Cultivo primario de células epiteliales pigmentarias de la retina porcina
Summary
Aquí, se presenta un método fácil de seguir para cultivar células epiteliales pigmentarias primarias de la retina porcina in vitro .
Abstract
El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa de células epiteliales pigmentadas polarizadas, ubicadas entre la coroides y la neuroretina en la retina. El RPE realiza diariamente múltiples funciones, incluyendo fagocitosis, transporte de nutrientes/metabolitos, metabolismo de la vitamina A, etc. Las células del EPR son células epiteliales terminalmente diferenciadas con poca o ninguna capacidad regenerativa. La pérdida de células del EPR da lugar a múltiples enfermedades oculares que conducen a la discapacidad visual, como la degeneración macular relacionada con la edad. Por lo tanto, el establecimiento de un modelo de cultivo in vitro de células primarias del EPR, que se asemeje más al EPR in vivo que a las líneas celulares, es fundamental para los estudios característicos y mecanicistas de las células del EPR. Teniendo en cuenta el hecho de que la fuente de globos oculares humanos es limitada, creamos un protocolo para cultivar células primarias de EPR porcino. Mediante el uso de este protocolo, las células RPE se pueden disociar fácilmente de los globos oculares porcinos adultos. Posteriormente, estas células disociadas se adhieren a placas / inserciones de cultivo, proliferan para formar una monocapa confluente y restablecen rápidamente las características clave del tejido epitelial in vivo dentro de las 2 semanas. Mediante qRT-PCR, se demuestra que las células primarias del EPR porcino expresan múltiples genes de firma a niveles comparables con el tejido RPE nativo, mientras que las expresiones de la mayoría de estos genes se pierden/se reducen altamente en las células humanas similares al EPR, ARPE-19. Además, la tinción de inmunofluorescencia muestra la distribución de la unión estrecha, la polaridad tisular y las proteínas del citoesqueleto, así como la presencia de RPE65, una isomerasa crítica para el metabolismo de la vitamina A, en células primarias cultivadas. En conjunto, hemos desarrollado un enfoque fácil de seguir para cultivar células primarias de EPR porcino con alta pureza y características nativas de EPR, que podría servir como un buen modelo para comprender la fisiología del EPR, estudiar las toxicidades celulares y facilitar las pruebas de detección de fármacos.
Introduction
El epitelio pigmentario de la retina (EPR) se encuentra entre los fotorreceptores y el coriocapilar en la capa externa de la retina1 con múltiples funciones, incluida la formación de la barrera hematoretiniana, el transporte e intercambio de nutrientes y metabolitos retinianos, el reciclaje de vitamina A para mantener un ciclo visual normal, y la fagocitosis y eliminación de los segmentos externos fotorreceptores (POS) desprendidos2,3 . Dado que los POS requieren una auto-renovación constante para generar visión, las células RPE necesitan engullir continuamente POS separados para mantener la homeostasis retiniana4. Por lo tanto, la disfunción del EPR da lugar a muchas enfermedades oculares cegadoras, como la degeneración macular asociada a la edad (DMAE)4, la retinitis pigmentosa (RP)5, la amaurosis congénita de Leber6, la retinopatía diabética7, etc. Hasta ahora, la patogénesis exacta de la mayoría de estas enfermedades sigue siendo difícil de alcanzar. Como resultado, el cultivo celular de EPR se establece para estudiar la biología celular del EPR, los cambios patológicos y los mecanismos subyacentes.
Como el modelo más simple para estudiar la biología celular, el cultivo de células RPE se inició ya en la década de 19208. Aunque ARPE-19 es ampliamente utilizado como células del EPR, la pérdida de pigmentación, la morfología de los adoquines y, especialmente, las funciones de barrera en esta línea celular plantean muchas preocupaciones9. En comparación, el cultivo de células RPE humanas primarias ofrece un escenario más realista para estudios fisiológicos y patológicos9. Sin embargo, la disponibilidad relativamente limitada restringe su uso y siempre existen problemas éticos. Además, varios grupos utilizaron modelos de ratón para cultivar células de EPR. Sin embargo, el tamaño del ojo del ratón es pequeño, y un solo cultivo generalmente requiere muchos ratones, lo cual no es conveniente9. Recientemente, los científicos han desarrollado nuevos métodos para utilizar células madre embrionarias humanas o células madre pluripotentes inducidas para derivar células RPE. Aunque esta técnica tiene un potencial particular para el tratamiento de trastornos hereditarios del EPR, consume mucho tiempo y generalmente requiere varios meses para generar células maduras del EPR10. Para superar estos problemas, aquí presentamos un protocolo fácil de seguir para aislar y cultivar células RPE de alta pureza en el laboratorio de forma rutinaria. En condiciones de cultivo adecuadas, estas células pueden mostrar funciones típicas del EPR y exhibir morfologías típicas del EPR. Por lo tanto, este método de cultivo puede proporcionar un buen modelo para comprender la fisiología del EPR, estudiar la citotoxicidad, investigar los mecanismos patológicos de las enfermedades oculares relacionadas y realizar exámenes de detección de drogas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, se ha descrito un protocolo detallado y optimizado para el aislamiento, cultivo y caracterización de células de EPR de globos oculares porcinos, que genera un buen modelo para la caracterización in vitro de células de EPR y estudios de trastornos relacionados con EPR. Los métodos para el aislamiento del EPR de los ojos humanos, de ratón y de rata se han descrito previamente23,24,25. Sin embargo, es difícil…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean mostrar su gratitud y respeto a todos los animales que contribuyen con sus células en este estudio. Este estudio fue apoyado en parte por subvenciones del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao y Grant nos. 2018YFA0107301, Wei Li). Los autores agradecen a Jingru Huang y Xiang You del Laboratorio Central, Facultad de Medicina de la Universidad de Xiamen por el apoyo técnico en imágenes confocales.
Materials
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | – | – | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
Riferimenti
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