Summary
我们描述了测量细胞牵引力的标准方法的改进,该方法基于微接触印刷,具有软水凝胶上细胞外基质蛋白点阵列的单个减法图案化步骤。这种方法允许更简单,更一致地制造岛状图案,这对于控制细胞簇形状至关重要。
Abstract
微图案牵引显微镜允许控制单个细胞和细胞簇的形状。此外,在微米长度尺度上图案的能力允许使用这些图案化的接触区来测量牵引力,因为每个微图案点允许形成单个焦点粘附,然后使柔软的底层水凝胶变形。这种方法已被用于广泛的细胞类型,包括内皮细胞,平滑肌细胞,成纤维细胞,血小板和上皮细胞。
本综述描述了允许细胞外基质蛋白以预定大小和间距的常规点阵列印刷到聚丙烯酰胺水凝胶上的技术的演变。由于微米级图案很难直接打印到软基板上,因此首先在刚性玻璃盖玻片上生成图案,然后在凝胶化过程中使用图案转移到水凝胶上。首先,描述了在盖玻片上生成小点阵列的原始微接触打印方法。第二步是去除大部分图案以留下小点岛,以控制这些图案点阵列上细胞和细胞簇的形状。
接下来,描述了这种方法的演变,该方法允许使用单个减法图案化步骤生成点岛。这种方法对用户来说大大简化了,但缺点是制造图案所需的母模寿命缩短。最后,描述了为分析位移点图像和随后的细胞产生的牵引场而开发的计算方法,并提供了这些分析包的更新版本。
Introduction
大多数细胞表型对其环境施加牵引力。这些牵引力是由细胞的收缩细胞骨架产生的,这是肌动蛋白和肌球蛋白以及其他丝状生物聚合物和交联蛋白1,2,3,4的网络。细胞内产生的力可以传递到细胞外环境或相邻细胞,主要通过跨膜蛋白如整合素和钙粘蛋白,分别为5,6。细胞如何扩散或收缩 - 以及与这些运动相关的牵引力的大小 - 是与其环境进行密切对话的结果,这在很大程度上取决于细胞外基质中存在的蛋白质的类型和数量(ECM)7,8以及ECM的硬度。事实上,牵引力显微镜已成为了解细胞对局部刺激(如基底刚度,施加的机械应力和应变或与其他细胞接触)的反应的宝贵工具。该信息与癌症和哮喘等疾病的理解直接相关9,10,11,12。
需要一个可用于测量已知材料特性的基板的力诱导变形的系统来计算牵引力。这些变化必须随着时间的推移而跟踪,这需要成像和图像处理技术。用于确定细胞牵引力的首批方法之一是观察和分析接种有细胞的胶原蛋白水凝胶的收缩,尽管这种方法只有半定量13。另一种更精细的方法是通过确定由硅胶薄片14变形引起的力来测量单个电池施加的牵引力。后来,开发了更多的定量测量技术,这些方法还允许使用软水凝胶,如聚丙烯酰胺(PAA)12,15,16。当使用这些软材料时,牵引力可以通过嵌入水凝胶中的随机置换珠的力诱导位移和凝胶16,17的机械性能来确定。另一个进步来自由软聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成的微柱阵列的发展,以便可以使用梁理论18测量其挠度并将其转换为力。
最后,开发了用于微图案化软水凝胶的方法,因为这些方法可以控制细胞粘附的接触区域。通过测量微图案在细胞接触区域内的变形,可以很容易地计算出牵引力,因为不需要无力参考图像19。该方法已被广泛采用,因为它允许将微米大小的离散荧光蛋白粘附点的常规阵列间接图案化到PAA凝胶上,以测量细胞牵引力20。为了计算这些力,已经开发了一种图像处理算法,该算法可以在不需要用户输入的情况下跟踪每个微图案点的运动。
虽然此方法对于创建点图案的整个网格很简单,但是当需要点的孤立补丁(或岛)图案时,它更复杂。当需要控制细胞簇的形状和一定程度的大小时,微图案化岛屿是有用的。为了创建这些岛屿,上述微接触印刷方法需要两个不同的步骤:i)使用一个PDMS图章在盖玻片上创建点的高保真图案,然后ii)使用第二个不同的PDMS图章来去除大部分这些点,留下孤立的点21岛。使用这种原始方法创建岛屿的难度由于在过程的第一步中制作一致的网格模式本身就具有挑战性而变得更加复杂。缩微印刷邮票由一系列圆形微柱组成,其直径对应于所需的点大小。然后将这些印章涂上均匀的蛋白质层,然后在经过处理的盖玻片上施加精确压力,以创建所需的图案。一方面,对印章施加太大的压力会导致蛋白质转移不均匀,并且由于柱子之间的屈曲或下垂导致与玻璃接触,从而导致图案保真度差。另一方面,施加太小的压力会导致蛋白质转移很少或没有,并且图案保真度差。由于这些原因,需要一种传输过程,该过程可用于在短短一步内始终如一地创建孤立的点岛的高质量微图案。
本文描述了一种将微米级荧光蛋白粘附点的岛间接微图案化到PAA凝胶上的方法,该凝胶比以前开发的方法更加一致和通用。虽然较旧的间接微图案化方法依赖于蛋白质图案从PDMS图章转移到中间底物,但这里介绍的方法使用PDMS图章代替蛋白质去除的容器,而不是添加。这是通过首先从根本上改变所使用的PDMS图章的结构来完成的。在这种方法中,邮票不是制作由均匀间隔的圆柱图案组成的邮票,而是由均匀间隔的圆孔图案组成。
有了这个新结构,这些PDMS印章的表面可以用戊二醛处理,如前所述20,29,30,使印章能够与蛋白质共价键合。当用于均匀涂有荧光蛋白的玻璃盖玻片上时,这些经过戊二醛处理的PDMS印章用于去除盖玻片表面上的大部分蛋白质,仅留下由印章上微米大小孔的位置预先确定的所需点图案。此更改提高了生成由近乎连续的点网格组成的模式的成功率,并且只需一步即可创建孤立的点岛。
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Protocol
1. 创建硅胶母带
注意:用于PDMS印章重复成型的硅母版的设计,创建和故障排除的大部分过程已在前面21中介绍过,因此这里将仅介绍这种新方法的关键差异。
- 使用 AutoCAD 或类似设计软件创建光掩模的设计。在光掩模的一侧涂上一层薄薄的玻璃,涂上一层薄薄的铬,以控制紫外线的散射。设计光掩模,使紫外线穿过它照射到所选的光刻胶上,将创建一个有机硅母版,其特征与最终PDMS图章上所需的特征相反。有关此掩码的设计,请参见 图 1 。
注意:所需的特征或它们外部的区域是否应在光掩模上透明,这取决于所选的光刻胶。这里使用的光刻胶是SU-8 2005(注意:易燃,皮肤和眼睛刺激;远离热/火焰/火花,并在处理时使用防护手套和眼镜),一种负光刻胶,能够使5μm高的特征,具有近乎垂直的侧壁。- 通过将负光刻胶暴露在紫外线下并用化学溶剂除去未固化的SU-8来固化负光刻胶。因此,将蒙版的主要特征设计为透明,而蒙版的周围区域是不透明的。
- 对于这种新的去除方法,设计光掩模使其由两个1.5 x 1.5厘米的正方形组成(图1A),一个充满2μm圆的偶数网格,中心到中心间隔6μm,另一个由许多方形岛组成,这些方形岛是相同网格图案的较小,孤立的版本(图1B)。制作以下大小的岛屿:6 x 6 点、12 x 12 点、25 x 25 点和 42 x 42 点。
