Summary
يصف البروتوكول الحالي توليد نماذج زراعة الورم 3D من الخلايا السرطانية الأولية وتقييم حساسيتها للأدوية باستخدام مقايسات صلاحية الخلية والفحوصات المجهرية.
Abstract
على الرغم من التقدم الملحوظ في فهم بيولوجيا الورم ، فإن الغالبية العظمى من أدوية الأورام المرشحة التي تدخل التجارب السريرية تفشل ، غالبا بسبب نقص الفعالية السريرية. يسلط معدل الفشل المرتفع هذا الضوء على عدم قدرة النماذج قبل السريرية الحالية على التنبؤ بالفعالية السريرية ، ويرجع ذلك أساسا إلى عدم كفايتها في عكس عدم تجانس الورم والبيئة المكروية للورم. يمكن معالجة هذه القيود من خلال نماذج الثقافة ثلاثية الأبعاد (3D) (كروية) التي تم إنشاؤها من عينات الورم البشري المشتقة من المرضى الفرديين. تمثل ثقافات 3D هذه بيولوجيا في العالم الحقيقي أفضل من خطوط الخلايا الراسخة التي لا تعكس عدم تجانس الورم. علاوة على ذلك ، تعد الثقافات ثلاثية الأبعاد أفضل من نماذج الثقافة ثنائية الأبعاد (2D) (هياكل أحادية الطبقة) لأنها تكرر عناصر بيئة الورم ، مثل نقص الأكسجة والنخر والتصاق الخلايا ، وتحافظ على شكل الخلية الطبيعية ونموها. في الدراسة الحالية ، تم تطوير طريقة لإعداد الثقافات الأولية للخلايا السرطانية من المرضى الفرديين الذين هم 3D وتنمو في كرويات متعددة الخلايا. يمكن اشتقاق الخلايا مباشرة من أورام المريض أو الطعوم الخارجية المشتقة من المريض. هذه الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع على الأورام الصلبة (مثل القولون والثدي والرئة) وهي أيضا فعالة من حيث التكلفة ، حيث يمكن إجراؤها بالكامل في مختبر نموذجي لأبحاث السرطان / بيولوجيا الخلية دون الاعتماد على معدات متخصصة. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتوليد نماذج ثقافة الورم 3D (كرويات متعددة الخلايا) من الخلايا السرطانية الأولية وتقييم حساسيتها للأدوية باستخدام نهجين متكاملين: فحص صلاحية الخلية (MTT) والفحوصات المجهرية. يمكن استخدام هذه الكرويات متعددة الخلايا لتقييم الأدوية المرشحة المحتملة ، وتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة أو الأهداف العلاجية ، والتحقيق في آليات الاستجابة والمقاومة.
Introduction
تمثل الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي مناهج تكميلية لتطوير علاجات السرطان. تسمح النماذج في المختبر بالتحكم في معظم المتغيرات التجريبية وتسهيل التحليلات الكمية. غالبا ما تكون بمثابة منصات فحص منخفضة التكلفة ويمكن استخدامها أيضا للدراسات الميكانيكية1. ومع ذلك ، فإن أهميتها البيولوجية محدودة بطبيعتها ، لأن هذه النماذج تعكس جزئيا فقط البيئة المكروية للورم1. في المقابل ، في النماذج في الجسم الحي ، مثل الطعوم الخارجية المشتقة من المريض (PDX) ، تلتقط تعقيد البيئة المكروية للورم وهي أكثر ملاءمة للدراسات الانتقالية والعلاج الفردي في المرضى (أي التحقيق في الاستجابة للأدوية في نموذج مشتق من مريض فردي)1. ومع ذلك ، فإن النماذج في الجسم الحي لا تفضي إلى مناهج عالية الإنتاجية لفحص الأدوية ، حيث لا يمكن التحكم في المعلمات التجريبية بإحكام كما هو الحال في النماذج المختبرية ولأن تطويرها يستغرق وقتا طويلا وكثيف العمالة ومكلفا 1,2.
