ブタ網膜色素上皮細胞の初代培養
Summary
ここでは、初代ブタ網膜色素上皮細胞を 試験管内で 培養するためのわかりやすい方法が提示されている。
Abstract
網膜色素上皮(RPE)は、網膜の脈絡膜と神経網膜の間に位置する偏光色素上皮細胞の単層です。食作用、栄養素/代謝物輸送、ビタミンA代謝などを含む複数の機能がRPEによって日常的に行われています。RPE細胞は、再生能力がほとんどまたはまったくない最終分化上皮細胞です。RPE細胞の喪失は、加齢黄斑変性症などの視覚障害につながる複数の眼疾患をもたらします。したがって、細胞株よりもin vivoのRPEによく似た初代RPE細胞のin vitro培養モデルの確立は、RPE細胞の特徴的かつ機構的な研究にとって重要です。ヒトの眼球の供給源が限られていることを考慮して、我々は初代ブタRPE細胞を培養するためのプロトコルを作成します。このプロトコルを使用することにより、RPE細胞は成体のブタ眼球から容易に解離することができる。その後、これらの解離した細胞は培養皿/インサートに付着し、増殖してコンフルエントな単層を形成し、in vivoで上皮組織の重要な特徴を2週間以内に迅速に再確立します。qRT-PCRにより、初代ブタRPE細胞は、天然RPE組織と同等のレベルで複数のシグネチャ遺伝子を発現する一方で、ヒトRPE様細胞ARPE-19では、これらの遺伝子のほとんどの発現が失われたり、大幅に減少したりすることが実証されています。さらに、免疫蛍光染色は、培養初代細胞におけるタイトジャンクション、組織極性、細胞骨格タンパク質の分布、およびビタミンA代謝に重要なイソメラーゼであるRPE65の存在を示しています。全体として、高純度でネイティブなRPE機能を備えた初代ブタRPE細胞を培養するためのわかりやすいアプローチを開発し、RPE生理学を理解し、細胞毒性を研究し、薬物スクリーニングを容易にするための優れたモデルとして役立つ可能性があります。
Introduction
網膜色素上皮(RPE)は、網膜1の外層の光受容体と脈絡毛細血管の間に位置し、血液網膜関門の形成、栄養素と網膜代謝物の輸送と交換、正常な視覚サイクルを維持するためのビタミンAのリサイクル、脱落した光受容体外側セグメント(POS)の食作用とクリアランスなど、複数の機能を持っています2,3。.POSは視力を生成するために絶え間ない自己複製を必要とするため、RPE細胞は網膜の恒常性を維持するために剥離したPOSを継続的に飲み込む必要があります4。したがって、RPE機能障害は、加齢黄斑変性症(AMD)4、網膜色素変性症(RP)5、レーバー先天性無力症6、糖尿病性網膜症7など、多くの失明性眼疾患を引き起こします。今まで、これらの病気のほとんどの正確な病因はとらえどころのないままです。その結果、RPE細胞生物学、病理学的変化、およびその根底にあるメカニズムを研究するためにRPE細胞培養が確立されます。
細胞生物学を研究するための最も単純なモデルとして、RPE細胞の培養は早くも1920年代に開始されました8。ARPE-19はRPE細胞として広く用いられているが、色素沈着の喪失、石畳の形態、特にこの細胞株におけるバリア機能は、多くの懸念を引き起こす9。それに比べて、初代ヒトRPE細胞の培養は、生理学的および病理学的研究のためのより現実的なシナリオを提供します9。ただし、可用性が比較的限られているため、使用が制限され、倫理的な問題が常に存在します。さらに、いくつかのグループは、RPE細胞を培養するためにマウスモデルを使用しました。しかし、マウスの目のサイズは小さく、1回の培養には通常多くのマウスが必要であり、これは便利ではありません9。最近、科学者は、ヒト胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を使用してRPE細胞を誘導する新しい方法を開発しました。この技術は、遺伝性RPE障害の治療に特に可能性を秘めているが、時間がかかり、通常、成熟RPE細胞を生成するのに数ヶ月を要する10。これらの問題を克服するために、ここでは、実験室で高純度RPE細胞を日常的に分離および培養するためのわかりやすいプロトコルを紹介します。適切な培養条件下では、これらの細胞は典型的なRPE機能を示し、典型的なRPE形態を示すことができます。したがって、この培養法は、RPE生理学を理解し、細胞毒性を研究し、関連する眼疾患の病理学的メカニズムを調査し、薬物スクリーニングを実施するための優れたモデルを提供することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、ブタ眼球からのRPE細胞の単離、培養、および特性評価のための詳細で最適化されたプロトコルが、RPE細胞のin vitro特性評価およびRPE関連障害研究のための優れたモデルを生成することが記載されている。ヒト、マウス、およびラットの眼からRPEを単離するための方法は、以前に記載されている23、24、25。?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、この研究で細胞に貢献しているすべての動物に感謝と敬意を表したいと思います。この研究の一部は、中国の国家重点研究開発プログラム(2019YFA0111200、Yi Liao & Yuan Gao、およびGrant nos. 2018YFA0107301、Wei Li)からの助成金によって支援されました。著者らは、共焦点イメージングの技術サポートを提供してくれた厦門大学医学部中央研究所のJingru HuangとXiang Youに感謝しています。
Materials
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | – | – | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
Riferimenti
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