasının genel boyutlarını kopyalayan üçüncü bir polikarbonat hazne oluşturun; 72 mm x 18 mm (Malzeme Tablosu).
- Hücre analizörü plakasının 16 delikli tasarımını çoğaltmak için 4,8 mm derinliğinde ve 4,75 mm çapında kuyular oluşturun. Bu, kuyu başına 90 μL hacme izin verir.
- Yanlarda, iki üçgen sırt oluşturun, böylece oda adım 1.4'te oluşturulan orijinal yarıklara kilitlenir. Üçgenin yatay kısmı 1,5 mm, dikey 1,4 mm ve hipotenüs 2,052 mm'dir.
- Kısa tarafta, orijinal plakanın çentiğine sığması için 50,8 mm çapında ve 1,397 mm yüksekliğinde bir düğme oluşturun (Şekil 2, Orta).
- Sızdırmaz bir uyum sağlamak için her bir kuyucuk için 0,9 mm kalınlığında bir kauçuk yıkayıcı kullanın.
2. Hücre kültürü (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-fibroblastlar)
- Yapışkan hücre kültürlerini (~% 70 birleşim) 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
- Hücreleri kaldırmak için% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin.
- Tripsin çözeltisini serum içeren hücre kültürü ortamı ile nötralize edin ve hücre süspansiyonunun bir aliquot'unu kullanarak hücreleri sayın.
NOT: Belirli hücre kültürü ortamı Tablo 1'de bulunabilir.
3. Hasta kaynaklı ksenogreft ayrışması
- Steril bir neşter kullanarak taze bir tümör parçasını (1cm2) ince bir mantara doğrayın.
- 3 mg / mL tripsin ve 2 mg / mL kollajenaz ile desteklenmiş 20 mL DMEM F12 ortamı içeren 50 mL'lik bir konik tüpe yerleştirin.
- 20 dakika boyunca 37 °C'de bir termal çalkalayıcıda (150 RPM) inkübe edin.
- Tüpü 5 dakika boyunca 500 x g'de döndürün; süpernatanı çıkarın.
- Hücreleri yıkamak için 20 μL DMEM F12 +% 2 FBS ekleyin; 5 dakika boyunca 300 x g'de döndürün ve süpernatanı çıkarın. Yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
- Hücreleri saymak için 1 mL PDX ortamında (Tablo 1) yeniden askıya alın.
4. Kemik iliği hücresi ekstraksiyonu
- Kemik iliği (BM) toplama filtresini 25 mL 1x PBS ile yıkayın.
NOT: Bu çalışmada, filtrede kalan BM'yi toplamak için hastaneden kullanılmış bir BM toplama filtresine PBS eklenmiştir. - Yıkanmış BM'yi, katmanları mümkün olduğunca ayrı tutmaya özen göstererek, 25 mL yoğunluk gradyan ortamına sahip 50 mL'lik bir konik tüpe yavaşça ekleyin.
- 18 °C'de 20 dakika boyunca 800 x g'de döndürün
- Santrifüjlemeden (yağ / plazma) sonra üst katmanları sifonlayın ve BM hücrelerine sahip yoğunluk gradyanı ortamının üzerindeki beyaz tabakanın 5 mL'sini 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
NOT: Alternatif olarak, 5 mL'lik bir pipeti orta katmana (BM) dokunana kadar üst tabakaya batırın ve pipeti hareket ettirmeden orta tabakadan çok yavaş bir şekilde pipet çekin. - 15 mL konik tüpü 1x PBS (~10 mL) ile doldurun ve 15 dakika boyunca 300 x g'de döndürün.
- Süper natantı çıkarın; kalan beyaz pelet BM'dir.
- Pelette kırmızı kan hücreleri gözlenirse, 5 mL RBC lizis çözeltisi (Malzeme Tablosu) ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika bekletin. 5 dakika boyunca 300 x g'de döndürün ve süpernatanı çıkarın.
