Summary
الهدف هنا هو تحديد بروتوكول للتحقيق في آليات dysbiosis في أمراض القلب والأوعية الدموية. تناقش هذه الورقة كيفية جمع عينات براز الفئران وزرعها بشكل معقم ، وعزل الأمعاء ، واستخدام طريقة "Swiss-roll" ، تليها تقنيات التلوين المناعي لاستجواب التغيرات في الجهاز الهضمي.
Abstract
يلعب dysbiosis microbiota الأمعاء دورا في الفيزيولوجيا المرضية لاضطرابات القلب والأوعية الدموية والتمثيل الغذائي ، ولكن الآليات ليست مفهومة جيدا. زرع الجراثيم البرازية (FMT) هو نهج قيم لتحديد الدور المباشر للميكروبات الكلية أو الأنواع المعزولة في الفيزيولوجيا المرضية للمرض. إنه خيار علاج آمن للمرضى الذين يعانون من عدوى المطثية العسيرة المتكررة. تظهر الدراسات قبل السريرية أن التلاعب بميكروبيوتا الأمعاء هو أداة مفيدة لدراسة العلاقة الميكانيكية بين dysbiosis والمرض. قد تساعد زراعة الجراثيم البرازية في توضيح العلاجات الجديدة التي تستهدف ميكروبيوتا الأمعاء لإدارة وعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية. على الرغم من ارتفاع معدل النجاح في القوارض ، لا تزال هناك تغييرات متعدية مرتبطة بعملية الزرع. الهدف هنا هو تقديم إرشادات في دراسة آثار ميكروبيوم الأمعاء في أمراض القلب والأوعية الدموية التجريبية. في هذه الدراسة ، تم وصف بروتوكول مفصل لجمع ومعالجة ومعالجة وزرع الجراثيم البرازية في دراسات الفئران. يتم وصف خطوات الجمع والمعالجة لكل من المتبرعين من البشر والقوارض. أخيرا ، وصفنا استخدام مزيج من تقنيات التدحرج السويسري والمناعة لتقييم التشكل الخاص بالأمعاء وتغيرات النزاهة في أمراض القلب والأوعية الدموية وآليات ميكروبيوتا الأمعاء ذات الصلة.
Introduction
اضطرابات القلب والأوعية الدموية ، بما في ذلك أمراض القلب والسكتة الدماغية ، هي الأسباب العالمية الرئيسية للوفاة1. الخمول البدني ، وسوء التغذية ، والتقدم في العمر ، وعلم الوراثة تعدل الفيزيولوجيا المرضية لهذه الاضطرابات. تدعم الأدلة المتراكمة المفهوم القائل بأن ميكروبيوتا الأمعاء تؤثر على اضطرابات القلب والأوعية الدموية والتمثيل الغذائي ، بما في ذلك مرض السكريمن النوع 2 2 والسمنة3 وارتفاع ضغط الدم4 ، والتي قد تحمل مفتاحا لتطوير مناهج علاجية جديدة لهذه الأمراض.
لا تزال الآليات الدقيقة التي تسبب بها الكائنات الحية الدقيقة الأمراض غير معروفة ، والدراسات الحالية متغيرة للغاية ، ويرجع ذلك جزئيا إلى الاختلافات المنهجية. زرع الجراثيم البرازية (FMT) هو نهج قيم لتحديد الدور المباشر للميكروبات الكلية أو الأنواع المعزولة في الفيزيولوجيا المرضية للمرض. يستخدم FMT على نطاق واسع في الدراسات على الحيوانات للحث على النمط الظاهري أو قمعه. على سبيل المثال ، يمكن تعديل السعرات الحرارية واستقلاب الجلوكوز عن طريق نقل البراز من متبرع مريض إلى متلقي صحي 5,6. في البشر، ثبت أن FMT هو خيار علاج آمن للمرضى الذين يعانون من عدوى المطثية العسيرة المتكررة 7. تظهر أدلة تدعم استخدامه في إدارة أمراض القلب والأوعية الدموية. على سبيل المثال ، FMT من العجاف إلى مرضى متلازمة التمثيل الغذائي يحسن حساسية الأنسولين8. يرتبط dysbiosis الأمعاء أيضا بارتفاع ضغط الدم في كل من الدراسات البشرية والقوارض9،10،11. FMT من الفئران التي تتغذى على نظام غذائي عالي الملح في الفئران الخالية من الجراثيم يهيئ المتلقين للالتهاب وارتفاع ضغط الدم12.
على الرغم من ارتفاع معدل نجاح FMT في القوارض ، لا تزال هناك تحديات متعدية. تشير التجارب السريرية التي تستخدم FMT لعلاج السمنة ومتلازمة التمثيل الغذائي إلى آثار ضئيلة أو معدومة على هذه الاضطرابات13،14،15. وبالتالي ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد طرق علاجية إضافية تستهدف ميكروبيوتا الأمعاء لعلاج اضطرابات القلب والأوعية الدموية. معظم الأدلة المتاحة على ميكروبيوتا الأمعاء وأمراض القلب والأوعية الدموية هي ترابطية. يناقش البروتوكول الموصوف كيفية استخدام مزيج من FMT وتقنية Swiss-rolling لإظهار كل من الارتباط بين المرض وميكروبات الأمعاء وتقييم سلامة جميع أجزاء الأمعاء بشكل مباشر16،17،18.