تتوفر النماذج في المختبر منذ أكثر من 100 عام ، وكانت خطوط الخلايا متاحة لأكثر من 70 عاما3. ومع ذلك ، خلال العقود العديدة الماضية ، زاد تعقيد النماذج المتاحة في المختبر للأورام الصلبة بشكل كبير. يتراوح هذا التعقيد من نماذج الثقافة ثنائية الأبعاد (2D) (الهياكل أحادية الطبقة) التي هي إما خطوط خلايا ثابتة مشتقة من الورم أو خطوط خلايا أولية إلى الأساليب الأحدث التي تتضمن نماذج ثلاثية الأبعاد (3D)1. ضمن نماذج 2D ، هناك تمييز رئيسي بين خطوط الخلايا الثابتة والأولية4. يتم تخليد خطوط الخلايا المنشأة. لذلك ، يمكن استخدام نفس خط الخلية على مستوى العالم على مدار سنوات عديدة ، مما يسهل التعاون وتراكم البيانات وتطوير العديد من استراتيجيات العلاج من منظور تاريخي. ومع ذلك ، تتراكم الانحرافات الجينية في خطوط الخلايا هذه مع كل مرور ، مما يضر بأهميتها البيولوجية. علاوة على ذلك ، فإن العدد المحدود من خطوط الخلايا المتاحة لا يعكس عدم تجانس الأورام في المرضى 4,5. يتم اشتقاق خطوط الخلايا السرطانية الأولية مباشرة من عينات الورم المقطوعة التي تم الحصول عليها عن طريق الخزعات أو الانصباب الجنبي أو الاستئصال. لذلك ، فإن خطوط الخلايا السرطانية الأولية أكثر أهمية من الناحية البيولوجية لأنها تحافظ على عناصر البيئة المكروية للورم وخصائص الورم ، مثل السلوكيات بين الخلايا (على سبيل المثال ، الحديث المتبادل بين الخلايا السليمة والسرطانية) والأنماط الظاهرية الشبيهة بالجذع للخلايا السرطانية. ومع ذلك ، فإن القدرة المتماثلة لخطوط الخلايا الأولية محدودة ، مما يؤدي إلى ضيق وقت الثقافة ويحد من عدد الخلايا السرطانية التي يمكن استخدامها للتحليلات 4,5.
النماذج التي تستخدم ثقافات 3D أكثر صلة بيولوجيا من نماذج ثقافة 2D حيث يتم الاحتفاظ بالظروف في الجسم الحي. وبالتالي ، تحافظ نماذج ثقافة 3D على شكل الخلية الطبيعية ونموها وتكرار عناصر بيئة الورم ، مثل نقص الأكسجة والنخر والتصاق الخلايا. تشمل نماذج 3D الأكثر استخداما في أبحاث السرطان كرويات متعددة الخلايا ، وهياكل قائمة على السقالات ، وثقافات مدمجة في المصفوفة4،6،7.
يولد البروتوكول الحالي نماذج زراعة الورم 3D (كرويات متعددة الخلايا) من الخلايا السرطانية الأولية ويقيم حساسيتها للأدوية باستخدام نهجين متكاملين: مقايسة صلاحية الخلية (MTT) والفحوصات المجهرية. النتائج التمثيلية المعروضة هنا هي من سرطان الثدي والقولون. ومع ذلك ، فإن هذا البروتوكول قابل للتطبيق على نطاق واسع على أنواع الأورام الصلبة الأخرى (على سبيل المثال ، سرطان القنوات الصفراوية وسرطان المعدة والرئة والبنكرياس) وهو أيضا فعال من حيث التكلفة ، حيث يمكن إجراؤه بالكامل في مختبر نموذجي لأبحاث السرطان / بيولوجيا الخلية دون الاعتماد على معدات متخصصة. يمكن استخدام الأجسام الكروية متعددة الخلايا المتولدة باستخدام هذا النهج لتقييم الأدوية المرشحة المحتملة ، وتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة أو الأهداف العلاجية ، والتحقيق في آليات الاستجابة والمقاومة.
ينقسم هذا البروتوكول إلى ثلاثة أقسام: (1) توليد وجمع وعد الأجسام الكروية استعدادا لاستخدامها كنموذج لاختبار فعالية الدواء. (2) مقايسة MTT لتقييم فعالية الدواء على الأجسام الكروية ؛ و (3) التقييم المجهري للتغيرات المورفولوجية بعد علاج الأجسام الكروية بالأدوية كنهج آخر لتقييم فعالية الدواء (الشكل 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم جمع عينات الورم البشري المستخدمة في مزارع الخلايا السرطانية الأولية وفقا للبروتوكولات المعتمدة من مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) في مركز رابين الطبي بموافقة خطية مستنيرة من المرضى. شمل المرضى المؤهلون للمشاركة في الدراسة مرضى سرطان البالغين والأطفال من الذكور والإناث المصابين بسرطان الثدي أو القولون أو الكبد أو الرئة أو الغدد الصم العصبية أو المبيض أو البنكرياس أو أي سرطان للأطفال أو أي سرطان نقيلي. ومعيار الاستبعاد الوحيد هو الافتقار إلى القدرة على تقديم الموافقة المستنيرة.