- Hücreleri yıkamak için 10 mL 1x PBS ekleyin, 5 dakika boyunca 300 x g'de döndürün ve süpernatanı çıkarın. Pelet beyaz olana kadar RBC lizisini (adım 4.7) tekrarlayın.
5. Hücre tohumlama ve montaj
- Üç steril odacığı da doku kültürü başlığına yerleştirin.
- Alt odanın kısa tarafındaki düğmeyi bulun. Alt odayı, düğme deneyciye bakacak şekilde yönlendirin.
- Alt odanın her bir kuyucuğuna 90 μL ortamda 30.000-50.000 hücre ekleyin. Kabarcık oluşturmaktan kaçının. Bunlar, salgılanan faktörleri sağlayacak ancak üst odanın elektrotları tarafından tespit edilmeyecek stromal hücrelerdir.
- Hücre hareketliliği için pozitif bir kontrol olarak iki alt oda kuyusunda% 5 fetal sığır serumu takviyeli ortam kullanın. Negatif kontrol olarak% 0 serum takviyeli ortam kullanın.
- Hücrelerin bulunduğu alt odanın, yerleşmesi için kaputta 10-15 dakika oturmasına izin verin.
NOT: Bu adım, hücreler yapışmışsa veya süspansiyonda büyüyorsa önerilir. - Alt odayı 90°'de döndürün ve orta odayı üste yerleştirin, böylece alt odadaki düğme orta odadaki çentiğin içine kayar.
NOT: Alt bölmedeki düğme ve orta odadaki mavi nokta, düzeneğin zıt uçlarındadır. - Montajın uzun kenarlarının her birinden bir tıklama sesi duyulana kadar dikey olarak aşağı doğru itin.
- Orta odanın tüm kuyularına 160 μL serumsuz ortam ekleyin.
- Kuyular doldurulduktan sonra kubbe şeklinde bir menisküsün görünür olduğundan emin olun; aksi takdirde, pipet kalibrasyonuna bağlı olarak son ses seviyesini ayarlayın. Kabarcık oluşturmaktan kaçının.
- Üst odacığı elektrotlar aşağı bakacak şekilde orta bölmeye yerleştirin ve mavi noktaları orta ve üst bölmelere hizaladığınızdan emin olun.
- Montajın uzun kenarlarının her birinden bir tıklama sesi duyulana kadar dikey olarak aşağı doğru itin.
- Üst odaya 25-50 μL serumsuz ortam ekleyin.
- Düzeneği doku kültürü inkübatöründeki çift amaçlı hücre analizörüne monte edin ve arka planı ölçmeden önce 30 dakika bekleyin.
NOT: Bu süre diziyi dengelemek için gereklidir ve üst bölmeye eklenecek hücre çizgilerini hazırlamak için kullanılabilir. - Arka planı ölçün (bkz. bölüm 6) ve tertibatı tekrar doku kültürü başlığına yerleştirin.
- Üst odanın her bir kuyucuğuna 100 μL serumsuz ortamda 30.000-50.000 hücre ekleyin. Bunlar, elektrotun membrandan başarıyla göç ettikten sonra tespit edeceği hücrelerdir.
NOT: Maksimum yanıt elde etmek için, tahlil yapılmadan önce serumsuz veya düşük serum ortamında 6-18 saat boyunca hücrelerin büyütülmesi önerilir. - Empedans ölçümü için çift amaçlı hücre analizörüne monte etmeden önce tertibatı 30 dakika boyunca kaputta bekletin.
6. Arka plan ve empedans ölçümü
- Diziyi çift amaçlı hücre analizörü cihazındaki beşiğe yerleştirin.
- Hücre analizörü yazılımını açın ve kullanılacak beşiği seçin.
- Mesaj sekmesine tıklayın ve dizinin yuvaya iyi yerleştirildiğinden ve elektrotların sensörlerle iyi hizalandığından emin olmak için Bağlantılar Tamam yazdığından emin olun.
- Deneme Notları sekmesini tıklayın ve deneme hakkında mümkün olduğunca fazla bilgi doldurun.
- Düzen sekmesine tıklayın ve dizi düzeninin açıklamasını doldurun.