الهدف العام من هذه الطريقة هو توفير إرشادات لدراسة آثار ميكروبيوم الأمعاء في أمراض القلب والأوعية الدموية التجريبية. يوفر هذا البروتوكول مزيدا من التفاصيل والاعتبارات الرئيسية في التصميم التجريبي لتعزيز الترجمة الفسيولوجية وزيادة دقة النتائج واستنساخها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات بجامعة فاندربيلت على جميع الإجراءات الموضحة في هذه المخطوطة. تم إيواء الفئران الذكور C57B1 / 6 في عمر 3 أشهر ، والتي تم شراؤها من مختبر جاكسون ، ورعايتها وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر.
1. جمع وتخزين ومعالجة عينات البراز البشري
- جمع عينة البراز ، وذلك باستخدام حاوية معقمة إذا كان الموضوع في العيادة. برد عينات البراز في درجة حرارة 4 درجات مئوية خلال 36 ساعة من جمعها حتى تصبح جاهزة للمعالجة. بدلا من ذلك ، اجمع عينات البراز باستخدام أداة متاحة تجاريا لاستقرار الحمض النووي بسهولة وممتدة في درجة الحرارة المحيطة ، خاصة للاستخدام المنزلي.
- عقم غطاء الدخان على مستوى السلامة الحيوية بمحلول مبيض بنسبة 10٪ ، أو مطهر آخر معتمد من وكالة حماية البيئة.
- أخرج البراز من التخزين البارد وادخله إلى غطاء الدخان ؛ استخدم ملعقة يمكن التخلص منها لعمل ~ 1 جرام من القسامات وتخزينها في فريزر -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة تماما للمعالجة.
- تخلص من جميع العناصر التي يمكن التخلص منها في سلة المهملات البيولوجية. قم بتطهير جميع الأسطح (غطاء المحرك وأي أسطح يلمسها المعالج) والعناصر التي يتم إزالتها من الغطاء.
2. جمع معقم من عينات براز الفئران
ملاحظة: استخدم تقنيات التعقيم ، بما في ذلك الأدوات المعقمة.
- القتل الرحيم للفأر عن طريق الاختناق CO2 . رش الصدر وجوانب الماوس مع الإيثانول 70 ٪ وفتح بعناية الجلد والتجويف البريتوني لفضح الجهاز الهضمي.
- اعزل الأعور واستخدم مقصا جراحيا معقما لقطعه إلى نصفين. لفترة وجيزة ، فضح الأعور وقطع 0.5 سم بالقرب من الدقاق و 0.5 سم بعيدا عند تقاطعه مع القولون. انقل الأعور المعزول إلى طبق بتري معقم.
- استخدم ملعقة معقمة لنقل محتوى cecal إلى أنابيب معقمة ، وتخزين القسامات في فريزر -80 درجة مئوية19.
ملاحظة: نظرا لأن غالبية البكتيريا في الأمعاء هي لاهوائية ، فإن التعرض للأكسجين قد يتلف أو يقتل الكائنات الحية أثناء إجراء العزل في جو الغرفة. وبالتالي ، يجب عزل عينات البراز في الغرف اللاهوائية للحفاظ على صلاحية البكتيريا.
3. زرع البراز
- أعد تعليق الكريات البرازية الطازجة أو المجمدة سابقا في محلول ملحي معقم بنسبة 1:20 (وزن: فيديو) ودوامة حتى تتجانس.
- مرر التجانس من خلال مرشح نايلون المسام 30 ميكرومتر لإزالة الجسيمات الكبيرة. أجهزة الطرد المركزي في 79 × غرام لمدة 5 دقائق وجمع طاف لاستخدامها في زرع.
- التجويف الفموي 100 ميكرولتر من الملاط لكل فأر مستلم خال من الجراثيم لمدة 3 أيام متتالية ، يليه التجويف كل 3 أيام لمدة 2 أسابيع. استخدم الفئران التقليدية لدراسة آليات ميكروبيوتا الأمعاء إذا تم علاجها أولا بالمضادات الحيوية للقضاء على الجراثيم المتوطنة لدى المتلقي. على سبيل المثال، يجب تطبيق سيفترياكسون (400 ملغ/كغ) يوميا لدى الفئران المتلقية لمدة 5 أيام متتالية عن طريق التزويج الفموي قبل تجويف الملاط البرازي.
ملاحظة: تشير الدراسات إلى أن ما لا يقل عن أسبوعين من هذا العلاج ضروري لاستنباط تغيرات القلب والأوعية الدموية ، بما في ذلك ضغط الدم20. - تأكد من أن الفئران المتلقية الخالية من الجراثيم يتم وضعها في مكان واحد في عوازل غشاء gnotobiotic وتغذيتها بالطعام والماء المعقمين.