注意:粘附点(2μm)的直径是根据先前测量细胞牵引力22,23的研究选择的。这里使用的面罩为101.6 x 101.6 mm,一侧涂有0.06μm厚的铬层,由于母版功能小,因此建议使用。这里使用的光掩模是从一家外部光掩模印刷公司委托的。
- 在洁净室中,用光刻胶均匀地涂覆所选的硅片。作为可选步骤,在用抗蚀剂涂覆晶圆之前,先在等离子体中对晶圆进行表面处理。
注:这里使用直径为100 mm的晶圆。在等离子体灰泥中进行处理使晶圆更适合与SU-8结合,并有助于防止SU-8从晶圆上分层。 - 根据光刻胶制造商的说明执行以下步骤:
- 旋转涂层晶圆以创建所需的特征厚度,并根据所需的厚度和光刻胶类型改变旋转时间。对于 5 μm 厚的 SU-8 2005,将推荐的自旋程序分为以下三个步骤:
- 用光刻胶涂覆晶圆,以500 RPM旋转10秒,斜坡为100 RPM / s。
- 通过将晶圆以 3,000 RPM 旋转,以 300 RPM/s 的斜坡旋转 30 s,将光刻胶厚度减小到约 5 μm。
- 旋转后,通过将速度降低到0 RMP,以500 RPM / s的斜坡持续1 s,缓慢减速晶圆。
- 通过在95°C热板上短暂烘烤来准备抗紫外线照射的抗蚀剂。根据所需的光刻胶厚度修改在加热板上花费的时间;对于 5 μm 厚的 SU-8 2005,烘烤时间为 2 分钟。
- 将抗蚀剂暴露在紫外线下,以完全固化所需的特征。要警惕过度曝光,因为这会使SU-8变脆并影响最终母版的整体质量。
- 2005 年,使用 105 mJ/cm2 的 5 μm 厚 SU-8 的曝光能量。根据可用紫外灯的功率,通过将曝光能量除以灯的功率(以mW为单位)来计算曝光时间。
注:由于此处使用的灯的功率为8 mW,因此曝光时间应为13.1 s。
- 2005 年,使用 105 mJ/cm2 的 5 μm 厚 SU-8 的曝光能量。根据可用紫外灯的功率,通过将曝光能量除以灯的功率(以mW为单位)来计算曝光时间。
- 要在开发后设置SU-8功能,请在95°C热板上再次烘烤,这次烘烤3分钟。如果光刻胶正确暴露,请等待在此烘焙步骤中1分钟内出现母版的所需特征。
- 使用SU-8显影剂从硅片中取出未固化的SU-8。去除未固化的SU-8时要彻底,因为它可能会卡在晶圆上的微米级和间隔特征之间。
注意:SU-8显影剂是易燃的皮肤和眼睛刺激物;使其远离热源/火焰/火花,并在处理时使用防护手套和眼镜。 - 开发后,用丙酮冲洗以去除晶圆上多余的显影剂,并用氮气喷枪将其完全干燥。
注意:丙酮是一种易燃的皮肤和眼睛刺激物;使其远离火焰/火花,并在处理时使用防护手套和眼镜。 - 或者,对于SU-8 2005,在200°C热板上烘烤10分钟。
注意:这种硬烘烤增加了光刻胶的机械强度。
- 旋转涂层晶圆以创建所需的特征厚度,并根据所需的厚度和光刻胶类型改变旋转时间。对于 5 μm 厚的 SU-8 2005,将推荐的自旋程序分为以下三个步骤:
- 冷却后,将晶圆放入晶圆载体托盘中,然后将其浇铸在PDMS中。首先,在晶圆上完成硅烷化处理,使硅母体的SU-8特征不太可能与PDMS结合,从而不太可能从晶圆表面去除。
- 要完成硅烷化表面处理,请将主玻璃盖玻片和小玻璃盖玻片放置在仅与硅烷一起使用的干燥器内。将1-2小滴三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷滴到盖玻片上,关闭干燥器,并在4,500 Pa24的压力下真空运行30分钟。
注意:三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷是一种易燃的皮肤和眼睛刺激物;使其远离热源/火焰/火花,处理时使用防护手套和眼镜,并在通风橱下工作。 - 关闭真空,将主液和盖玻片在干燥器中再放置30分钟。
注: 主控设备现在已准备好在 PDMS 中进行转换。
- 要完成硅烷化表面处理,请将主玻璃盖玻片和小玻璃盖玻片放置在仅与硅烷一起使用的干燥器内。将1-2小滴三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷滴到盖玻片上,关闭干燥器,并在4,500 Pa24的压力下真空运行30分钟。
2. 减材微接触印刷
- 根据制造商的说明,以固化剂与碱的正确比例混合PDMS。让它在室温和压力下静置15分钟;然后,在真空下脱气15分钟。
- 将PDMS倒入主控中,并将其放入设置为37°C的培养箱中过夜以固化。
- 从培养箱中取出母版,使其冷却至室温。
- 当主卧冷却时,在乙醇中超声处理25毫米盖玻片10分钟。使用与正在准备的邮票数量一样多的盖玻片。
- 用去离子 (DI) 水彻底冲洗 25 毫米盖玻片,并使用过滤气枪擦干。
- 等离子体在高真空(射频功率为30 W)下使用等离子体清洁器处理盖玻片1分钟。确保在处理后缓慢释放真空,以防止盖玻片在腔内移动。
注:玻璃表面的等离子体处理有两个目的:它清洁玻璃表面以除去污染物,并在玻璃表面产生氧基极性基团以使其疏水25。这种疏水性使玻璃表面更适合蛋白质结合。 - 在没有阳光直射/头顶照明的房间中,用100μL荧光标记的蛋白质溶液涂覆每个盖玻片,浓度至少为100μg/ mL,盖上盖子以提供额外的光保护,让它静置20分钟。
注意:这里使用从人血浆中分离并用AlexaFluor 488染色的纤连蛋白。- 要染色纤连蛋白,将已知浓度和体积的未标记纤连蛋白与1.5 mL管中适量的荧光染料结合。用铝箔覆盖管以保护染料免受光照,并在室温下孵育1小时,通过将管倒置5-10次,每10分钟轻轻混合一次。
注意:所需的染料量因使用的染料和所使用的蛋白质质量而异。请参阅 补充文件 1 ,了解用于确定标有 Alexa 488 的纤连蛋白的适当染料量的计算器。根据制造商的说明,可以使用脱盐柱过滤掉多余的染料(见 材料表)。
- 要染色纤连蛋白,将已知浓度和体积的未标记纤连蛋白与1.5 mL管中适量的荧光染料结合。用铝箔覆盖管以保护染料免受光照,并在室温下孵育1小时,通过将管倒置5-10次,每10分钟轻轻混合一次。
- 用去离子水彻底冲洗每个盖玻片,并通过轻轻敲击每个盖玻片的侧面到纸巾或类似吸水材料上,从表面上去除多余的水分。将盖玻片在黑暗中保持至少30分钟,以使其完全干燥。
- 当蛋白质涂层的盖玻片干燥时,用手术刀或其他锋利的刀片切割,从母版上取下PDMS印章。
注意:最好不要在第一次尝试时尝试切穿PDMS,因为施加如此大的压力会使硅晶片破裂并损坏母片。 - 等离子体在高真空(射频功率为30 W)下处理PDMS印章2分钟。