1. توليد وجمع الكرويات
ملاحظة: يمكن إجراء عزل الخلايا السرطانية الأولية كما هو موضح بواسطة Kodak et al.8. الأهم من ذلك ، يمكن اشتقاق الخلايا السرطانية الأولية المستخدمة لتوليد الأجسام الكروية مباشرة من عينات المرضى التي تم الحصول عليها عن طريق الخزعة ، والاستئصال ، وما إلى ذلك ، أو بشكل غير مباشر باستخدام عينات الورم من نماذج xenograft المشتقة من المريض (PDX) ، كما وصفها Moskovits et al.9.
- قم بإعداد معلق أحادي الخلية لمزارع الخلايا السرطانية الأولية الملتصقة بنسبة التقاء 75٪ -100٪ عن طريق أخذ قارورة صغيرة (T25) مع ثقافة خلية أولية ملتصقة بخلية واحدة ، وإزالة وسائط زراعة الخلايا ، والغسيل باستخدام PBS ، ثم إضافة 1 مل من 1x Accutase (محلول انفصال الخلية) (انظر جدول المواد) لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- تحييد محلول Accutase عن طريق إضافة 5 مل من وسط زراعة الخلايا (وسط زراعة RPMI-1640 مكمل ب 10٪ FBS ، 1: 100 بنسلين-ستربتومايسين ، 1٪ أحماض أمينية غير أساسية ، و 1٪ L-glutamine ؛ انظر جدول المواد).
- نضح الخلايا باستخدام ماصة مصلية 10 مل ، وإيداعها في أنبوب مخروطي 15 مل. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 800 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة وسط زراعة الخلايا ، وأضف 5 مل من وسط زراعة الخلايا الطازجة فوق حبيبات الخلية ، واخلطها برفق.
- عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم10. للقيام بذلك ، خذ حصة من 50 ميكرولتر من تعليق الخلية ، وامزجها مع 50 ميكرولتر من تريبان الأزرق. عد الخلايا الحية (الخلايا السالبة للون الأزرق) ، واحسب إجمالي عدد الخلايا الحية في التعليق.
- قم بإعداد "وسيط ثقافة 3D" (وسط زراعة خلية مكمل بمصفوفة غشاء قاعدي بنسبة 5٪ ؛ انظر جدول المواد).
ملاحظة: "وسيط ثقافة 3D" يشبه السائل في درجة حرارة الغرفة. عند 37 درجة مئوية ، يصبح الاتساق أكثر شبها بالهلام (بحيث تبقى الخلايا معا) ، على الرغم من أنه لا يزال من الممكن سحبه (لأنه يحتوي على 5٪ فقط من مصفوفة الغشاء القاعدي). - حساب عدد الخلايا اللازمة للفحص والحجم الإجمالي المطلوب ؛ يجب أن يحتوي كل بئر على 2000-8000 خلية في 200 ميكرولتر من الوسط.
- قم بإعداد معلق خلية بالعدد المطلوب من الخلايا (على سبيل المثال ، 4000 خلية) في 200 ميكرولتر من "وسط الثقافة ثلاثي الأبعاد" واخلطه برفق مع الماصة لضمان توزيع متجانس.
- انقل التعليق إلى خزان ماصة. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، أضف 200 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة 96 بئرا منخفضة للغاية (انظر جدول المواد). قبل كل مجموعة من الخلايا ، امزج التعليق جيدا.
- أجهزة الطرد المركزي لوحة في 300 × غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لفرض تجميع الخلايا ، وبالتالي تحسين تجميع الخلايا ، واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية في حاضنة 5 ٪ CO2 مرطبة.