4. قياسات ضغط الدم الانقباضي
ملاحظة: تم زرع الفئران Gnotobiotic التي تلقت FMT من الفئران C57Bl / 6 ذات الإيواء التقليدي البالغ من العمر 3 أشهر بمضخات صغيرة تناضحية (Alzet ، موديل 2002) لتسريب جرعة منخفضة من الأنجيوتنسين II (140 نانوغرام / كجم / دقيقة) لمدة أسبوعين. تم مراقبة ضغط الدم أسبوعيا عن طريق الكفة الخلفية. تم الإبلاغ سابقا عن بروتوكول زرع المضخات الصغيرة التناضحية21. تم تنفيذ الكفة الخلفية كما هو موجز بإيجاز أدناه. طريقة غير جراحية لقياس ضغط الدم ، مثل الكفة الخلفية ، مناسبة لدراسات FMT في الفئران gnotobiotic. تم وصف الخطوات التفصيلية حول كيفية أداء الكفة الخلفية سابقا22.
- باختصار ، استرجع الفئران من عوازل gnotobiotic وقم بتسخين منصة آلة الكفة الخلفية وحامل الماوس.
- ضع الفئران الواعية في قيود على المنصة الساخنة واجمع ثلاث جولات على الأقل من قياسات الضغط الانقباضي باستخدام تخطيط التحجم بكفة الذيل. قم بتنفيذ الخطوات التالية أدناه في 3 أيام متتالية قبل أيام القياس المناسبة ، لتدريب الفئران على ضبط النفس من أجل تقليل التوتر.
- ضع الماوس برفق في الحامل المسخن مسبقا واترك الذيل بالخارج. قم بلصق الجزء العلوي بعناية دون الضغط عليه ، حتى لا تضغط على الماوس.
- اسمح للماوس بالراحة في الحامل ؛ ضعها على المنصة لمدة 3-5 دقائق مغطاة بورقة للتأقلم.
- متوسط القياسات من جميع الجولات لمتوسط الضغط الانقباضي لكل.
5. تقييم FMT لتغيرات القلب والأوعية الدموية
- بعد قياس ضغط الدم ، القتل الرحيم للفئران وجمع محتويات cecal بشكل معقم ، كما هو موضح في القسم 2.
- حصاد الأمعاء والأنسجة الأخرى ، بما في ذلك القلب والشريان الأورطي والكبد والشرايين المساريقية والكلى ، لفحص دور ميكروبيوتا الأمعاء في صحة القلب والأوعية الدموية. لحصاد الأنسجة ، حدد موقع الأنسجة في الماوس واستخدم المقص لاستئصالها.
- قم بإجراء تحليل تسلسل metagenomic على عينات البراز / محتويات cecal التي تم جمعها من الفئران المانحة والمتلقية لتأكيد تطعيم ميكروبيوتا الأمعاء بعد FMT23. أول دليل على الاستعمار الناجح للميكروبات هو تأكيد أن ميكروبيوتا المتبرع والمتلقي متشابهة.
- استخدم تقنية Swiss-roll (انظر القسم 6) على الأنسجة المعوية المحصودة ، إلى جانب التلوين المناعي والأنسجة لفحص تغيرات التعبير المورفولوجي والخلوي24.
6. جعل الأمعاء الأمعاء السويسرية لفات
- اليوم 1
- في فأر القتل الرحيم بشكل صحيح مع رش 70 ٪ من الإيثانول ، تشريح أمعاء الفأر من الجانب الشرجي (ثابت في خلف الصفاق) إلى جانب المعدة. ضع كامل الجهاز الهضمي المعزول في طبق بتري يحتوي على محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). امسك الطرف القريب برفق من نهاية المعدة وقم بإزالة الدهون المحيطة والأنسجة الضامة باليد.
- عزل الأمعاء الدقيقة (cephalad من الزائدة الدودية) وجعل متعرج من النوع Z مع كل طول. ثم ، قطع للحصول على الاثني عشر ، الصائم ، والدقاق على التوالي ، كما هو موضح سابقا25. عزل القولون عن طريق قطع قسم الأمعاء أسفل الأعور.
- قطع الاثني عشر ، الصائم ، الدقاق ، والقولون.
- اغسل وغسل الأمعاء من الداخل باستخدام PBS مع حقنة وإبرة بطرف كروي ، حتى لا تمزق الأمعاء.
- ضع القناة الهضمية على ورق الترشيح. قم بتسمية الورقة باسم القسم (على سبيل المثال ، الاثني عشر) ثم "P" في الزاوية العلوية اليمنى للقريب أو "D" للبعيد في الزاوية السفلية اليمنى.
- قطع القناة الهضمية طوليا بمقص طرف الكرة. افتح القناة الهضمية على ورق الترشيح. اغسل مع المزيد من برنامج تلفزيوني حسب الحاجة.
- شطيرة القناة الهضمية بين ورقتي ترشيح. تدبيس أوراق الترشيح في أربع نقاط / زوايا بالقرب من القناة الهضمية.