- 在通风橱内,将邮票放在带盖的容器中,并在每个印章上涂上一层非常薄的 <10%(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(3-APTMS),用100%乙醇稀释。
注意:3-APTMS是一种易燃的皮肤和眼睛刺激物;使其远离火焰/火花,处理时使用防护手套和眼镜,并在通风橱下工作。过量的3-APTMS溶液涂层将导致在此过程中的后期形成橙色薄膜。这种3-APTMS表面处理将胺官能团纳入PDMS印章的表面,这将允许在26日晚些时候进一步衍生出印章的表面。 - 用印章盖住容器,让它们在室温下静置5分钟。
- 使用去离子水,彻底冲洗两面的每个印章。
- 将邮票放在干净的容器中,并在去离子水中充分涂上2.5%戊二醛。
注意:戊二醛是有毒的;在通风橱下处理和工作时使用防护手套和眼镜)。这种戊二醛处理与先前的3-APTMS处理一起在PDMS印章的表面提供醛官能团,其可以与蛋白质中的胺基团反应以产生仲胺键,这对蛋白质去除过程至关重要27。 - 盖上印章,让它们在室温下静置30分钟,然后再次用去离子水彻底冲洗。以与盖玻片相同的方式从邮票表面去除多余的水分,并让邮票在未覆盖的情况下干燥约30分钟。
- 30分钟后,检查蛋白质涂层盖玻片和印章是否干燥。如果其中任何一个没有完全干燥,请使用过滤气枪将其完全干燥,确保盖玻片长时间不暴露在光线下。
- 盖玻片和盖玻片干燥后,以足够的压力将盖玻片图案一侧向下推到盖玻片上,使盖玻片与盖玻片表面完全接触。将印章与盖玻片接触15分钟。
注意:由于戊二醛印章与玻璃盖玻片上的蛋白质层之间的共价酰胺键比蛋白质层和玻璃盖玻片之间的弱疏水相互作用强得多,蛋白质在去除后应根据PDMS印章上的图案剥离玻璃。 - 15 分钟后,小心地从盖玻片上撕下 PDMS 印章。
注意:如果移除过程正确,则印章不应在没有阻力的情况下从盖玻片上脱落,但也不应牢固地粘在盖玻片上,以免在没有过度用力的情况下将其移除。 - 使用荧光显微镜上的适当滤光片检查图案盖玻片的保真度(取决于蛋白质标记的荧光染料)。
- 立即使用带图案的盖玻片,或保存并存放,避免直射光线。
3. 激活的盖玻片
注意:在PAA凝胶的实验室中使用的底部盖玻片是在此步骤中制造的。该底部盖玻片经过特殊处理,可在图案化过程中移除顶部图案盖玻片时,使 PAA 凝胶保持牢固粘附。类似的技术也在别处描述10,12,15,28。
- 将30毫米盖玻片在100%乙醇中超声处理10分钟,用去离子水冲洗,然后用过滤的气枪彻底干燥。在6孔板中每批一次制备多达6个盖玻片。
- 等离子体在高(射频功率为30 W)上处理盖玻片1分钟,然后将每个盖玻片放入6孔板的孔中。
- 在通风橱中用乙醇中的非常薄的5%APTMS涂层每个盖玻片。
注意:如果在此过程中涂层过多,将形成橙色残留物。 - 盖上6孔板,让盖玻片静置5分钟。
- 用去离子水彻底冲洗盖玻片(两侧)和每个孔的内部,并去除孔内多余的水。
- 将盖玻片放回6孔板中,并在去离子水中加入约2mL 0.5%戊二醛。
- 盖上6孔板,让盖玻片在戊二醛溶液中静置30分钟;然后,用去离子水彻底冲洗盖玻片和每个板的孔。
- 将处理过的盖玻片储存在6孔板内的去离子水中长达两周或立即使用。使用前确保盖玻片完全干燥。
4. PAA凝胶制备和图案转移
注意:一旦制成图案化的盖玻片,必须使用它们将这些蛋白质图案转移到PAA水凝胶中(<24小时)1,29,30。以下配方适用于杨氏模量为3.6 kPa的PAA凝胶。双丙烯酰胺、丙烯酰胺和去离子水的量可以改变以调节PAA凝胶12的刚度。
- 在开始制造PAA水凝胶前体之前,从冰箱中除去丙烯酸 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯,使其在打开前可以达到室温。准备一个可互换的盖玻片皿,用70%乙醇灭菌,并在使用前将其置于生物安全柜中的紫外线下至少30分钟。
注意:NHS是一种有毒的皮肤和眼睛刺激物;处理时使用防护手套和眼镜,并在通风橱下工作。- 将1.25 mL 40%丙烯酰胺加入去离子水中,加入15 mL锥形管中。
注意:丙烯酰胺是一种有毒的皮肤和眼睛刺激物;处理时使用防护手套和眼镜,并在通风橱下工作。 - 将175μL双丙烯酰胺溶液在去离子水中加入到同一管中(步骤4.1.1)。
注意:双丙烯酰胺是一种有毒的皮肤和眼睛刺激物;处理时使用防护手套和眼镜,并在通风橱下工作。 - 加入500μL10x磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
注意:PBS是一种眼睛刺激物;处理时使用防护手套和眼镜。 - 加入2.915毫升去离子水。
- 将1.25 mL 40%丙烯酰胺加入去离子水中,加入15 mL锥形管中。
- 将969μL该前体移液到1.5mL微量离心管中,并将其余部分在4°C下储存长达两周。
- 在另一个微量离心管中测量出〜50-100mg过硫酸铵(APS),并将其在去离子水中稀释至100mg / mL;将其放在一边供以后使用。打开罩子中的NHS酯(现在在室温下),并在微量离心管中仔细测量高达3mg的NHS。将NHS酯稀释至1mg / mL在1x PBS中。
注意:APS是皮肤和眼睛的刺激物;处理时使用防护手套和眼镜,并在通风橱下工作。APS和NHS酯都会随着时间的推移而水解,导致储备溶液中化学物质的活性发生变化。因此,这两种溶液每次都必须新鲜制备(与其他前体不同)。 - 在通风橱中执行接下来的三个步骤:
- 将2μL四甲基乙二胺(TEMED)加入含有969μL等分试样的PAA前体的微量离心管中。
注意:TEMED是一种易燃的皮肤和眼睛刺激物;使其远离热源/火焰/火花,处理时使用防护手套和眼镜,并在通风橱下工作。TEMED是PAA水凝胶聚合所必需的两种交联剂之一,另一种是APS。 - 加入15μL1M盐酸以降低水凝胶溶液的pH值并避免NHS酯的水解。
注意:盐酸是一种腐蚀性皮肤和眼睛刺激物;处理时使用防护手套和眼镜,并在通风橱下工作。 - 向管中加入10μLNHS酯溶液。
注意:NHS 对图案化过程至关重要。它将与图案覆盖玻片上的蛋白质中的胺基反应以形成稳定的酰胺键,这将允许图案在聚合时从玻璃盖玻片转移到PAA凝胶的表面31。
- 将2μL四甲基乙二胺(TEMED)加入含有969μL等分试样的PAA前体的微量离心管中。
- 在生物安全柜中执行以下最后步骤:
- 小心地将30毫米盖玻片放在盖玻片盘组的金属部分(3-APTMS和戊二醛处理的一面朝上),并将塑料环拧在上面。设置有图案的盖玻片,以便在下一步中轻松触及,同时尽可能保护其免受光线照射。
- 将5μLAPS溶液移液到微量离心管中的PAA前体的其余部分中,将其倒置以混合,然后立即将35μL该溶液移液到30mm盖玻片上。