- Program sekmesine tıklayın ve Adımlar menüsünden iki adım ekleyin; bir arka plan adımı (bir süpürme) ve 100 süpürme ile bir test adımı - her 15 dakikada bir, toplam 25 saatlik bir süpürme.
- Dizi, 30 dakika boyunca çift amaçlı hücre analizörü inkübatöründe kaldıktan sonra, arka plan ölçümünü başlatmak için Oynat düğmesine tıklayın. Verileri kaydetmek için klasörü seçmenizi isteyen bir pencere açılacaktır.
- Arka plan ölçümü yapıldıktan sonra, diziyi beşikten çıkarın ve hücre kültürü başlığına geri yerleştirin.
- Adım 5.13'te açıklandığı gibi üst odaya hücreler ekleyin ve hücrelerin yerleşmesi için tertibatı doku kültürü davlumbazında 30 dakika tutun.
- Diziyi tekrar çift amaçlı hücre çözümleyicisine yerleştirin ve Bağlantılar Tamam iletisi için İleti sekmesini kontrol edin.
- Empedans ölçümünü başlatmak için Oynat düğmesine tıklayın.
- Sinyalin ilerlemesini izlemek için Grafik sekmesine tıklayın.
- Uç noktaya 25 saatten önce ulaşılırsa, Yürüt açılır menüsünden İptal adımına tıklayın.
- Verileri dışa aktarmak için grafiğe sağ tıklayın, liste biçiminde kopyala'yı seçin ve ardından verileri bir elektronik tabloya yapıştırın.
NOT: Veriler hücre dizini veya delta hücre dizini olarak dışa aktarılabilir. Grafik ve/veya mizanpaj bilgileri dışa aktarma için de seçilebilir.
7. Ayrılma ve hücre toplama
- İlgilenilen durma noktasını (6-18 saat) belirlemek için çift amaçlı hücre analizöründe geçiş oranını gerçek zamanlı olarak izleyin.
NOT: Durma noktası, hücrenin istila hızına ve negatif kontrolden farklı bir istila sinyalinin ne zaman elde edildiğine bağlıdır. - Elde edildikten sonra, tertibatı çift amaçlı hücre analizöründen çıkarın ve doku kültürü davlumbazına yerleştirin.
- Hücreleri ilgilenilen kuyulardan toplamak için uygun sayıda 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü hazırlayın.
- Odalar ayrıldığında sıvı içermesi için tertibatı 10 cm'lik bir kaba yerleştirin.
- Bir tıklama sesi duyulana kadar orta odanın uzun tarafındaki esnek yapışma uçlarını içeri doğru itin.
- Üst odayı sökün ve 10 cm'lik yeni bir kaba çevirin.
- Aynı deneysel durumu (yani hücre tipi, ilaç tedavisi, vb.) barındıran tüm kuyulardan hücreleri toplamak için 13 mm'lik bir bıçağa sahip bir hücre kaldırıcı kullanın.
NOT: Negatif kontrollerden istatistiksel olarak anlamlı bir değişiklik elde etmek için kurulumu her deneysel koşul için en az iki kuyuya sahip olacak şekilde tasarlayın. - Hücreleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde toplamak için bıçağı 1x fosfat tamponlu salin içinde durulayın veya daldırın.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 500 x g'de döndürün.
- Toplanan hücreleri çoğaltın (bakınız bölüm 8) veya tek hücreli RNA-seq gibi uç nokta analizi yapın.
NOT: Toplu RNA-seq için, düşük hücre numaralı RNA ekstraksiyon kiti kullanın.
8.3D hücre yayılımı ve geri alımı
NOT: Toplanan az sayıda hücre nedeniyle, canlılığı artırmak için hücreleri hücre dışı bir matris (ECM) kullanarak 3B olarak tohumlayın. Bununla birlikte, 2D kültür de bu noktada bir seçenektir, özellikle de kullanılan hücreler yerleşik hücre hatlarından geliyorsa.