- نقع في محلول عازل محايد 10 ٪ من الفورمالين (4.0 غرام من فوسفات الصوديوم ، أحادي القاعدة ، 6.5 غرام من فوسفات الصوديوم ، ثنائي القاعدة ، 100 مل من 37 ٪ الفورمالديهايد ، 900 مل من الماء المقطر). رج العبوة باستخدام متأرجح المنصة عند 5 دورات في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
- اليوم 2
- تحضير 2 ٪ من الأغاروز في الماء المقطر والحرارة مع شريط التحريك في دورق مغطى بورق الألمنيوم.
- استرجاع الأنسجة; قم بتجريد ورق الترشيح العلوي. لف القناة الهضمية من الجانب القريب بحيث يذهب الجانب القريب إلى الداخل أولا ، وتدحرج إلى الداخل بحيث يكون التجويف بالداخل على الشريحة أيضا. دبوس بإبرة 30 جرام أو اثنتين ، حسب الحاجة.
- نضح 1 مل من الأغاروز باستخدام ماصات نقل الخريجين التي تستخدم لمرة واحدة ، واسكب الأغاروز على قسم الأمعاء المدلفن على سطح مستو مع تجنب فقاعات الهواء في الأنسجة.
- دع الأغاروز يبرد ويتصلب. استخدم شفرة حلاقة لتقليم الأغاروز الإضافي حول قسم الأنسجة.
- ضع أقسام الأمعاء في أشرطة معالجة الأنسجة / التضمين (أكبر من تلك العادية لاستيعاب الارتفاع المتزايد بسبب الأغاروز). نقع في 70٪ من الإيثانول عند 4 درجات مئوية.
- تحضير شرائح الأنسجة المضمنة في البارافين والمضي قدما في التلوين المناعي ، كما هو موضح أدناه.
7. التلوين المناعي للأمعاء المعوية
- إزالة البارافين
- تمر عبر الحمامات التالية مع شرائح في رف: الزيلين لمدة 3 دقائق ، الزيلين الطازج مرة أخرى لمدة 3 دقائق ، الزيلين مع الإيثانول بنسبة 100٪ (1: 1) لمدة 3 دقائق ، 95٪ إيثانول لمدة 3 دقائق ، 70٪ إيثانول لمدة 3 دقائق ، و 50٪ إيثانول لمدة 3 دقائق.
- شطف بلطف بماء الصنبور الجاري البارد. تخزينها في حمام من ماء الصنبور.
- استرجاع المستضد
- بعد إزالة البارافين ، قم بغلي الشرائح في رف في حمام من محلول استرجاع المستضد (0.01M ثنائي هيدرات سترات الصوديوم عند درجة الحموضة 6 و 0.05٪ Tween-20) عند 100 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- تشغيل تحت ماء الصنبور البارد.
- تلطيخ
- قم بإزالة الشرائح من الحمام وضع المنديل ووجهه لأعلى في صندوق منزلق مع مناديل معملية مبللة / مناشف ورقية في الأسفل. ارسم مخططا تفصيليا حول الأنسجة باستخدام قلم تحديد كاره للماء.
- أسقط محلول ملحي مخزن من Tris (TBS) + 0.025٪ Triton X-100 على المنديل واحتضانه لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة.
- كتلة مع TBS + 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) + 1٪ ألبومين مصل بقري (BSA) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. اقلب الشرائح على جانبها وقم بإزالة المخزن المؤقت للحظر على مسح المختبر.
- أضف محلول الأجسام المضادة الأولي واحتضانه عند 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل أو طوال الليل. يغسل برفق باستخدام TBS + 0.025٪ Triton X-100 عن طريق سحب ~ 200 ميكرولتر برفق فوق القسم.
- أضف محلول الأجسام المضادة الثانوي واحتضانه لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. شطف الشرائح 3 × 5 دقائق مع TBS عن طريق الشطف مع ماصة ، كما في الخطوة 7.3.4.
- جبل مع تصاعد المتوسطة وغطاء الغطاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم تلخيص الخطوات الموضحة أعلاه في الشكل 1. يتم إعادة تعليق محتويات الفئران أو البراز البشري في محلول ملحي معقم لإعداد ملاط لإعطائه للفئران الخالية من الجراثيم (100 ميكرولتر) عن طريق التزويج ، أولا لمدة 3 أيام متتالية ، ثم مرة واحدة كل 3 أيام. في نهاية البروتوكول ، يتم قياس ضغط الدم بطريقة الكفة الخلفية ، ويتم القتل الرحيم للفئران ، ويتم حصاد الأنسجة لتقييم التغيرات في ميكروبات الأمعاء والتغيرات القلبية الوعائية والتمثيل الغذائي.