- 将图案化的盖玻片蛋白面朝下滴到溶液上,小心不要在水凝胶中产生气泡。保护水凝胶免受光照,并使其聚合90分钟。
- 一旦水凝胶聚合,使用剃须刀片或手术刀去除上盖玻片,确保盖玻片不会从凝胶上滑落或脱落到凝胶上,因为这会破坏凝胶表面的图案。
注意:不要将凝胶暴露在气流较大的区域(如生物安全柜)。< - 为了钝化水凝胶中任何剩余的NHS酯,向凝胶中加入2mL无菌PBS并在37°C下孵育45分钟。立即准备凝胶进行实验或将其在4°C的无菌PBS中储存过夜,直到使用。
5. 成像
- 为了准备用细胞进行实验,在计划实验之前的下午在显微镜中打开热量(37°C)和湿度(70%),以使显微镜室内的设备平衡到更高的温度。
注:此步骤可最大限度地减少由温度波动引起的 z 轴漂移。 - 在实验开始之前,打开腔室的CO2 源。
- 为了防止在实验过程中由于显微镜载物台的重复移动而引起的x-y漂移,用双面胶带将细胞接种的水凝胶固定在载物台上的可互换盖玻片培养皿集。
- 查看凝胶以找到感兴趣的帧以进行成像,保存要成像的部分的每个阶段位置。
- 在对应于标记蛋白质的明场视图和荧光视图中,将显微镜软件设置为每帧成像一次,每5分钟一次,持续2小时。
6. 图像分析
注意:已经开发了一种系统,可以通过确定牵引点的位置,插值变形点的初始位置,然后计算每个位置的细胞牵引力来测量图案化PAA凝胶的变形。可以使用任何能够执行图像处理和数值计算的软件系统。该程序旨在快速确定牵引力,消除用户输入和预处理程序,这些程序会导致与用户相关的错误。此处使用的代码可在此处作为 补充文件 2-10 获得,这些文件以及一对练习图像可在 www.bu.edu/mml/downloads 访问。
- 在图像处理软件中,从使用的每个显微镜视图中按顺序打开在延时摄影实验期间拍摄的所有单个图像,从捕获的第一个图像到最后一个图像,并将它们转换为单个图像堆栈(单击 图像|堆栈|要堆叠的图像)。确保有两个单独的图像堆栈:一个是细胞的明场视图,另一个是它们所附着的图案的荧光视图。
- 如果荧光图像中存在漂移(即,感兴趣的岛在每个帧之间的x和/或y方向上移动了>1-2μm),则首先使用StackReg插件(P. Thévenaz,瑞士联邦理工学院洛桑)处理图像堆栈,以根据第一个图像的位置重新居中堆栈中的每个图像(单击 插件|堆栈|翻译|好的)。
注意:这一点至关重要,因为即使是亚μm的漂移也会显著影响牵引力的最终计算,特别是在较硬的凝胶上,其中x-y漂移超出了预期噪声的范围。该代码将在漂移被删除后保存图像,然后可以将其制作成新的图像堆栈进行分析。
- 如果荧光图像中存在漂移(即,感兴趣的岛在每个帧之间的x和/或y方向上移动了>1-2μm),则首先使用StackReg插件(P. Thévenaz,瑞士联邦理工学院洛桑)处理图像堆栈,以根据第一个图像的位置重新居中堆栈中的每个图像(单击 插件|堆栈|翻译|好的)。
- 将明场和荧光图像堆栈输入到CTFTimelapse.m(补充文件2)中。
- 指定图像堆栈位于第 7 行的文件目录。
- 在第 8 行和第 9 行上,分别指定荧光图像堆栈的名称和相应的明场荧光堆栈。
- 指定 PAA 凝胶刚度 (Pa):
- 在第11-14行中,包括最常用的PAA水凝胶的几种不同的弹性模量,注释掉(线开始时的类型% )除所分析图像中凝胶的弹性模量之外的所有。或者,如果弹性模量尚不存在,则添加弹性模量并注释掉其余部分(测试图像为3658.19 Pa)。
- 在第 15 行(1 × 10-6 m 对于测试图像)上指定点半径 (m)。
- 在第 16 行(对于测试图像为 2.5 μm)上指定最大可能的点直径 (μm)。
- 指定像素比率(μm/像素):
- 在第17-20行中,包括基于以前使用的成像设置的几个不同的图像像素比,注释掉(在行的开头键入% )除所分析图像的像素比之外的所有图像。或者,添加使用的像素比(如果尚不存在)并注释掉其余部分(测试图像为0.1613μm/像素)。
- 在第 35 行和第 87 行,指定所需图像处理文件所在的文件目录。
注:从荧光图像堆栈中,该代码确定每个荧光点的位置并跟踪每个点在堆栈20中每个图像之间的移动。微接触打印点的初始位置是已知的,因为它们在正确转移到水凝胶32时不会变形。
- 等待程序找到点后出现两个数字和一个对话框。使用 图 1 确保程序已找到正确的点,并且没有找到许多没有点的点。使用 图 2 选择矩形网格,帮助程序定位和计算蜂窝牵引力。
注: 图1 是细胞的明场图像,程序找到的点(将是红色的)覆盖在其上(见 图3A)。 图2 是显示 图1 所示相同点的图像,但背景中没有明场图像。- 等待对话框提示在 选择点后按 Enter 键-其中每个点都是程序找到的红点之一-并且其中有一个标记为 Enter 的大按钮。
- 在 图 2 中选择四个不同的点,以在该图案周围创建一个矩形网格,并包括该图案上的单元/簇。 通过左键单击 鼠标逐个选择每个点,然后按上述对话框中按钮上的 Enter键 进行确认。保持第一个和第二个点以及第一个和第三个点之间有多少个点的计数,因为一旦选择了所有四角点,程序将要求这些值。在命令窗口中输入这些值(键入 点数,然后在出现提示时单击键盘上的 Enter 按钮)。
- 选择矩形网格后,等待脚本根据荧光点的位置计算它在网格内找到的牵引力。请注意,脚本首先查找每个点的几何中心的位移矢量 (u),然后使用等式 (1) 计算相应的牵引力矢量 (F):
(1)
其中 E 是PAA衬底的杨氏模量, a 是荧光点标记的半径, ν 是PAA衬底32的泊松比。方程式(1)假设基底是一个无限弹性的半空间,在每个圆形点标记的中心施加牵引力,并且点标记之间的间距足够大,使得它们各自的位移不会相互作用23。
注意:在此描述的实验中,使用半径a = 1μm和6μm中心间距的点标记。单元/簇内指向单元中心的牵引力箭头应存在,而单元/簇外的区域不应存在牵引箭头(参见图3C-E)。从细胞/细胞簇内部向外的牵引箭头或细胞外存在的许多大型牵引箭头表明矩形网格选择不当。 - 找到正确的牵引场后,选择小区/磁簇周围的适当感兴趣区域(ROI),其中包括使用光标的单元内的所有牵引箭头。
- 要绘制 ROI, 请根据需要多次左键单击 以绘制具有所需多条边的多边形形状,调整形状或在绘制后分别通过 左键单击 角或边缘来移动 ROI。绘制ROI后, 双击鼠标左 键以移动到堆栈中的下一个图像。对明场堆栈中的所有图像重复此操作。
注意:代码会将每个时间点的牵引力和位移数据保存在与原始图像堆栈相同的文件夹中,然后可以进一步分析。
- 要绘制 ROI, 请根据需要多次左键单击 以绘制具有所需多条边的多边形形状,调整形状或在绘制后分别通过 左键单击 角或边缘来移动 ROI。绘制ROI后, 双击鼠标左 键以移动到堆栈中的下一个图像。对明场堆栈中的所有图像重复此操作。