- كل 2-3 أيام ، قم بتحديث "وسيط الثقافة ثلاثية الأبعاد". قم بطرد اللوحة عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة 50٪ من الوسط برفق وتجاهله (100 ميكرولتر) ، وأضف 100 ميكرولتر من "وسيط الثقافة ثلاثية الأبعاد" الجديد لاستبدال الحل الحالي. كرر الخطوة 1.11 ، وضع اللوحة مرة أخرى في حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
ملاحظة: يجب إجراء إزالة الوسط عند تثبيت اللوحة عند 45 درجة ، ويجب جمع الوسط فقط من الجزء العلوي لتجنب تجميع الخلايا. لا ينبغي استخدام نظام شفط فراغ. يجب إضافة الوسط الطازج ببطء وبلطف حتى لا يعطل الأجسام الكروية ، التي ستبدأ بالفعل في التكون. - فحص الخلايا تحت المجهر كل 1-2 أيام لمراقبة تكوين كروية. قم بقياس قطر الأجسام الكروية المتكونة باستخدام أداة "المقياس" في برنامج التصوير (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يجب أن يكشف الفحص المجهري أولا عن أجسام مستديرة إلى بيضاوية غير منتظمة تتخذ شكلا كرويا مع تقدم الوقت11,12.- عندما يصل قطر الكرة إلى 100-200 ميكرومتر ، قم بإجراء تجارب فعالية الدواء.
ملاحظة: يتم إجراء تجارب فعالية الدواء عندما تصل الأجسام الكروية إلى هذا القطر ، حيث تتكاثر غالبية الخلايا في ذلك الوقت ، مما يؤدي إلى تقييم الاستجابة للعلاج. تحتوي الأجسام الكروية ذات القطر الأكبر على قلب وطبقة هادئة11,12 ، مما يؤدي إلى نسبة أقل من الخلايا المتكاثرة التي تستجيب للعلاج.
- عندما يصل قطر الكرة إلى 100-200 ميكرومتر ، قم بإجراء تجارب فعالية الدواء.
- لجمع الكرة ، استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لجمع الكرويات من كل بئر ، وإيداعها في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
ملاحظة: الكائنات الكروية هشة بطبيعتها وتتطلب معالجة لطيفة. عند نقل الوسط مع الأجسام الكروية إلى الأنبوب المخروطي ، أمسك الأنبوب عند 45 درجة ، وماصة ببطء على جدار الأنبوب. كرويات مرئية للعين. - قم بطرد الأنبوب المخروطي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وقم بشفط وتجاهل المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة.
- أضف 0.5 مل من وسط زراعة الخلايا ، وأعد تعليق الحبيبات جيدا ولكن برفق. تجنب صنع الفقاعات.
- قم بإجراء عد كروي باتباع الخطوات أدناه.
- استخدم لوحة 96 بئرا وارسم علامة زائد على الجانب السفلي من البئر لتقسيم البئر إلى أرباع (للمساعدة في تتبع العد).
- أضف 50 ميكرولتر من التعليق إلى البئر ، وعد الكرويات يدويا تحت المجهر (باستخدام عدسة موضوعية 10x).
- عد الكرويات في كل ربع ، واحرص على عدم مضاعفة العد ، واحسب العدد الإجمالي للكرويات في البئر.
ملاحظة: لدقة العد ، عد ما لا يقل عن 50 كرويا في البئر. إذا كان هناك أقل من 50 كرويا ، فقم بخلط التعليق برفق لضمان التوزيع المتجانس ، وعد مرة أخرى باستخدام حجم أكبر من التعليق المضاف إلى بئر جديد. بدلا من ذلك ، إذا كان هناك أقل من 50 كرويا في البئر ، فيمكن طرد الأجسام الكروية وإعادة تعليقها برفق بحجم <0.5 مل. إذا كان هناك أكثر من 100 كروي ، أضف وسط زراعة الخلايا إلى التعليق الكروي ، واخلطه برفق ، وأعد الفرز. - احسب تركيز الكرة (عدد / حجم عد كروي [μL]) ، ثم احسب العدد الإجمالي للكرويات في التعليق (تركيز كروي × الحجم الكلي).
2. مقايسة فعالية الدواء (مقايسة MTT)
ملاحظة: لمزيد من التفاصيل، يرجى الاطلاع على van Meerloo et al.13. أيضا ، بالنسبة لفحص MTT ، يجب استخدام وسيط زراعة الخلية فقط وليس "وسيط ثقافة 3D" (إضافة مصفوفة الغشاء القاعدي ليست ضرورية ويمكن أن تتداخل مع مقايسة MTT).