تتمثل الخطوة الرئيسية في اختيار الجراثيم في التأكد من وجود النمط الظاهري للمرض في المتبرع ويرتبط بتغيرات خلل الخلق. على سبيل المثال ، يرتبط النظام الغذائي عالي الملح ارتباطا وثيقا ب dysbiosis وضعف القلب والأوعية الدموية. استخدمت هذه الدراسة متبرعا بالفئران تم تغذيته بنظام غذائي بنسبة 8٪ كلوريد الصوديوم. تضمنت التغييرات في ميكروبيوتا الأمعاء استجابة لارتفاع الملح انخفاضا في التنوع البيولوجي البكتيري (الشكل 2 أ) ، والتي تجمعت بشكل منفصل عن ميكروبيوتا الملح الطبيعية (الشكل 2 ب). كما زادت نسبة Firmicutes / Bacteroidetes (الشكل 2C) ، مما يشير إلى تغيرات عالية في الجراثيم التي يسببها الملح (معدلة من Ferguson et al.12).
لتحديد دور dysbiosis الناجم عن الملح العالي في الاستعداد لارتفاع ضغط الدم ، تم إجراء FMT من الفئران التي تتغذى على الملح العالي إلى الفئران الخالية من الجراثيم وتقييم استجابات ضغط الدم لجرعة منخفضة من الأنجيوتنسين II (Ang II). تم استخدام الفئران الذكور C57BL / 6 في عمر 3 أشهر في هذه الدراسة. تم زرع الفئران المتلقية مع مضخات صغيرة تناضحية لإدارة جرعة منخفضة مستمرة من Ang II (140 نانوغرام / كجم /) لمدة 2 أسابيع في الفئران. أظهرت الفئران التي تلقت FMT من متبرعين يتغذون على نسبة عالية من الملح زيادة كبيرة في ضغط الدم مع علاج Ang II مقارنة بمتلقي ميكروبات الملح العادية (الشكل 3). تشير هذه النتيجة إلى أن FMT هيأت الفئران المتلقية لتطوير ارتفاع ضغط الدم12. تم الإبلاغ عن تفاصيل حول بروتوكول الكفة الذيل في القوارض سابقا12,26.
تساهم ميكروبيوتا الأمعاء خلل التخلق في المرض جزئيا بسبب جدار الأمعاء الملتهب والمتسرب. وبالتالي ، يمكن استخدام فحص جدار الأمعاء عن طريق الكيمياء المناعية لاستجواب التغييرات في مناطق معينة من الأمعاء في أي حالة مرضية حتى بعد FMT. يوضح الشكل 4 أنه يمكننا إجراء الكيمياء الهيستولوجية المناعية على الدقاق باستخدام تقنية Swiss-roll وعلامات البقع المختلفة ، مثل الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) ، وثلاثي الألوان لماسون ، وعلامات الخلايا المناعية مثل anti-CD3 و anti-CD68. ، كما هو موضح سابقا 12 ، و apolipoprotein الذكاء الاصطناعي (الذكاء الاصطناعي) ، والتي تراكمت في الدقاق في الفئران البروتينية (الشكل 4).
الشكل 1: شكل يلخص تصميم البروتوكول. تستخدم عينات البراز التي تم جمعها من موضوع بشري أو فأر تقليدي لزرعها في الفئران الخالية من الجراثيم. الاختصارات: FMT = زرع الجراثيم البرازية. BP = ضغط الدم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الفئران التي تتبع نظاما غذائيا عالي الملح تظهر dysbiosis ميكروبيوتا الأمعاء. (أ) تقدير التنوع البيولوجي للأنواع في محتوى سيكال تم الحصول عليه من الفئران على وجبات الملح العادي (الأسود) والملح العالي (الأحمر). (ب) يظهر القياس متعدد الأبعاد غير المتري أن البكتيريا من فئران الحمية ذات الملح العادي والملح العالي تشكل مجموعات منفصلة. (ج) يرتبط الملح المرتفع بزيادة نسبة Firmicutes / Bacteroidetes. (***p < 0.0001 ، باستخدام اختبارات t للطالب غير المقترنة ثنائية الذيل). هذا الرقم مقتبس من Ferguson et al.12. الاختصارات: NMDS = القياس متعدد الأبعاد غير متري ؛ NS = ملح عادي ؛ HS = ملح عالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: FMT من الفئران التي تتغذى على نسبة عالية من الملح يهيئ الفئران الخالية من الجراثيم لارتفاع ضغط الدم الناجم عن الأنجيوتنسين II. ارتبط نقل ميكروبيوتا الأمعاء التي يسببها الملح العالي بزيادة الضغط الانقباضي بشكل ملحوظ في الفئران الخالية من الجراثيم مقارنة بالفئران التي تلقت ميكروبات الأمعاء المالحة الطبيعية. هذا الرقم مقتبس من Ferguson et al.12. الاختصارات: FMT = زرع الجراثيم البرازية. BP = ضغط الدم. أنج الثاني = أنجيوتنسين الثاني ؛ NS = ملح عادي ؛ HS = ملح عالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صورة الكيمياء الهيستولوجية المناعية توضح كيفية تقييم التغيرات الواسمة للمرض في الأمعاء. صور تمثيلية تظهر بقعة الذكاء الاصطناعي البروتين الشحمي في الإيليا التي تم الحصول عليها من الفئران التي كانت تعاني من فرط شحميات الدم بدون (أ) أو مع (ب) بروتينية. التكبير: 5x بمقياس 200 ميكرومتر (A ، B ، يسار) ؛ 10x بمقياس 100 ميكرومتر (أ ، ب ، يمين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتمثل أحد الأساليب القيمة لدراسة الدور السببي لميكروبيوتا الأمعاء في أمراض القلب والأوعية الدموية والتمثيل الغذائي في نقل الجراثيم الكلية أو اختيار الأنواع ذات الأهمية إلى الفئران الخالية من الجراثيم. هنا ، نصف بروتوكولات لجمع عينات البراز من البشر والفئران الموجودة تقليديا في الفئران الخالية من الجراثيم لدراسة دور ميكروبيوتا الأمعاء في اضطرابات ارتفاع ضغط الدم.