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Representative Results
采用减法微图案化方法制备了杨氏模量为E = 3.6 kPa,泊松比为0.445的PAA水凝胶。水凝胶的厚度约为100μm,这允许它们使用此处使用的成像设置进行成像,同时还可以防止细胞感应凝胶下方的刚性盖玻片,这将在专注于细胞刚性感测的研究中引起问题23,33。许多其他刚度水平(高达30 kPa)的凝胶已经成功地使用间接微图案化方法34进行制造和成像,因此该方法不限于仅使用3.6 kPa水凝胶。盖玻片提前用戊二醛处理,以便在除去顶部图案盖玻片时使凝胶保持固定在下盖玻片上(图2C,D)。
为了可视化和测量簇内的细胞牵引力,用荧光纤连蛋白间接图案化3.6 kPa水凝胶(图2A-D)以创建预定大小和形状的岛状图案(图2E)。其他类型的蛋白质也可以图案化在这些软水凝胶21,35,36,37,38上。传输的图案的质量与铸造 PDMS 印章的主模的保真度直接相关。具有SU-8分层的模具将看到由这些分层模具铸造的邮票制成的图案的质量下降。例如,具有分层SU-8的模具通常会在预定的岛屿之间产生包含未图案化纤连蛋白切片的微图案。如果投射在凝胶上,这些图案允许细胞附着在岛微图案外的区域中的凝胶上。因此,将成像细胞簇附着在完全或大部分完整的岛屿图案上是当务之急。
将牛血管平滑肌细胞(BVSMC)以约60-80的密度接种到这些水凝胶上,×103 个细胞/凝胶以促进簇形成,并在成像前粘附18-24小时。就在实验之前,用活细胞核染色对细胞进行染色,以识别活细胞并确定每个簇中的细胞数量。对有细胞和无细胞的微图案岛进行成像和分析。没有细胞的成像岛允许计算3.6 kPa凝胶的牵引力计算中存在的噪声。然后,这些假正位移测量值可用于确定适当的阈值,低于该阈值应排除位移。
已经发现,0.3μm通常足以消除导致假阳性位移测量的模式不忠。这样做可能会导致低力牵引力的损失,但对于消除假阳性牵引力至关重要。在成像时,优先考虑大多数完整岛图案上的细胞簇(即,那些没有丢失许多点的细胞簇),并且大多数没有细胞的完整模式。每个ROI每5分钟成像一次,持续2小时。用于在延长延时实验期间捕获细胞和图案化PAA凝胶图像的显微镜是具有自动载物台,荧光光源,相机和标准显微镜软件的荧光显微镜。该显微镜具有一组定制的滤光片,用于观察许多不同颜色的荧光。用于观察细胞和图案化水凝胶的物镜是40倍水浸物镜,NA = 1.15。该显微镜还配备了定制的温度(37°C),湿度(70%)和CO2 (5%)调节系统,以保持细胞在长时间实验中的活力。
为了计算微图案岛图像的牵引力,使用图像分析软件跟踪荧光纤连蛋白点随时间推移的位移。知道荧光点的位移和点图案化的PAA凝胶的刚度,该程序可以确定PAA基板上单个细胞和簇传递的牵引力值。但是,有两种方式程序无法确定牵引力值。如果给定的感兴趣帧内有太多的点变形,程序将难以计算力,因为程序依赖于分析图像中的大多数点来变形。此外,如果两个点彼此太近(中心到中心的距离≤2 μm20),则单个点的位移可能会相互干扰,从而无法准确确定其实际位移值,从而无法准确确定其牵引值。只要微图案被设计成间隔良好的点,细胞就不应该能够将点移位得如此之多,以至于它们变得如此紧密,即使在较软的基板上也是如此。
图 3 显示了移除图案化方法的功能。在这里,该方法制造预定形状的孤立的,定义明确的岛屿图案的能力如图3B-E所示,其中纤连蛋白粘附点仅存在于岛屿的所需区域内。这些孤立的粘合点岛进一步允许更好地控制簇状,如图3A所示。由于岛屿的形状和大小是一致的,因此附着并生长在其上的细胞簇也往往具有一致的形状,因为岛屿模式限制了集群生长面积。最后,图3B-E还显示了这些岛用于计算蜂窝牵引力的能力以及这些牵引力随时间变化的趋势。在这里,集群的牵引力是围绕岛屿边缘的最大。这是预料之中的,因为聚类边缘的像元与聚类中其他像元的交互比聚类内部的像元的相互作用要少。因此,边缘的这些细胞在基质上施加比内部细胞更大的力,以响应细胞骨架收缩。
图 1:光掩模的设计。 (A) 此处使用的光掩模设计的前半部分的表示,一个直径为 2 μm 的离散网格,点的中心到中心间隔为 6 μm。虽然此处显示的图像只是设计的一小部分,但此网格填充了光掩模上总共1.5 x 1.5 cm的空间。(B) 光掩模设计后半部分的表示形式;这里显示的是六个6 x 6点的小岛。在光掩模上,有多种不同的岛屿尺寸:6 x 6(如图所示),12 x 12,25 x 25和42 x 42点。每个岛屿大小的等间距(岛屿之间50μm)阵列占用1.5 x 0.375厘米的空间,不同岛屿的阵列相隔50μm。每个岛的点直径为2μm,中心到中心的间隔为6μm。 A 和 B 中描述的面具的两个部分相隔0.75厘米。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:减材微接触打印。 (A)PDMS印章用戊二醛处理,并与均匀涂有荧光纤连蛋白溶液的玻璃盖玻片接触。(B)从盖玻片上取下后,PDMS印章剥离盖玻片表面的大部分荧光纤连蛋白,仅在PDMS印章设计预先确定的位置留下微米大小的蛋白质点。(C)将图案化的盖玻片与PAA预聚物和NHS溶液接触。(D)一旦PAA凝胶完全聚合,取出顶部盖玻片,并将纤连蛋白图案印刷到PAA凝胶表面上。(E)由PAA水凝胶上均匀间隔的点组成的离散岛图案的示例,杨氏模量为3.6 kPa。比例尺 = 20 μm。缩写:PDMS =聚二甲基硅氧烷;PAA = 聚丙烯酰胺;NHS = N-羟基琥珀酰亚胺。 请点击此处查看此图的大图。
图3:岛微图案上的细胞分析。 (A)显示了3个BVSMC簇的明场图像,该晶簇叠加在PAA水凝胶上的荧光纤连蛋白岛微图案上,杨氏模量为3.6 kPa。点的直径为2 μm,中心到中心之间相隔6 μm。(B)荧光图案显示,由于BFSMC施加力,岛上的许多纤连蛋白点已被移位。(C)在时间点1处施加在粘附点上的牵引力(2小时实验的开始)。这些力矢量的方向由彩色箭头的方向指示。它们的大小由箭头颜色及其在颜色条上的相应值表示(所有力值都以nN为单位)。矢量长度是相对的,基于程序为每个时间点计算的最小和最大力。(D)同一簇在时间点13处的牵引力(2小时实验的中途)(E)同一簇在时间点25处的牵引力(2小时实验结束)。缩写= BVSMC = 牛血管平滑肌细胞;PAA = 聚丙烯酰胺。 请点击此处查看此图的大图。
补充文件1:用于标记纤连蛋白的计算器 这是一个工具,用于计算标记纤连蛋白时要使用的Alexa488荧光染料的正确量。 请点击此处下载此文件。