- Bodrum membran matrisinin bir alikotunu gece boyunca 4 ° C'de çözün. Bodrum membran matrisini kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutun.
- Toplanan canlı hücrelerin peletine 25 μL soğuk bazal membran matrisi ekleyin ve karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipet çekin. Kabarcık oluşturmaktan kaçının.
- Hücre-bazal membran matris karışımını küçük bir doku kültürü kuyusunun dibine (yani 96 delikli bir plakada) ekleyin, bir kubbe oluşturun. Kuyunun duvarlarına dokunmamaya çalışın. Damla yönünde hafifçe 100 μL ortam eklemeden önce 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Hücreleri almak için, ortamı aspire edin ve her bir kuyucuğa 100 μL dispase ekleyin.
- RT'de 10 dakika boyunca inkübe edin, ara sıra yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Hücreleri ve çözünmüş bazal membran matrisini 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 1 mL 1x PBS ekleyin, 5 dakika boyunca 300 x g'de döndürün ve süpernatanı çıkarın. Yıkamayı bir kez tekrarlayın.
- Süper natantı aspire edin. Peletteki hücreleri bölün veya uç nokta analizi yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yeni tasarlanan üç odacıklı dizi kullanılarak, hücrelerin istilası, fibroblastlar gibi stromal hücrelerin varlığında veya yokluğunda test edildi. MDA-MB-231 hücre invazyonu, ışınlanmış İsviçre 3T3 fibroblastları (J2 suşu) alt odaya tohumlandığında artmış ve iki hücre hattı arasındaki faktörlerin değişimine izin vermiştir. İlginç bir şekilde, MDA-MB-231 invazyonu, 3T3-J2 hücrelerinin sayısı iki katına çıkarıldığında artmıştır (Şekil 3A). Öte yandan, MCFDCIS hücrelerinin (DCIS-Δ4)9 invaziv bir klonunun invazyon hızı, 3T3-J2 hücreleri ile çapraz konuşma ile inhibe edilmiş gibi görünmektedir (Şekil 3B). Bu veriler, stromanın, bu durumda fibroblastların, hücre invazyonu üzerindeki değişen etkilerini ölçmek için üç odacıklı dizinin yararlı uygulamasını göstermektedir.
Daha sonra, endotel hücrelerinin motilitesindeki ve invazyonundaki değişimi izlemek için, invaziv (MDA-MB-231)10,11 veya non-invaziv (DCIS)12 kanser hücrelerinden gelen sinyallere yanıt olarak, kan damarlarının duvarlarını kaplayan endotel hücrelerini temsil eden insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler) kullanılmıştır. HUVEC'ler, DCIS hücreleri tarafından salgılananların aksine, MDA-MB-231 hücreleri tarafından salgılanan faktörlere yanıt olarak daha invazivdi (Şekil 4). Bu, invaziv tümörlerin kan damarı oluşumu için endotel hücrelerini işe alma ve daha sonra dolaşıma yayılma yeteneği ile tutarlıdır.
Yukarıdaki veriler, hücre analizörü sisteminin hücre hatlarının farklı istila oranlarını izleme yeteneğini göstermektedir; istila başladığında, ilerler ve platolar. Bu, kullanıcının ilgilendiği zaman noktasını seçmesine izin verir, örneğin, istilanın ilk 2-3 saatinden sonra, istilayı başlatan öncü hücreleri yakalamak ve daha sonra kolektif istila ile istila eden takipçi hücrelerden farklıdır.
Yukarıdaki veriler, bir ortak kültür ortamında istilayı gözlemlemek için üç odacıklı dizinin kullanımı için sağlam bir ilke kanıtı gösterirken, bu dizinin klinik ve tanısal ortamlarda potansiyel kullanılabilirliğini test etmek istedik. Bunun için, insan kemik iliği örneklerinden elde edilen bağışıklık hücreleri ile birlikte kültürlenmiş hasta kaynaklı ksenogreftlerden (PDX)8 hücre süspansiyonlarının invazyonu izlendi. Toplam insan kemik iliği bağışıklık hücreleri (BM), serumlu veya serumsuz olarak alt odaya tohumlandı. Üst odacıktan PDX hücrelerinin invazyonu, ko-kültürlü BM immün hücrelerine yanıt olarak artmıştır (Şekil 5). İlginçtir ki, BM hücreleri ile alt odacıkta% 2 serum varlığı PDX invazyonu için gerekliydi.