- في أنبوب جديد ، قم بإعداد معلق كروي بتركيز 200 كروي لكل 200 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا (وسط زراعة RPMI-1640 مكمل ب 10٪ FBS ، 1: 100 بنسلين-ستربتومايسين ، 1٪ أحماض أمينية غير أساسية ، و 1٪ L-glutamine).
- لكل علاج دوائي ، قم بإعداد مخزون من الأجسام الكروية في أنبوب سعة 15 مل. احسب الكمية اللازمة لكل دواء بعدد الآبار اللازمة للتكرار: (5-8) × 200 ميكرولتر. أضف الدواء إلى الأنبوب إلى التركيز النهائي المطلوب.
ملاحظة: يرجى الاطلاع على قسم النتائج التمثيلية فيما يتعلق بالأدوية المستخدمة في الدراسة الحالية وجرعاتها. أيضا ، يتم سرد التفاصيل التجارية للأدوية في جدول المواد.
- لكل علاج دوائي ، قم بإعداد مخزون من الأجسام الكروية في أنبوب سعة 15 مل. احسب الكمية اللازمة لكل دواء بعدد الآبار اللازمة للتكرار: (5-8) × 200 ميكرولتر. أضف الدواء إلى الأنبوب إلى التركيز النهائي المطلوب.
- نقل 200 ميكرولتر من المعلق الكروي إلى آبار صفيحة 96 بئر منخفضة للغاية ، واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2. لا تستخدم الصفوف والأعمدة الخارجية للوحة 96 بئرا للفحص ، حيث تتميز هذه الآبار بزيادة التبخر ، مما قد يؤدي إلى زيادة التباين بين التجارب المتكررة ؛ بدلا من ذلك ، أضف PBS إلى هذه الآبار.
ملاحظة: من المهم أن تكون ثقافة الكائنات الكروية متجانسة قبل أن يتم نقل الاستزراع إلى لوحة 96 بئرا. أيضا ، يجب تضمين حالة التحكم (أي الكرات غير المعالجة) في كل تجربة. - بعد احتضان الأجسام الكروية بعقار الدراسة لمدة 24-72 ساعة ، قم بطرد اللوحة عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة 170 ميكرولتر برفق من وسط زراعة الخلايا ، تاركا 30 ميكرولتر (بما في ذلك الكروية) في قاع البئر.
ملاحظة: يجب أن تتم إزالة 170 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا بعناية ، حتى لا تتم إزالة الأجسام الكروية. امسك اللوحة عند 45 درجة ، وضع يدا واحدة (ترتدي قفازا داكنا للتباين) تحت الآبار بحيث تكون الأجسام الكروية مرئية (نقاط بيضاء). - تحضير محلول MTT (0.714 مجم / مل في RPMI الخالي من الفينول ، انظر جدول المواد).
- أضف 70 ميكرولتر من محلول MTT إلى كل بئر إلى حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر لكل بئر (سيكون تركيز MTT النهائي في البئر 0.05 مجم لكل 100 ميكرولتر). بالإضافة إلى ذلك ، قم بإعداد الآبار "الفارغة" بمحلول MTT بدون خلايا.
ملاحظة: MTT حساس للضوء. لذلك ، يجب إطفاء الضوء الموجود في غطاء المحرك ، ويجب تغطية الأنبوب الذي يحتوي على محلول MTT بورق الألمنيوم. - احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2 لمدة 3-4 ساعات حتى يلاحظ تغير في لون المحلول في الآبار (اللون الأرجواني يمثل الخلايا الحية).
- عند ملاحظة التغيير ، أضف 100 ميكرولتر من محلول التوقف (0.1N HCl في الأيزوبروبانول) إلى كل بئر ، واخلط محتوى الآبار برفق دون إنشاء فقاعات.
- اقرأ امتصاص اللوحة في قارئ Fluorometer-ELISA (انظر جدول المواد) بطول موجي يبلغ 570 نانومتر وطول موجي في الخلفية يبلغ 630-690 نانومتر.
ملاحظة: إذا لم يتمكن قارئ Fluorometer-ELISA المتوفر من قراءة اللوحة ذات 96 بئرا ذات الملحقين المنخفض للغاية ، فقم بنقل محتوى كل بئر إلى لوحة 96 بئر مسطحة القاع مقابلة. - احسب صلاحية الخلية باتباع الخطوات أدناه.