في الفئران ، نستخدم محتويات cecal التي تم جمعها بشكل معقم ومعالجتها في غرفة هوائية ، وفي البشر ، نجمع البراز. يمكن إجراء FMT على الفور بينما لا تزال العينة طازجة أو مجمدة في النيتروجين السائل وتحفظ عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام. إذا تعذر تجميد العينة على الفور ، كما هو الحال في حالة البشر الذين يجمعون عيناتهم في المنزل ، فمن المهم استخدام مادة حافظة للأحماض النووية مثل الإيثانول. معظم البكتيريا في الأمعاء هي اللاهوائية. عند تحضير عينات البراز للزراعة ، يجب أن يتم ذلك بسرعة لتجنب تعريض البكتيريا للبيئات الهوائية ، لأن هذا قد يقلل من الفعالية بسبب انخفاض كمية اللاهوائية في الخليط27. بالنسبة للدراسة الطولية ، يجب إجراء التسلسل الميتاجينومي للعينات معا لتجنب تأثيرات الدفعات. يمكن أن تأتي عينات FMT من متبرع واحد أو عدة مانحين يتم تجميعها معا ثم توزيعها على عدة متلقين عبر المجموعات التجريبية.
من الأهمية بمكان أن يتم تأكيد نجاح FMT تجريبيا قبل استكشاف الآثار الآلية. يمكن تحليل محتويات البراز أو السيكال من خلال metagenomics وأوجه التشابه التي تم تقييمها بين المتبرعين والمتلقين. ستكون النتائج المتوقعة تنوعا ميكروبيا مماثلا من خلال مؤشرات تنوع ألفا وتحليل الإحداثيات الرئيسية والملامح الوظيفية. عندها فقط يمكن استنتاج أن ميكروبيوتا الأمعاء تلعب دورا مهما في مسببات الأمراض. هذه الخطوة أكثر أهمية إذا كانت الدراسة تستخدم الفئران التقليدية التي تمت معالجتها بالمضادات الحيوية لاستنفاد الجراثيم المتوطنة. هذا لأنه إذا لم تنجح هذه الخطوة ، يمكن للبكتيريا المتلقية الباقية على قيد الحياة التأثير على نتائج المرض. ومع ذلك، فإن FMT الناجح، وخاصة في الدراسات قبل السريرية، لا يؤدي دائما إلى الترجمة السريرية. وبالتالي ، من الضروري اتخاذ خطوات تأكيدية إضافية لإشراك الآليات المباشرة المتعلقة بالأمعاء في الفيزيولوجيا المرضية للمرض ، بما في ذلك التغييرات في مورفولوجيا الأمعاء باستخدام تقنية Swiss-roll الموضحة هنا.
هناك دور مباشر ثابت لتنشيط الخلايا المناعية في تطور ارتفاع ضغط الدم ، والذي يظهر من خلال دراسات النقل بالتبني28،29،30. على الرغم من أن الفئران الخالية من الجراثيم هي المعيار الذهبي في تحديد الدور السببي للميكروبات في المرض ، إلا أن النموذج قد يكون محدودا في دراسة الآليات الالتهابية لأمراض القلب والأوعية الدموية. الفئران الخالية من الجراثيم لديها نظام مناعي غير متطور ، مما يقلل من أهميتها الانتقالية في دراسة التفاعل بين ميكروبيوتا الأمعاء والالتهاب. بدلا من ذلك ، يمكن تعديل هذا البروتوكول لزرع عينات البراز في الفئران التقليدية ، بعد استنفاد الجراثيم باستخدام المضادات الحيوية أو تطهير الأمعاء باستخدام البولي إيثيلين جلايكول31،32. إن FMT في الفئران التقليدية المعالجة مسبقا بالمضادات الحيوية يلغي الحاجة إلى بيئة مكلفة وخاضعة للرقابة الصارمة ومطلوبة للحفاظ على الفئران الخالية من الجراثيم. توضح الأدلة الحالية أن اختيار المضادات الحيوية ، سواء كانت واحدة أو مجموعة ، وبروتوكول العلاج يختلف بين الدراسات33،34،35. سيحدد اختيار المضادات الحيوية أنواع البكتيريا التي سيتم استنفادها ، بسبب الاختلافات في آليات العمل ، وبالتالي تؤثر على النمط الظاهري. وبالتالي ، يجب أن يأخذ التصميم التجريبي في الاعتبار أنواع البكتيريا المعروفة بالتوسط في النمط الظاهري ، ويجب اختيار المضادات الحيوية واسعة الطيف ، وطريقة الإعطاء ، والنظام وفقا لذلك.