补充文件 2:CTFTimelapse.m 这是图像处理文件,它允许计算细胞牵引力,如第5节(图像分析)中所述。这包括选择所需的点网格(步骤 6.3-6.3.2)和选择感兴趣的区域进行 CTF 计算(步骤 6.5 和 6.5.1)。以下所有补充文件都由此脚本或其中使用的其他函数之一直接调用。 请点击此处下载此文件。
补充文件 3:analyze_initial_image_4.m 此函数由CTFTimelapse.m调用,其目的是从变形网格图案的图像堆栈的第一帧定位并对齐网格上的荧光点,以匹配原始未变形的网格图案。这允许计算图像堆栈中第一帧的牵引力。 请点击此处下载此文件。
补充文件 4:analyze_subsequent_images.m 此函数由CTFTimelapse.m调用,其目的是从第一个变形网格图案的图像堆栈的所有帧中定位并对齐网格上的荧光点。这允许在第一个帧之后计算图像堆栈中所有帧的牵引力。 请点击此处下载此文件。
补充文件 5:bpass.m 该函数由analyze_initial_image_4.m调用,并分析subsequent_images.m,其目的是实现处理变形网格图案的图像堆栈的真实空间带通滤波器。该滤光片抑制像素噪声和长波长图像变化,同时保留特征大小的信息。 请点击此处下载此文件。
补充文件 6:CellBoundary.m 此函数由CTFTimelapse.m调用,其目的是允许程序用户在要计算牵引力的单元/集群周围绘制一个感兴趣的区域。 请点击此处下载此文件。
补充文件 7: pkfnd.m 此函数由 analyze_initial_image_4.m 和 analyze_subsequent_images.m 调用,其目的是在具有像素级精度的图像中找到局部最大值。cntrd.m使用这些峰来定位CTFTimelapse.m的荧光网格图案。 请点击此处下载此文件。
补充文件 8: cntrd.m 该函数由analyze_initial_image_4.m和analyze_subsequent_images.m调用,其目的是将图像中亮点的质心定位到亚像素精度。这允许通过CTFTimelaspe.m定位荧光网格图案,如步骤6.3中所述。 请点击此处下载此文件。
补充文件9:四角.m 此函数由 analyze_initial_image_4.m 和 analyze_subsequent_images.m 调用,其目的是采用用户选择的网格(步骤 6.3-6.3.2),并计算两个正交轴中每个角点之间的距离。 请点击此处下载此文件。
补充文件 10:track.m 该函数由analyze_initial_image_4.m和analyze_subsequent_images.m调用,其目的是跟踪帧之间荧光网格图案中点的运动,这对于计算相应的牵引力至关重要。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
本文介绍了一种间接图案化PAA水凝胶的改进方法。此方法基于以前使用过的方法20,35,36,37,38,39,40,41,42。主要的变化是PDMS印章现在用于去除蛋白质并将所需的图案留在中间基板上,而不是直接将图案压印在其上。这允许更一致地创建高保真微图案,并创建孤立的微图案岛,这在以前需要两个生产步骤。与使用以前的两步法制作的图案相比,使用此方法制作的岛屿图案的形状和大小也更容易控制。与旧技术相比,新技术更不容易受到缩微印刷过程中施加的压力的影响。第二个优点是,这种去除方法只需一步即可使形状和大小的岛状图案受控。相比之下,以前的方法需要两个步骤来制作岛屿,包括沉积的冲压和随后的去除冲压,这些岛屿的形状不如用去除方法制成的形状精确。
这种方法的主要缺点是,用于模塑新式PDMS邮票的母版的寿命似乎比以前的冲压方法中使用的寿命短。这可能归因于移除方法中使用的新母版的形状。旧的母版由1.5 x 1.5厘米面积的SU-8组成,由等间距的5μm深的圆形孔组成,当在PDMS中铸造时,将创建由相同高度的均匀间隔的圆柱形柱子组成的邮票。相反,新的母版由1.5 x 1.5厘米区域的5μm高的SU-8圆柱形柱组成,当在PDMS中铸造时,它们会产生由均匀间隔的孔组成的邮票。
随着母版结构的这种变化,人们发现SU-8往往比旧方法更容易从表面分层。采取了预防措施来防止这种情况,例如在等离子体asher中对硅晶片进行表面处理,以使其更适合与SU-8结合。在PDMS中首次铸造之前,晶圆的表面也进行了硅烷化,以防止SU-8在移除印章时粘附在PDMS上。尽管如此,在PDMS中反复铸造后,已经观察到硅晶片的SU-8分层,应谨慎确保在失去当前主器件之前制造新的硅晶片。避免这种分层的一种可能方法是使用PDMS双铸方法,该方法在前面43中已有描述,尽管另一种方法有其局限性。
这种方法(以及使用可变形水凝胶来测量牵引力44的其他方法)的另一个缺点是,由于实验噪声,牵引场不处于机械平衡状态。因此,在计算牵引力后,需要进行后处理分析以获得平衡的牵引场。平衡牵引力的一种方法是使用最小二乘法获得最接近满足平衡的测量值的力。结果,测量的牵引力的大小和方向被改变45。
这种计算蜂窝牵引力的方法存在局限性。为了使用等式(1)(步骤5.4)准确确定蜂窝牵引力,必须设计图案,使一个粘附点的位移不会显着影响与其直接相邻的那些位移。从理论上讲,由于作用于中心的切向力,无限半空间表面上的圆形粘附区域的位移随着与圆心的径向距离增加而减小23。具体而言,对于泊松比为 ~0.445 的基板(如此处所述),圆形区域边缘的位移大约是该区域中心位移的三分之二。然而,理论预测不会超出圆形区域。因此,假设从理论上确定的位移幅度的下降趋势(理论上为23)继续超出粘附圈的边缘。在此描述的微图案设计中,使用中心到中心间隔 6 μm 的 2 μm 圆形点。这种间距的原因是,距点中心6μm距离的位移估计约为点中心位移的 1/12,假设其小到足以影响相邻点的位移值。然而,细胞施加的牵引力可能会取代基板上的粘附点,以至于它们之间的中心到中心距离小于2μm。在这种情况下,关于相邻粘附点的位移不相互干扰的假设不成立,并且不能使用步骤6.4 (方程(1))中给出的方程准确计算牵引力。
所提出的技术为测量蜂窝牵引力提供了强大的工具。这些力可以深入了解单个细胞和簇的机械环境,并有助于了解不同类型的细胞是否以及如何保持机械稳定性。维持细胞张力的稳态水平对于许多细胞过程至关重要,并且这种张力性稳态的丧失与各种疾病有关,例如动脉粥样硬化,哮喘和癌症9,10,12。张力稳态被定义为细胞或细胞簇保持一致张力水平的能力,在设定点46周围具有较低的时间变异性。
