الثقافة الأولية للخلايا الظهارية الصبغية الشبكية الخنازير
Summary
هنا ، يتم تقديم طريقة سهلة المتابعة لزراعة الخلايا الظهارية الصبغية الصبغية الأولية في المختبر في المختبر .
Abstract
ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) هي طبقة أحادية من الخلايا الظهارية المصطبغة المستقطبة ، وتقع بين المشيمية والشبكية العصبية في شبكية العين. يتم إجراء وظائف متعددة ، بما في ذلك البلعمة ، ونقل المغذيات / الأيض ، واستقلاب فيتامين أ ، وما إلى ذلك ، بواسطة RPE على أساس يومي. خلايا RPE هي خلايا ظهارية متمايزة نهائيا ذات قدرة تجدد قليلة أو معدومة. يؤدي فقدان خلايا RPE إلى أمراض عيون متعددة تؤدي إلى ضعف البصر ، مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر. لذلك ، فإن إنشاء نموذج زراعة في المختبر لخلايا RPE الأولية ، والتي تشبه إلى حد كبير RPE في الجسم الحي أكثر من خطوط الخلايا ، أمر بالغ الأهمية للدراسات المميزة والميكانيكية لخلايا RPE. بالنظر إلى حقيقة أن مصدر مقل العيون البشرية محدود ، فإننا ننشئ بروتوكولا لزراعة خلايا RPE الخنازير الأولية. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن فصل خلايا RPE بسهولة عن مقل عيون الخنازير البالغة. بعد ذلك ، تلتصق هذه الخلايا المنفصلة بأطباق / إدخالات الثقافة ، وتتكاثر لتشكل طبقة أحادية متقاربة ، وتعيد بسرعة إنشاء السمات الرئيسية للأنسجة الظهارية في الجسم الحي في غضون 2 أسبوع. بواسطة qRT-PCR ، ثبت أن خلايا RPE الخنازير الأولية تعبر عن جينات توقيع متعددة بمستويات مماثلة مع أنسجة RPE الأصلية ، في حين أن تعبيرات معظم هذه الجينات تضيع / تنخفض بشكل كبير في الخلايا البشرية الشبيهة ب RPE ، ARPE-19. علاوة على ذلك ، يظهر تلطيخ التألق المناعي توزيع الوصلة الضيقة ، وقطبية الأنسجة ، وبروتينات الهيكل الخلوي ، بالإضافة إلى وجود RPE65 ، وهو إيزوميراز مهم لعملية التمثيل الغذائي لفيتامين أ ، في الخلايا الأولية المستزرعة. إجمالا ، قمنا بتطوير نهج سهل المتابعة لزراعة خلايا RPE الخنازير الأولية ذات النقاء العالي وميزات RPE الأصلية ، والتي يمكن أن تكون بمثابة نموذج جيد لفهم فسيولوجيا RPE ، ودراسة سمية الخلايا ، وتسهيل فحوصات الأدوية.
Introduction
تقع ظهارة صبغة الشبكية (RPE) بين المستقبلات الضوئية والمشيمية الشعرية في الطبقة الخارجية من الشبكية1 مع وظائف متعددة ، بما في ذلك تشكيل حاجز الدم والشبكية ، ونقل وتبادل العناصر الغذائية ومستقلبات الشبكية ، وإعادة تدوير فيتامين أ للحفاظ على دورة بصرية طبيعية ، والبلعمة وإزالة الأجزاء الخارجية للمستقبلات الضوئية (POSs)2,3 . نظرا لأن نقاط البيع تتطلب تجديدا ذاتيا مستمرا لتوليد الرؤية ، فإن خلايا RPE تحتاج إلى ابتلاع نقاط البيع المنفصلة باستمرار للحفاظ على توازن الشبكية4. لذلك ، يؤدي الخلل الوظيفي في RPE إلى العديد من أمراض العيون المسببة للعمى ، مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)4 ، التهاب الشبكية الصباغي (RP)5 ، داء ليبر الخلقي6 ، اعتلال الشبكية السكري7 ، إلخ. حتى الآن ، لا يزال التسبب الدقيق لمعظم هذه الأمراض بعيد المنال. نتيجة لذلك ، تم إنشاء ثقافة خلايا RPE لدراسة بيولوجيا خلية RPE ، والتغيرات المرضية ، والآليات الأساسية.