- لكل بئر ، احسب "الإشارة المحددة" ("إشارة محددة" = الإشارة عند 570 نانومتر - الإشارة عند 630-690 نانومتر). ثم احسب متوسط قيمة الآبار "الفارغة" ، واطرح هذه القيمة من كل بئر.
- احسب متوسط "الإشارات المحددة" في آبار التحكم التي تحتوي على خلايا لم تتم معالجتها بعقار الدراسة ("AV-SS-unt").
- احسب صلاحية (النسبة المئوية) للخلايا في كل بئر بالنسبة للآبار ذات الخلايا غير المعالجة.
ملاحظة: الصلاحية = (إشارة محددة في كل بئر / "AV-SS-unt") × 100
3. رصد وتحليل التغيرات المورفولوجية في الأجسام الكروية
ملاحظة: بالنسبة لمقايسة MTT ، يجب استخدام وسيط زراعة الخلية فقط وليس "وسيط ثقافة 3D" في هذا التقييم (إضافة مصفوفة الغشاء القاعدي ليست ضرورية ويمكن أن تتداخل مع التحليل).
- بعد عد الكرات ، قم بتخفيف المعلق في وسط زراعة الخلايا (وسط زراعة RPMI-1640 مكمل ب 10٪ FBS ، 1: 100 بنسلين - ستربتومايسين ، 1٪ أحماض أمينية غير أساسية ، و 1٪ L-glutamine) إلى حوالي 1-2 كروية لكل 20 ميكرولتر.
- ضع 80 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا في آبار صفيحة 96 بئر منخفضة للغاية ، ثم أضف 20 ميكرولتر من المعلق الكروي إلى الآبار.
ملاحظة: لذلك ، ستحتوي الآبار على 1-2 كروية بحجم 100 ميكرولتر. - تحقق بعناية من الآبار تحت المجهر ، وحدد الآبار التي تحتوي على كروية واحدة ، حيث سيتم استخدامها لهذا التحليل.
- تحضير دواء الدراسة بتركيز مزدوج تركيز الاهتمام. أضف 100 ميكرولتر من محلول الدواء إلى الآبار ذات الصلة (سيكون التركيز الكلي في البئر بعد ذلك 1x).
- التقط صورة لكل بئر في اليوم 0 (قبل إضافة عقار الدراسة) واستخدم أداة "المقياس" في برنامج التصوير (انظر جدول المواد) لتحديد أقطار الأجسام الكروية.
- احتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2 ، وفحص التشكل وقياس قطر الكرات (باستخدام أداة "المقياس") يوميا لمدة 3-7 أيام ، اعتمادا على وقت ملاحظة تأثير الدواء (على سبيل المثال ، نشر الخلايا ، القرون الغازية ، تدمير البنية ، إلخ).
- في نهاية التجربة ، ارسم التغييرات في أقطار كروية (بالنسبة إلى اليوم 0) بمرور الوقت.
ملاحظة: التغيير (النسبة المئوية) = (قطر كروي في يوم معين / قطر ذلك الكروي في اليوم 0) × 100
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يقدم هذا البروتوكول إجراءات لتوليد ثقافة متجانسة من الكائنات الكروية من الخلايا السرطانية الأولية ، وتقييم فعالية الدواء كميا على الثقافة الكروية (مقايسة MTT) ، وتحديد تأثير أدوية الدراسة على مورفولوجيا كروية. يتم تقديم بيانات من التجارب التمثيلية في الأجسام الكروية الناتجة عن مزارع خلايا سرطان القولون والثدي. تم إجراء تجارب مماثلة باستخدام أنواع أخرى من الأورام ، بما في ذلك سرطان القنوات الصفراوية وسرطان المعدة والرئة والبنكرياس (البيانات غير معروضة). تم إجراء جميع التجارب المعروضة هنا في ثلاث نسخ.