这种间接微图案化方法可用于确定各种细胞类型在个体和多细胞水平上维持张力稳态的能力。这是通过跟踪蜂窝牵引场值随时间的变化,然后使用变异系数(CV)量化牵引场的时间波动来完成的,该变异系数表示牵引场大小的标准偏差与其平均值的比率。牵引力的大小和收缩力的大小(牵引力的第一个力矩)的总和被用作牵引场大小的标量度量46。如果在整个延时实验中牵引场的CV保持接近于零,则表明细胞/簇在46段时间内保持张力稳态。
总之,这种用于软水凝胶间接微图案化的新方法提供了一种比以前的方法更简单,更有效的创建图案化水凝胶的方法。可以采取某些步骤来改进和扩展此方法。首先,以延长其使用寿命的方式改进硅母器件的制造工艺将消除这种微图案化方法的主要缺点。至于扩展这种方法的方法,除了这里描述的方形岛屿之外,探索不同的岛屿形状将提高这种方法的多功能性。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
作者要感谢波士顿大学机械工程系的Paul Barbone博士在数据分析方面的有益讨论和帮助。这项研究得到了NSF拨款CMMI-1910401的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
(3-aminopropyl)trimethoxysilane | Sigma Aldrich | #281778 | |
1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | #05-408-129 | |
15 mL conical tube | Fisher Scientific | #05-539-12 | |
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask | Advance Reproductions Corporation | N/A | Custom-designed mask |
6 Well Plates | Fisher Scientific | #07-200-83 | |
Acetone | Fisher Scientific | #A18P-4 | |
Acrylamide Solution, 40% | Sigma Aldrich | #A4058 | |
AlexaFluor 488 | Thermo Fisher | #A20000 | |
Aminonium Persulfate | Fisher Scientific | #BP179-25 | |
Bisacrylamide | Fisher Scientific | #PR-V3141 | |
Ethanol | Greenfield Global | #111000200C1GL | |
Glass Coverslips, 25 mm round | Fisher Scientifc | #12-545-102 | |
Glass Coverslips, 30 mm round | Warner | #64-1499 | |
Hamamatsu ORCA-R2 Camera | Hamamatsu | #C10600-10B | |
Human Plasma | Valley Biomedical | #HP1051P | Used to isolate fibronectin |
Hydrochloric Acid, 1.0 N | Millipore Sigma | #1.09057 | |
ImageJ | Wayne Rasband | #1.53n | |
Interchangeable Coverslip Dish Set | Bioptechs | #190310-35 | |
Kim Wipes | Fisher Scientific | #06-666-11C | |
Mask Alinger | Karl Suss | #MA6 | |
Matlab 2021 | Mathworks | #R2021a | |
MetaMorph Basic | Molecular Devices | #v7.7.1.0 | |
N-hydroxysuccinimide ester | Sigma Aldrich | #130672-5G | |
NucBlue Live Cell Stain | Thermo Fisher | #R37605 | |
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope | Olympus | #IX81 | |
PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | #52-1308-00 | |
Photoresist Spinner Hood | Headway Research | #PWM32 | |
Plasma Cleaner | Harrick | #PDC-001 | |
Plasma Etcher | TePla | #M4L | |
Prior Lumen 200Pro Light Source | Prior Scientific | #L200 | |
Silicon Wafers, 100 mm | University Wafer | #809 | |
SU-8 2005 | Kayaku Advanced Materials Inc. | #NC9463827 | |
SU-8 Developer | Kayaku Advanced Materials Inc. | #NC9901158 | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer | Essex Brownell | #DC-184-1.1 | |
Tetramethylethylenediamine | Fisher Scientific | #BP150-20 | |
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | #448931 | |
UAPON-40XW340 Objective | Olympus | #N2709300 | |
UV Flood Exposure | Newport | #69910 | |
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm | Ted Pella, Inc. | #19395-40 |
References
- Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), 55172 (2013).