Şekil 1: Hücre invazyonu izleme ve hücre toplama sisteminin iş akışı . (A) Stroma hücreleri, yalnızca çözünür faktörler için geçirgen bir hücre bariyeri görevi gören bir orta odaya monte edilen alt odaya eklenir. (B) Empedans biyosensörlerine sahip üst oda, izlenecek hücre hattını alır. Gerçek zamanlı istila, hücre toplama için kullanıcı tanımlı bir zaman noktasına ulaşılana kadar kaydedilir. (C) Sökülmüş üst oda ters çevrilir ve hücreler bir hücre kaldırıcı kullanılarak toplanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Dizi odalarının görüntüleri ve modifikasyonları . (A) Diziyi oluşturmak için kullanılan üç odacık. Elektrotları barındıran üst bölmede herhangi bir değişiklik yapılmadı. (B) Orta hazneli kuyucuklardan, 2 mm'lik bir yükseklik tıraş edilmiş ve açık tabana bir zar bağlanmıştır; her iki tarafa uzunlamasına yarıklar (1.5 mm x 5.6 mm) eklendi. (C) 16 delikli tasarımı çoğaltmak için imal edilmiş alt bölme (72 mm x 18 mm); kuyular 4,8 mm derinliğinde ve 4,75 mm çapında, orta hazne yarıklarına tıklamak için kenarlar boyunca üçgen sırtlar (1,5 mm yatay x 1,4 mm dikey) eklenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ko-kültürlü fibroblastların kanser hücresi invazyonu üzerindeki etkisi . (A) MDA-MB-231 hücre invazyonunun Gerçek Zamanlı Hücresel Analizi, tek başına veya 3T3-J2 fibroblastları (alt odacık) ile ko-kültürde. 3T3-J2 fibroblastları, kuyu başına 30.000 veya 60.000 hücrede tohumlandı. (B) DCIS-Δ4 hücre invazyonunun Gerçek Zamanlı Hücresel Analizi, tek başına veya 3T3-J2 fibroblastları (alt odacık) ile ko-kültürde. Katı daireler ortalamayı temsil eder; ince noktalı çizgiler standart sapmayı temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kanser hücrelerinin endotel hücre invazyonu üzerine etkisi. HUVEC invazyonunun Gerçek Zamanlı Hücresel Analizi, tek başına, invaziv MDA-MB-231 hücreleri (alt odacık) veya invaziv olmayan DCIS hücreleri (alt odacık) ile ortak kültürde. Katı daireler ortalamayı temsil eder; ince noktalı çizgiler standart sapmayı temsil eder. Delta hücre indeksi zamanında empedansa normalleştirildi = 1 saat. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Kemik iliği immün hücreleri ile birlikte kültürlenmiş hasta kaynaklı ksenogreftlerin (PDX) hücre invazyonu. PDX'ten (üst odacık) parçalanan tek hücreler, insan kemik iliği hücreleri (alt odacık) ile birlikte kültürlendi ve invazyonları, serum varlığında veya yokluğunda zamanla izlendi. Katı daireler ortalamayı temsil eder; ince noktalı çizgiler standart sapmayı temsil eder. Delta hücre indeksi zamanında empedansa normalleştirildi = 1 saat ve 36 dk. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Medya | Bileşen | Konsantrasyon/oran |
| MDA-MD-231 ortam | cesaret | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | 10% | |
| J2 Fibroblastlar ortamı | cesaret | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | 10% | |
| DCIS ortamı | DMEM F12 | |
| At serumu (HS) | 5% | |
| Epidermal büyüme faktörü (EGF) | 20 ng/mL | |
| Insülin | 10 μg/mL | |
| Hidrokortizon | 0,5 μg/mL | |
| Kolera toksini | 100 ng/mL | |
| PDX ortamı | DMEM F12 | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | 2% | |
| HEPES | 1 milyon | |
| İnsülin Transferrin Selenyum Etanolamin (ITS) | 10 μg/mL | |
| Hidrokortizon | 0,5 μg/mL | |
| Sığır serum albümini (BSA) | 1 mg/mL |