كأبسط نموذج لدراسة بيولوجيا الخلية ، بدأت ثقافة خلايا RPE في وقت مبكر من 1920s8. على الرغم من أن ARPE-19 يستخدم على نطاق واسع كخلايا RPE ، إلا أن فقدان التصبغ ، ومورفولوجيا الحصى ، وخاصة وظائف الحاجز في خط الخلية هذا تثير الكثير من المخاوف9. وبالمقارنة ، فإن ثقافة خلايا RPE البشرية الأولية تقدم سيناريو أكثر واقعية للدراسات الفسيولوجية والمرضية9. ومع ذلك ، فإن التوافر المحدود نسبيا يقيد استخدامها والقضايا الأخلاقية موجودة دائما. بالإضافة إلى ذلك ، استخدمت عدة مجموعات نماذج الماوس لزراعة خلايا RPE. ومع ذلك ، فإن حجم عين الفأر صغير ، وعادة ما تتطلب ثقافة واحدة العديد من الفئران ، وهو أمر غير مناسب9. في الآونة الأخيرة ، طور العلماء طرقا جديدة لاستخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لاشتقاق خلايا RPE. على الرغم من أن هذه التقنية لها إمكانات خاصة لعلاج اضطرابات RPE الموروثة ، إلا أنها تستغرق وقتا طويلا وعادة ما تتطلب عدة أشهر لتوليد خلايا RPE الناضجة10. للتغلب على هذه المشاكل ، نقدم هنا بروتوكولا سهل المتابعة لعزل وزراعة خلايا RPE عالية النقاء في المختبر بشكل روتيني. في ظل ظروف الثقافة المناسبة ، يمكن لهذه الخلايا عرض وظائف RPE النموذجية وإظهار أشكال RPE النموذجية. لذلك ، يمكن أن توفر طريقة الاستزراع هذه نموذجا جيدا لفهم فسيولوجيا RPE ، ودراسة السمية الخلوية ، والتحقيق في الآليات المرضية لأمراض العين ذات الصلة ، وإجراء فحوصات الأدوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، تم وصف بروتوكول مفصل ومحسن لعزل وثقافة وتوصيف خلايا RPE من مقل عيون الخنازير ، والذي يولد نموذجا جيدا للتوصيف المختبري لخلايا RPE ودراسات الاضطرابات المتعلقة ب RPE. تم وصف طرق عزل RPE عن عيون الإنسان والفأر والفئران سابقا23،24،25. ومع ذ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون إظهار امتنانهم واحترامهم لجميع الحيوانات التي تساهم بخلاياها في هذه الدراسة. تم دعم هذه الدراسة جزئيا من خلال منح من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2019YFA0111200 ، Yi Liao و Yuan Gao و Grant nos. 2018YFA0107301 ، Wei Li). يشكر المؤلفون Jingru Huang و Xiang You من المختبر المركزي ، كلية الطب ، جامعة شيامن على الدعم الفني في التصوير البؤري.
Materials
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | – | – | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
Riferimenti
- Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration. Redox Biology. 37, 101781 (2020).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. Gene therapy for retinitis pigmentosa. Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).
- den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Smith, D. T. Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino. The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- D’Antonio-Chronowska, A., D’Antonio, M., Frazer, K. A. In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE). Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- . Scientific, T Available from: https://www.thermofisher.cn/document-connect/document (2022)
- . Toyota Available from: https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf (2022)
- . Abcam Available from: https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol (2022)
- . Zeiss Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals (2022)
- . Cell Signal Technology Available from: https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western (2022)
- Wang, S., et al. Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).
- Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Physiology and function of the tight junction. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).
- Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix. Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).
- Sonoda, S. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