- Bhadriraju, K., et al. Activation of ROCK by RhoA is regulated by cell adhesion, shape, and cytoskeletal tension. Experimental Cell Research. 313 (16), 3616-3623 (2007).
- Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L.
Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010). - Ganz, A., et al. Traction forces exerted through N-cadherin contacts. Biology of the Cell. 98 (12), 721-730 (2006).
- Chopra, A., et al. Reprogramming cardiomyocyte mechanosensing by crosstalk between integrins and hyaluronic acid receptors. Journal of Biomechanics. 45 (5), 824-831 (2012).
- Winer, J. P., Chopra, A., Kresh, J. Y., Janmey, P. A. Substrate elasticity as a probe to measure mechanosensing at cell-cell and cell-matrix junctions. Mechanobiology of cell-cell and cell-matrix interactions. , Springer. Boston, MA. 11-22 (2011).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), 32572 (2012).
- Lavoie, T. L., et al. Disrupting actin-myosin-actin connectivity in airway smooth muscle as a treatment for asthma. Proceedings of the American Thoracic Society. 6 (3), 295-300 (2009).
- Kraning-Rush, C. M., et al. Quantifying traction stresses in adherent cells. Methods in Cell Biology. 110, 139-178 (2012).
- Halliday, N. L., Tomasek, J. J. Mechanical properties of the extracellular matrix influence fibronectin fibril assembly in vitro. Experimental Cell Research. 217 (1), 109-117 (1995).
- Harris, A. K., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Aratyn-Schaus, Y., et al. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (46), e2173 (2010).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Sniadecki, N. J., Chen, C. S. Microfabricated silicone elastomeric post arrays for measuring traction forces of adherent cells. Methods in Cell Biology. 83, 313-328 (2007).
- Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (4), 1484-1489 (2003).
- Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
- Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
- Polio, S. R., et al. Topographical control of multiple cell adhesion molecules for traction force microscopy. Integrative Biology. 6 (3), 357-365 (2014).
- Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
- Maloney, J. M., et al. Influence of finite thickness and stiffness on cellular adhesion-induced deformation of compliant substrata. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 78 (1), Pt 1 041923 (2008).
- Gilles, S. Chemical modification of silicon surfaces for the application in soft lithography. Technical Report Juel-4249. , Available from: https://www.osti.gov/etdeweb/biblio/21084355 (2007).
- Lim, K. B., Lee, D. C. Surface modification of glass and glass fibers by plasma surface treatment. Surface and Interface Analysis. 36, 254-258 (2004).
- Beal, J. H. L., Bubendorfer, A., Kemmitt, T., Hoek, I., Arnold, W. M. A rapid, inexpensive surface treatment for enhanced functionality of polydimethylsiloxane microfluidic channels. Biomicrifluidics. 6 (3), 36503 (2012).
- Goddard, J. M., Erickson, D. Bioconjugation techniques for microfluidic biosensors. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394 (2), 469-479 (2009).
- Rajagopalan, P., et al. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophysical Journal. 87 (4), 2818-2827 (2004).
- Tang, X., Yakut Ali, M., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 3197-3206 (2012).
- Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2010).
- Rusmini, F., Zhong, Z., Feijen, J.
Protein immobilization strategies for protein biochips. Biomacromolecules. 8 (6), 1775-1789 (2007). - Polio, S. R., et al. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8 (1), 82-88 (2012).
- Buxboim, A., et al. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
- Xu, H., et al. Focal adhesion displacement magnitude is a unifying feature of tensional homeostasis. Acta Biomaterialia. 113, 327-379 (2020).
- Shen, K., et al. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (22), 7791-7796 (2008).
- Eichinger, C. D., Hsiao, T. W., Hlady, V. Multiprotein microcontact printing with micrometer resolution. Langmuir. 28 (4), 2238-2243 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (22), e1065 (2008).
- Zollinger, A. J., et al. Dependence of tensional homeostasis on cell type and on cell-cell interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (3), 175-184 (2018).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. 13 (7), 2059-2067 (1997).
- Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
- Rottmar, M., et al. Stem cell plasticity, osteogenic differentiation and the third dimension. Journal of Materials Science-Materials in Medicine. 21 (3), 999-1004 (2010).
- Desai, R. A., et al. Subcellular spatial segregation of integrin subtypes by patterned multicomponent surfaces. Integrative Biology. 3 (5), 560-567 (2011).
- Kim, S. H., Lee, S., Ahn, D., Park, J. Y. PDMS double casting method enabled by plasma treatment and alcohol passivation. Sensors and Actuators B: Chemical. 293, 115-121 (2019).
- Butler, J. P., Tolić-Nǿrrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Canović, E. P., et al. Biomechanical imaging of cell stiffness and prestress with subcellular resolution. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 665-678 (2014).
- Stamenović, D., Smith, M. L. Tensional homeostasis at different length scales. Soft Matter. 16 (30), 6946-6963 (2020).