Primärkultur von retinalen Pigmentepithelzellen des Schweins
Summary
Hier wird eine einfach zu befolgende Methode zur Kultivierung primärer retinaler Netzhaut-Pigmentepithelzellen in vitro vorgestellt.
Abstract
Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine Monoschicht aus polarisierten pigmentierten Epithelzellen, die sich zwischen Aderhaut und Neuroretina in der Netzhaut befindet. Mehrere Funktionen, einschließlich Phagozytose, Nährstoff- / Metabolitentransport, Vitamin-A-Stoffwechsel usw., werden vom RPE täglich durchgeführt. RPE-Zellen sind terminale differenzierte Epithelzellen mit geringer oder keiner Regenerationsfähigkeit. Der Verlust von RPE-Zellen führt zu mehreren Augenerkrankungen, die zu Sehstörungen führen, wie z. B. altersbedingte Makuladegeneration. Daher ist die Etablierung eines In-vitro-Kulturmodells von primären RPE-Zellen, das dem RPE in vivo ähnlicher ist als Zelllinien, entscheidend für die charakteristischen und mechanistischen Untersuchungen von RPE-Zellen. In Anbetracht der Tatsache, dass die Quelle menschlicher Augäpfel begrenzt ist, erstellen wir ein Protokoll zur Kultivierung primärer porciner RPE-Zellen. Durch die Verwendung dieses Protokolls können RPE-Zellen leicht von erwachsenen Augäpfeln von Schweinen getrennt werden. Anschließend heften sich diese dissoziierten Zellen an Kulturschalen / -inserts, vermehren sich zu einer konfluenten Monoschicht und stellen die Schlüsselmerkmale des Epithelgewebes in vivo innerhalb von 2 Wochen schnell wieder her. Mittels qRT-PCR wird gezeigt, dass primäre porcine RPE-Zellen mehrere Signaturgene in vergleichbaren Konzentrationen mit nativem RPE-Gewebe exprimieren, während die Expression der meisten dieser Gene in menschlichen RPE-ähnlichen Zellen, ARPE-19, verloren geht bzw. stark reduziert ist. Darüber hinaus zeigt die Immunfluoreszenzfärbung die Verteilung von Tight Junction-, Gewebepolaritäts- und Zytoskelettproteinen sowie das Vorhandensein von RPE65, einer Isomerase, die für den Vitamin-A-Stoffwechsel entscheidend ist, in kultivierten Primärzellen. Insgesamt haben wir einen einfach zu befolgenden Ansatz entwickelt, um primäre porcine RPE-Zellen mit hoher Reinheit und nativen RPE-Eigenschaften zu kultivieren, der als gutes Modell dienen könnte, um die RPE-Physiologie zu verstehen, Zelltoxizitäten zu untersuchen und Medikamentenscreenings zu erleichtern.
Introduction
Das retinale Pigmentepithel (RPE) befindet sich zwischen Photorezeptoren und Choriokapillaris in der äußeren Schicht der Netzhaut1 und hat mehrere Funktionen, einschließlich der Bildung der Blut-Retina-Schranke, des Transports und Austauschs von Nährstoffen und retinalen Metaboliten, des Recyclings von Vitamin A zur Aufrechterhaltung eines normalen Sehzyklus sowie der Phagozytose und Beseitigung der abgestoßenen äußeren Photorezeptorsegmente (POSs)2,3 . Da POSs eine ständige Selbsterneuerung erfordern, um das Sehen zu erzeugen, müssen die RPE-Zellen kontinuierlich abgelöste POSs verschlingen, um die retinale Homöostaseaufrechtzuerhalten 4. Daher führt eine RPE-Dysfunktion zu vielen erblindenden Augenerkrankungen, wie z.B. altersbedingte Makuladegeneration (AMD)4, Retinitis pigmentosa (RP)5, Lebersche kongenitale Amaurose6, diabetische Retinopathie7 usw. Bis heute ist die genaue Pathogenese der meisten dieser Krankheiten schwer fassbar. Infolgedessen wird die RPE-Zellkultur etabliert, um die RPE-Zellbiologie, pathologische Veränderungen und zugrunde liegende Mechanismen zu untersuchen.
Als einfachstes Modell zur Untersuchung der Zellbiologie wurde bereits in den 1920er Jahren mit der Kultivierung von RPE-Zellen begonnen8. Obwohl ARPE-19 als RPE-Zellen weit verbreitet ist, geben der Verlust der Pigmentierung, die Morphologie des Kopfsteinpflasters und insbesondere die Barrierefunktionen in dieser Zelllinie Anlass zur Sorge9. Im Vergleich dazu bietet die Kultur primärer humaner RPE-Zellen ein realistischeres Szenario für physiologische und pathologische Studien9. Die relativ begrenzte Verfügbarkeit schränkt jedoch ihre Nutzung ein und es gibt immer ethische Fragen. Darüber hinaus verwendeten mehrere Gruppen Mausmodelle, um RPE-Zellen zu kultivieren. Die Größe des Mausauges ist jedoch klein, und eine einzelne Kultur erfordert normalerweise viele Mäuse, was nicht praktisch ist9. In jüngster Zeit haben Wissenschaftler neue Methoden entwickelt, um menschliche embryonale Stammzellen oder induzierte pluripotente Stammzellen zur Gewinnung von RPE-Zellen zu verwenden. Obwohl diese Technik ein besonderes Potenzial für die Behandlung von erblichen RPE-Störungen hat, ist sie zeitaufwendig und benötigt in der Regel mehrere Monate, um reife RPE-Zellen zu erzeugen10. Um diese Probleme zu überwinden, stellen wir hier ein einfach zu befolgendes Protokoll vor, um hochreine RPE-Zellen routinemäßig im Labor zu isolieren und zu kultivieren. Unter geeigneten Kulturbedingungen können diese Zellen typische RPE-Funktionen aufweisen und typische RPE-Morphologien aufweisen. Daher kann diese Kulturmethode ein gutes Modell liefern, um die RPE-Physiologie zu verstehen, die Zytotoxizität zu untersuchen, pathologische Mechanismen verwandter Augenerkrankungen zu untersuchen und Medikamentenscreenings durchzuführen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wurde ein detailliertes und optimiertes Protokoll für die Isolierung, Kultur und Charakterisierung von RPE-Zellen aus Augäpfeln von Schweinen beschrieben, das ein gutes Modell für die In-vitro-Charakterisierung von RPE-Zellen und RPE-bezogene Störungsstudien erzeugt. Methoden zur Isolierung des RPE aus den Augen von Menschen, Mäusen und Ratten wurden bereitsbeschrieben 23,24,25. In einigen Laboratorien ist es …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten allen Tieren, die ihre Zellen in diese Studie einbringen, ihre Dankbarkeit und ihren Respekt entgegenbringen. Diese Studie wurde zum Teil durch Zuschüsse des National Key R&D Program of China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao und Grant No. 2018YFA0107301, Wei Li) unterstützt. Die Autoren danken Jingru Huang und Xiang You vom Central Lab, School of Medicine, Xiamen University für die technische Unterstützung bei der konfokalen Bildgebung.
Materials
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | – | – | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
Riferimenti
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