Tablo 1: Hücre kültürü ortam bileşimi. Tabloda, MDA-MD-231 ortamı, J2 Fibroblasts ortamı, DCIS ortamı ve PDX ortamının bileşimleri listelenmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çift odacıklı bir dizinin tasarımını, stromal hücrelerin varlığında hücre invazyonunu gerçek zamanlı olarak izlemek için üçüncü bir oda içerecek şekilde değiştirdik. Ko-kültürlü fibroblastların invaziv ve non-invaziv kanser hücreleri üzerindeki farklı etkilerini gözlemledik, bu da dizinin ko-kültürlü stromal hücreler tarafından üretilen faktörlere farklı yanıt veren kanser hücresi alt popülasyonları arasında ayrım yapmak için kullanılabileceğini gösteriyor. Dizi ayrıca, değişen invaziv potansiyele sahip kanser hücrelerinin varlığında anjiyojenik bir uyarana doğru filizlenen kan damarları sırasında kritik bir adım olan stromal dokulara endotel hücre invazyonunu izlemek için de kullanıldı. Bu deneyler, dizinin kanser hücresi veya diğer hücre izolasyonu için çok yönlü kullanımını göstermektedir.
Her odaya eklenecek hücre sayısının optimize edilmesi önerilir. Deneyimlerimize ve üreticinin tavsiyesine göre, 30.000-50.000 hücre en uygunudur. Bu dizide iki hücre tipi birlikte kültürlenebildiğinden, bunlardan biri stroma hücrelerinin birincil kültürü olabileceğinden, farklı ortamların canlılığı korumak için kullanılan hücreler üzerindeki etkilerinin izlenmesi önerilmektedir. İzlenecek hücrelerin açlığının replikasyonlar arasındaki değişimi azalttığını bulduk. Serumsuz büyüme koşulları hücrelere zararlı ise, düşük serum ve daha kısa açlık süreleri kullanılabilir. Düşük serum miktarının eklenmesi (%1-%2), alt odadaki stromal hücrelerin (primer hücreler) hayatta kalması için kritik öneme sahip olabilir, ancak veri yorumlaması için uygun kontrol koşullarını (yani, stromal hücreli ve stromal hücresiz %2 serum) içerdiğinden emin olun. İstila oranları düşükse, deneysel koşul başına daha fazla kuyu, aşağı akış analizleri için toplanan canlı hücrelerin sayısını artırabilir. Hasta biyopsilerini analiz ederken, hücre analizörü plakasında test edilmeden önce dokunun tek hücrelere parçalanması çok önemlidir. Hücre canlılığını korumak için parçalanma koşullarını optimize etmek, istila analizini gerçekleştirmeden önce önemli bir adımdır. İlaç tedavisine duyarlılık veya hücre dışı bodrum matriksi (ECM) bileşenlerinin invazyon oranı üzerindeki etkisi gibi invazyonun ek yönlerini incelemek de mümkündür. ECM, mikro çevrenin önemli bir bileşenidir ve hücre invazyonu sırasında önemli bir rol oynadığı bildirilmiştir13. Yayınlanmış birkaç çalışma, çeşitli ECM bileşenleri14,15 ile etkileşimlerini izlemek için invaziv hücreler eklenmeden önce üst odayı kaplamak için ECM'yi kullanmıştır. Üç odacıklı dizi, invaziv ve stroma hücreleri arasındaki ko-kültür etkileşimlerini incelemek için yararlı bir araçtır. Önerilen tasarım, herhangi bir stromal hücre olmadan istilacı hücrelere özgü bir hücre koleksiyonunu garanti ederken, hücreler arasındaki çapraz konuşma farklı hücre tiplerinin fiziksel etkileşimini gerektiriyorsa, bu kurulum optimal olmayabilir. Ek olarak, süspansiyonda büyüyen yapışkan olmayan hücreler burada önerilen yöntemlerde (hurdaya çıkarma) toplanmayabilir, ancak yapışkan olmayan hücreleri içeren demonte odalardaki ortamın yapışkan olmayan hücreleri toplamak için toplanabileceği farklı bir yaklaşım.