يوضح الشكل 2 الأجسام الكروية التي تم إنشاؤها من مزرعة خلايا سرطان القولون الأولية. كما هو موضح في الشكل 2 ، يعتمد عدد الأجسام الكروية المتولدة على عدد الخلايا التي تم زرعها في البداية في كل بئر. استغرق نمو الكرويات إلى أكثر من 100 ميكرومتر في القطر 10-14 يوما. يحدد أصل الخلايا السرطانية (على سبيل المثال ، مرضى مختلفون وأصول مختلفة) معدل النمو. لم يؤد زرع الآبار بمزيد من الخلايا إلى تقصير الوقت اللازم لتوليد كروية ، بل زاد من عدد الأجسام الكروية المتكونة. والجدير بالذكر أنه عند الاستزراع المطول للكرويات السرطانية للقولون ، بدأوا في الالتصاق ببعضهم البعض وشكلوا مجموعات من الأجسام الكروية في هياكل تشبه العنب (الشكل 3) ، مما منع وجود ثقافة متجانسة ، وبالتالي حظر استخدام الكرات الكروية في فحوصات MTT.
يعرض الشكل 4 تأثير ثلاثة علاجات (10 ميكرومتر بالبوسيكليب ، 10 ميكرومتر سونيتينيب ، ومزيجها عند 10 ميكرومتر لكل منهما) على صلاحية الكائنات الكروية المشتقة من سرطانين أساسيين. في هذه الحالة ، تم إنشاء نموذج PDX أولا ، وتم اشتقاق الخلايا السرطانية المستخدمة في التحليل الكروي من نموذج PDX9. تم إنشاء نموذج PDX الأول باستخدام عينة سرطان القولون من مريض يبلغ من العمر 50 عاما ، والثاني باستخدام عينة سرطان الثدي من أنثى تبلغ من العمر 62 عاما. كما هو موضح في الشكل 4 أ ، ب ، بعد 3 أيام من العلاج ، أدى الجمع بين palbociclib بالإضافة إلى sunitinib إلى انخفاض كبير في الجدوى كما تم قياسه بواسطة مقايسة MTT. كما هو موضح في الشكل 4C ، D ، كانت التغيرات المورفولوجية التي تحدث مع العلاج واضحة جدا. في اليوم 0 ، كانت جميع الأجسام الكروية سليمة. في المقابل ، في اليوم 3 ، كانت الأجسام الكروية المعالجة بالتحكم (DMSO) لا تزال سليمة ، في حين تم تفكيك الكائنات الكروية المعالجة بالمجموعة ، وكان مورفولوجيتها "مفتوحا" ، مع انفصال الخلايا عن البنية الصلبة ، مما يشير إلى تدمير البنية الكروية.
يعرض الشكل 5 متابعة الأجسام الكروية بمرور الوقت. تم علاج هذه الكرات ، المتولدة من خلايا سرطان الثدي المشتقة من مريضة تبلغ من العمر 44 عاما ، بواحدة من مجموعتين (تراستوزوماب [10 ميكروغرام / مل] بالإضافة إلى فينوريلبين [1 ميكروغرام / مل] ، أو 5-فلورويوراسيل [200 ميكرومتر] بالإضافة إلى سيسبلاتين [300 ميكرومتر]). كما هو موضح في الشكل 5 أ ، تم تقليل حجم الكرات المعالجة ب 5-فلورويوراسيل بالإضافة إلى سيسبلاتين بحلول اليوم 3 ، وتم تدمير الأجسام الكروية بالكامل بحلول اليوم 7. في المقابل ، كان للعلاج باستخدام تراستوزوماب بالإضافة إلى فينوريلبين تأثير طفيف فقط على مورفولوجيا الكائنات الكروية (على سبيل المثال ، مستوى معين من البنية "المفتوحة") ، لكن التأثير لم يكن كبيرا. يعرض الشكل 5B متوسط التغير في قطر الكرات بالنسبة لليوم 0 (تمت متابعة خمس كرويات في كل مجموعة علاج).