هذا البروتوكول له حدوده. يتم الاحتفاظ بالفئران الخالية من الجراثيم في مرافق gnotobiotic ، مما يجعل الإجراءات التجريبية المتعلقة بدراسة أمراض القلب والأوعية الدموية صعبة. على سبيل المثال ، القياس الإشعاعي عن بعد هو الطريقة القياسية الذهبية لقياس ضغط الدم ، ولكنه يتضمن إجراءات جراحية شديدة التوغل. هذا ليس عمليا للفئران المحصنة والساذجة الخالية من الجراثيم. وبالتالي ، يتم استخدام الكفة الخلفية غير الغازية لهذا الغرض ، لتجنب التلوث الميكروبي12. عادة ، للحصول على قياسات دقيقة نسبيا باستخدام تخطيط التحجم بكفة الذيل ، يتم تدريب الحيوانات والتأقلم مع المنصة قبل قياسات الضغط الانقباضي. في دراسات FMT الخالية من الجراثيم ، يجب على الباحثين التفكير في جمع ومتوسط قياسات متعددة36.
قد تظهر هذه التحديات في نقاط نهاية أخرى تتجاوز ضغط الدم. على سبيل المثال ، غالبا ما تتطلب الدراسات التي تستكشف الجوانب السلوكية لأمراض القلب والأوعية الدموية معالجة متكررة وتعرضا خارجيا. أظهرت دراسة تستكشف آثار اتباع نظام غذائي غني بالألياف في الخلل المعرفي والاجتماعي الناجم عن السمنة لدى الأمهات نجاح FMT في الفئران التقليدية التي تمت معالجتها بالمضادات الحيوية37. قد تأخذ الدراسات التي تستكشف استجابات القلب والأوعية الدموية الطولية في الاعتبار FMT في الفئران ذات الإيواء التقليدي.
بالإضافة إلى قياس ضغط الدم ، يمكن القتل الرحيم للحيوانات وحصاد الأنسجة لمزيد من الفحص. والجدير بالذكر أنه يجب جمع محتويات cecal ليتم تقييمها من أجل التطعيم الناجح للميكروبات المزروعة. سيوجه هذا البروتوكول التفصيلي الباحثين في دراسة آلية ميكروبيوم الأمعاء من FMT إلى مستويات الأنسجة ، وهو قابل للتطبيق على الدراسات الوظيفية. هذا مهم لأن هناك كمية هائلة من الأدبيات المنهجية والمتاحة حاليا. لأغراض ميكانيكية ، يمكن حصاد البلازما والأمعاء والكلى والقلوب والأنسجة الأخرى للتحقيق في المسارات المعنية. ترتبط الآثار السببية لميكروبيوتا الأمعاء في المرض بالمستقلبات التي تنتجها وإطلاقها في النظام بسبب تسرب الأمعاء. يمكن تقييم صحة الأمعاء بأكملها من خلال الأساليب النسيجية والمناعية. تم استخدام تقنية Swiss-roll لإثبات تأثير مرض FMT في الفئران12,24.
لا تزال مساهمة ميكروبيوتا الأمعاء في أمراض القلب والأوعية الدموية مثل ارتفاع ضغط الدم ترابطية. هنا ، قدمنا مناهج منهجية لجمع ومعالجة وزرع البراز من البشر أو الفئران التقليدية إلى الفئران الخالية من الجراثيم. يلخص البروتوكول الممارسات والمعلمات التجريبية الإضافية للتحقيق في تحديد سبب و / أو تأثير ميكروبيوتا الأمعاء في صحة القلب والأوعية الدموية. يجب تكرار الدراسات لضمان استنساخ ودقة النمط الظاهري المطلوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لم يعلن المؤلفون عن أي تضارب في المصالح ، مالي أو غير ذلك.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من قبل منحة جائزة فاندربيلت للعلوم السريرية والانتقالية UL1TR002243 (إلى AK) من المركز الوطني لتطوير العلوم الانتقالية. منحة جمعية القلب الأمريكية POST903428 (إلى J.A.I.) ؛ ومنح المعهد الوطني للقلب والرئة والدم K01HL13049 و R03HL155041 و R01HL144941 (إلى AK) ومنحة المعاهد الوطنية للصحة 1P01HL116263 (إلى V.K.). تم إنشاء الشكل 1 باستخدام Biorender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
| Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report From the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254 (2021).
- Wu, H., et al. The gut microbiota in prediabetes and diabetes: a population-based cross-sectional study. Cell Metabolism. 32 (3), 379-390 (2020).
- Crovesy, L., Masterson, D., Rosado, E. L. Profile of the gut microbiota of adults with obesity: a systematic review. European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1251-1262 (2020).
- Avery, E. G., et al. The gut microbiome in hypertension: recent advances and future perspectives. Circulation Research. 128 (7), 934-950 (2021).
