Первичная культура пигментных эпителиальных клеток свиньи свиней
Summary
Здесь представлен простой в применении метод культивирования первичных пигментных эпителиальных клеток свиньи in vitro .
Abstract
Пигментный эпителий сетчатки (RPE) представляет собой монослой поляризованных пигментированных эпителиальных клеток, расположенный между сосудистой оболочкой и нейроретиной в сетчатке. Множественные функции, включая фагоцитоз, транспортировку питательных веществ / метаболитов, метаболизм витамина А и т. Д., Проводятся RPE на ежедневной основе. Клетки RPE представляют собой терминально дифференцированные эпителиальные клетки с небольшой регенеративной способностью или вообще без нее. Потеря клеток RPE приводит к множественным заболеваниям глаз, приводящим к нарушениям зрения, таким как возрастная макулярная дегенерация. Поэтому создание модели культуры in vitro первичных клеток RPE, которая больше напоминает RPE in vivo , чем клеточные линии, имеет решающее значение для характерных и механистических исследований клеток RPE. Учитывая тот факт, что источник глазных яблок человека ограничен, мы создаем протокол для культивирования первичных клеток Свиньи RPE. Используя этот протокол, клетки RPE могут быть легко диссоциированы от глазных яблок взрослых свиней. Впоследствии эти диссоциированные клетки прикрепляются к культуральным чашкам / вставкам, размножаются, образуя сливающийся монослой, и быстро восстанавливают ключевые особенности эпителиальной ткани in vivo в течение 2 недель. С помощью qRT-PCR показано, что первичные клетки RPE свиней экспрессируют несколько сигнатурных генов на сопоставимых уровнях с нативной тканью RPE, в то время как экспрессия большинства этих генов теряется / сильно снижается в человеческих RPE-подобных клетках, ARPE-19. Кроме того, иммунофлуоресцентное окрашивание показывает распределение плотного соединения, полярности тканей и белков цитоскелета, а также присутствие RPE65, изомеразы, критической для метаболизма витамина А, в культивируемых первичных клетках. В целом, мы разработали простой в использовании подход к культивированию первичных клеток RPE свиней с высокой чистотой и нативными характеристиками RPE, который может служить хорошей моделью для понимания физиологии RPE, изучения токсичности клеток и облегчения скрининга лекарств.
Introduction
Пигментный эпителий сетчатки (RPE) расположен между фоторецепторами и хориокапиллярисом во внешнем слое сетчатки1 с несколькими функциями, включая формирование гематорезитарного барьера, транспортировку и обмен питательными веществами и метаболитами сетчатки, рециркуляцию витамина А для поддержания нормального зрительного цикла, а также фагоцитоз и клиренс наружных сегментов фоторецепторов (POSs)2,3 . Поскольку POS требуют постоянного самообновления для генерации зрения, клетки RPE должны непрерывно поглощать отделенные POS для поддержания гомеостаза сетчатки4. Таким образом, дисфункция RPE приводит ко многим ослепляющим заболеваниям глаз, таким как возрастная макулярная дегенерация (AMD)4, пигментный ретинит (RP)5, врожденный амавроз Лебера6, диабетическая ретинопатия7 и т. Д. До сих пор точный патогенез большинства этих заболеваний остается неуловимым. В результате создается клеточная культура RPE для изучения клеточной биологии RPE, патологических изменений и основных механизмов.
Как простейшая модель для изучения клеточной биологии, культура клеток RPE была начата еще в 1920-хгодах 8. Хотя ARPE-19 широко используется в качестве клеток RPE, потеря пигментации, морфология булыжника и, особенно, барьерные функции в этой клеточной линии вызывают много опасений9. Для сравнения, культура первичных клеток RPE человека предлагает более реалистичный сценарий физиологических и патологических исследований9. Однако относительно ограниченная доступность ограничивает их использование, и этические проблемы всегда существуют. Кроме того, несколько групп использовали мышиные модели для культивирования клеток RPE. Однако размер мышиного глаза невелик, и для одной культуры обычно требуется много мышей, что неудобно9. Недавно ученые разработали новые методы использования эмбриональных стволовых клеток человека или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для получения клеток RPE. Хотя этот метод имеет особый потенциал для лечения наследственных нарушений RPE, он занимает много времени и обычно требует нескольких месяцев для создания зрелых клеток RPE10. Чтобы преодолеть эти проблемы, здесь мы вводим простой в использовании протокол для регулярного выделения и культивирования клеток RPE высокой чистоты в лаборатории. При подходящих условиях культивирования эти клетки могут демонстрировать типичные функции RPE и демонстрировать типичные морфологии RPE. Таким образом, этот метод культивирования может обеспечить хорошую модель для понимания физиологии RPE, изучения цитотоксичности, исследования патологических механизмов связанных глазных заболеваний и проведения скринингов лекарств.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь был описан подробный и оптимизированный протокол для выделения, культивирования и характеристики клеток RPE из глазных яблок свиней, который генерирует хорошую модель для характеристики in vitro клеток RPE и исследований расстройств, связанных с RPE. Методы выделения РПЭ из глаз че…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить свою благодарность и уважение всем животным, вносящим свои клетки в это исследование. Это исследование было частично поддержано грантами Национальной ключевой программы исследований и разработок Китая (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao и Grant Nos. 2018YFA0107301, Wei Li). Авторы благодарят Jingru Huang и Xiang You из Центральной лаборатории, Школы медицины, Сямыньского университета за техническую поддержку в конфокальной визуализации.
Materials
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | – | – | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
Riferimenti
- Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration. Redox Biology. 37, 101781 (2020).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. Gene therapy for retinitis pigmentosa. Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).
- den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Smith, D. T. Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino. The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- D’Antonio-Chronowska, A., D’Antonio, M., Frazer, K. A. In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE). Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- . Scientific, T Available from: https://www.thermofisher.cn/document-connect/document (2022)
- . Toyota Available from: https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf (2022)
- . Abcam Available from: https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol (2022)
- . Zeiss Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals (2022)
- . Cell Signal Technology Available from: https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western (2022)
- Wang, S., et al. Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).
- Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Physiology and function of the tight junction. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).
- Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix. Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).
- Sonoda, S. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