Bu dizi, stromal bir bileşenin varlığında hücre invazyonunu izleyen birden fazla araştırma alanı için kullanılabilirken, burada kanser hücresi invazyonuna ve bu yaklaşımın heterojen biyolojik örneklerde bulunan malign kanser hücresi alt popülasyonlarını nasıl ortaya çıkarabileceğine odaklandık. Burada kullanılan üç odacıklı dizinin yeni kapasitesi, invaziv alt popülasyonları giderek daha az invaziv kanser hücreleri içeren heterojen kanser hücresi karışımlarından izole etmek için fonksiyonel bir test sağlar. İnvaziv ve sonuçla ilgili kanser hücresi alt popülasyonlarının analizi, uygun mekanik çalışmalar ve karışık hücre popülasyonunun analizi ile elde edilemeyen veya önyargılı olmayan moleküler içgörüler için gereklidir. Stromalik hücreler için ko-kültür odası, invaziv hastalığa ilerleme sırasında tümör mikro ortamında hücre-hücre çapraz konuşması hakkında fikir verir.
Doku örneklerine, örneğin hastalardan tümör biyopsilerine uygulamaya yönelik bir adım olarak, hasta kaynaklı tümör ksenogreftlerinden (PDX'ler) izole edilen kanser hücrelerini kullandık ve insan kemik iliği hücrelerinin tümör hücrelerinin istilası üzerindeki etkisini test ettik. PDX'lerde bulunan invaziv hücreleri, aşağı akış analizi, yani RNA-seq için toplayabildik. PDX'lerin tahlil edilmesi, hastalardan elde edilen tümör biyopsilerinde kanser hücrelerinin heterojen karışımında bulunan hücre alt popülasyonlarını analiz etmeye yönelik ilk adımdır. Nihai amaç, bu tür tümör biyopsilerini kullanmak ve istila eden ve böylece metastatik yayılma potansiyelleri nedeniyle kötü sonuçlara yol açan kanser hücrelerinin alt popülasyonlarını izole etmek olacaktır. Moleküler özelliklerin tanımlanması ve bu invaziv alt popülasyonların ilaç tedavisine duyarlılığının test edilmesi gelecekteki uygulamalardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Georgetown Üniversitesi, bu makalede açıklanan bazı yaklaşımlarla ilgili bir patent başvurusunda bulundu. G.M.S, A.W, L.D ve M.P, bu başvuruda mucit olarak adlandırılır ve bunu potansiyel bir çıkar çatışması olarak beyan eder.
Acknowledgments
Utah Üniversitesi Huntsman Kanser Enstitüsü'nden Dr. Alana Welms'e hasta kaynaklı ksenogreftleri (HCI-010) bize sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH hibeleri R01CA205632, R21CA226542 ve kısmen Agilent Technologies'den bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
| Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
| Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).
- Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors & Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
- Stylianou, D. C., et al. Effect of single-chain antibody targeting of the ligand-binding domain in the anaplastic lymphoma kinase receptor. Oncogene. 28 (37), 3296-3306 (2009).
- Abassi, Y. A., Wang, X., Xu, X. Real time electronic cell sensing system and applications for cytotoxcity profiling and compound assays. United States Patent. , 20050213374 1-88 (2013).
- Abassi, Y. A., et al. Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays. Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).
- Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Sharif, G. M., et al. An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer. Cancer Research. 81 (16), 4230-4241 (2021).
- Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. V. Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization. In Vitro. 14 (11), 911-915 (1978).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
- Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).
- Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).
- Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).
- Eisenberg, M. C., et al. Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).