- Perez-Matute, P., Iniguez, M., de Toro, M., Recio-Fernandez, E., Oteo, J. A. Autologous fecal transplantation from a lean state potentiates caloric restriction effects on body weight and adiposity in obese mice. Scientific Reports. 10 (1), 9388 (2020).
- Zoll, J., et al. Fecal microbiota transplantation from high caloric-fed donors alters glucose metabolism in recipient mice, independently of adiposity or exercise status. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 319 (1), 203-216 (2020).
- Hvas, C. L., et al. Fecal microbiota transplantation is superior to fidaxomicin for treatment of recurrent Clostridium difficile infection. Gastroenterology. 156 (5), 1324-1332 (2019).
- Kootte, R. S., et al. Improvement of insulin sensitivity after lean donor feces in metabolic syndrome is driven by baseline intestinal microbiota composition. Cell Metabolism. 26 (4), 611-619 (2017).
- Li, J., et al. Gut microbiota dysbiosis contributes to the development of hypertension. Microbiome. 5 (1), 14 (2017).
- Shi, H., et al. Restructuring the gut microbiota by intermittent fasting lowers blood pressure. Circulation Research. 128 (9), 1240-1254 (2021).
- Zhong, H. J., et al. Washed microbiota transplantation lowers blood pressure in patients with hypertension. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 679624 (2021).
- Ferguson, J. F., et al. High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension. JCI Insight. 5 (13), 126241 (2019).
- Yu, E. W., et al. Fecal microbiota transplantation for the improvement of metabolism in obesity: The FMT-TRIM double-blind placebo-controlled pilot trial. PLoS Medicine. 17 (3), 1003051 (2020).
- Leong, K. S. W., et al. Effects of fecal microbiome transfer in adolescents with obesity: the gut bugs randomized controlled trial. JAMA Network Open. 3 (12), 2030415 (2020).
- Zhang, Z., et al. Impact of fecal microbiota transplantation on obesity and metabolic syndrome-a systematic review. Nutrients. 11 (10), 2291 (2019).
- Laubitz, D., et al. Dynamics of gut microbiota recovery after antibiotic exposure in young and old mice (a pilot study). Microorganisms. 9 (3), 647 (2021).
- Xiao, L., et al. High-fat feeding rather than obesity drives taxonomical and functional changes in the gut microbiota in mice. Microbiome. 5 (1), 43 (2017).
- Brunt, V. E., et al. Suppression of the gut microbiome ameliorates age-related arterial dysfunction and oxidative stress in mice. The Journal of Physiology. 597 (9), 2361-2378 (2019).
- Choo, J. M., Rogers, G. B. Gut microbiota transplantation for colonization of germ-free mice. STAR Protocols. 2 (3), 100610 (2021).
- Kim, T. T., et al. Fecal transplant from resveratrol-fed donors improves glycaemia and cardiovascular features of the metabolic syndrome in mice. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 511-519 (2018).
- Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
- Wang, Y., Thatcher, S. E., Cassis, L. A. Measuring blood pressure using a noninvasive tail cuff method in mice. Methods in Molecular Biology. 1614, 69-73 (2017).
- Ishimwe, J. A., et al. The gut microbiota and short-chain fatty acids profile in postural orthostatic tachycardia syndrome. Frontiers in Physiology. 13, 879012 (2022).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Laboratory Animals. 15 (1), 57-59 (1981).
- Ishimwe, J. A., Garrett, M. R., Sasser, J. M. 1,3-Butanediol attenuates hypertension and suppresses kidney injury in female rats. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 319 (1), 106-114 (2020).
- Bokoliya, S. C., Dorsett, Y., Panier, H., Zhou, Y. Procedures for fecal microbiota transplantation in murine microbiome studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711055 (2021).
- Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. Isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (145), e59124 (2019).
- Harrison, D. G., Marvar, P. J., Titze, J. M.
- Sylvester, M. A., et al. Splenocyte transfer from hypertensive donors eliminates premenopausal female protection from ANG II-induced hypertension. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (3), 245-257 (2022).
- Reikvam, D. H., et al. Depletion of murine intestinal microbiota: effects on gut mucosa and epithelial gene expression. PLoS One. 6 (3), 17996 (2011).
- Le Roy, T., et al. Comparative evaluation of microbiota engraftment following fecal microbiota transfer in mice models: age, kinetic and microbial status matter. Frontiers in Microbiology. 9, 3289 (2019).
- Sun, J., et al. Fecal microbiota transplantation alleviated Alzheimer's disease-like pathogenesis in APP/PS1 transgenic mice. Translation Psychiatry. 9 (1), 189 (2019).
- Kim, M., et al. Critical role for the microbiota in CX(3)CR1(+) intestinal mononuclear phagocyte regulation of intestinal T cell responses. Immunity. 49 (3), 151-163 (2018).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Wilde, E., et al. Tail-cuff technique and its influence on central blood pressure in the mouse. Journal of the American Heart Association. 6 (6), 005204 (2017).
- Liu, X., et al. High-fiber diet mitigates maternal obesity-induced cognitive and social dysfunction in the offspring via gut-brain axis. Cell Metabolism. 33 (5), 923-938 (2021).