الشكل 1: نظرة عامة على بروتوكول إنشاء كرويات 3D من عينات الورم المشتقة من المريض وتقييم حساسيتها للأدوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تكوين كرويات من مزرعة خلايا سرطان القولون الأولية بمرور الوقت من خلال عدد الخلايا المصنفة في البداية. تم زرع أعداد مختلفة من الخلايا في "وسط ثقافة 3D" في لوحة 96 بئر منخفضة للغاية ولوحظ تحت المجهر (تكبير 4x). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: كرويات من خلايا سرطان القولون الأولية (مع بذر أولي للخلايا يبلغ 2000 لكل بئر) بعد 12 يوما في الثقافة. يظهر المثالان (A ، B) مجموعات تم إنشاؤها بواسطة ارتباط الكرويات ببعضها البعض (تكبير 10x). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تأثيرات palbociclib (10 μM) ، sunitinib (10 μM) ، ومزيجها (10 μM لكل منهما) على كرويات من الخلايا السرطانية الأولية ، بما في ذلك سرطان القولون والثدي (مشتق من PDX). تم إجراء اختبار MTT على كرويات مشتقة من (A) القولون و (B) خلايا سرطان الثدي. تم تطبيع إشارات MTT إلى قيم من الخلايا المعالجة DMSO. تمثل القيم الوسائل من أربعة إلى ثمانية مكررات. تمثل أشرطة الخطأ SEM. * p < 0.05 مقابل عامل واحد (t-test). كما تم تقييم آثار العلاجات المختلفة على نمو الخلايا مجهريا في اليوم 0 وبعد 3 أيام من علاج الكرويات المشتقة من (C) القولون و (D) خلايا سرطان الثدي (تكبير 10x). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الشكل مقتبس من موسكوفيتس وآخرون 9. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تأثيرات تراستوزوماب (10 ميكروغرام / مل) بالإضافة إلى فينوريلبين (1 ميكروغرام / مل) و 5-فلورويوراسيل (200 ميكرومتر) بالإضافة إلى سيسبلاتين (300 ميكرومتر) على الأجسام الكروية المشتقة من سرطان الثدي بمرور الوقت. (أ) احتوى كل بئر على كروي واحد وتم رصده بمرور الوقت تحت المجهر (تكبير 10x). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) التغير في قطر الأجسام الكروية (بالنسبة لليوم 0) حسب مدة العلاج. * p = 0.05 ل 5-فلورويوراسيل بالإضافة إلى سيسبلاتين مقابل الضوابط (اختبار T). تضمنت كل مجموعة معالجة أربعة إلى ستة آبار ، مع كروي واحد في كل بئر. يتم تقديم متوسط التغيير. تمثل أشرطة الخطأ التسويق عبر محرك البحث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف البروتوكول الحالي طريقة بسيطة لتوليد ثقافات الخلايا الأولية 3D (كروية) المستمدة من عينات الورم البشري. يمكن استخدام هذه الأجسام الكروية في تحليلات مختلفة ، بما في ذلك تقييم الأدوية المرشحة المحتملة ومجموعات الأدوية ، وتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة أو الأهداف العلاجية ، والتحقيق في آليات الاستجابة والمقاومة. يستخدم البروتوكول إما الخلايا السرطانية الأولية المشتقة مباشرة من عينات المرضى أو الخلايا السرطانية من نماذج PDX ، والتي يمكن إنشاؤها باستخدام عينات المريض. يسمح النهج الأخير بإجراء تجارب في المختبر وفي الجسم الحي مع نفس الورم الرئيسي. وقد أظهر الاتساق سابقا في نتائج تجارب حساسية الدواء بين نماذج PDX والثقافات ثلاثية الأبعاد المشتقة من هذه النماذج9 ، مما يدعم أهمية هذا النهج في المختبر / في الجسم الحي .
تشمل المزايا الرئيسية للبروتوكول الحالي قابليته للتطبيق على نطاق واسع على معظم الأورام الصلبة وفعاليته من حيث التكلفة ، والتي تنبع من توافقه مع القدرات / المعدات النموذجية لمختبرات أبحاث السرطان / بيولوجيا الخلية (أي عدم الحاجة إلى معدات متخصصة أو الاستعانة بمصادر خارجية). بالإضافة إلى ذلك ، يولد البروتوكول الحالي مجموعة كروية متجانسة ، مما يسمح باستخدام مقايسات الجدوى الكمية عالية الإنتاجية (على سبيل المثال ، MTT). يعد توليد مجموعة كروية متجانسة أمرا مهما للحصول على نتائج ذات مغزى ، حيث أظهرت الدراسات أن حجم الكرة يؤثر على الاستجابة للعلاج. تتميز الكرويات الأكبر ، على عكس الأجسام الكروية الأصغر ، بنواة نخرية. ومع ذلك ، فإن معظم الخلايا في مرحلة النمو الخطي في كرويات أصغر. علاوة على ذلك ، يؤثر حجم الكروي أيضا على صلابة بنية أنسجته ، مما قد يؤثر على انتشار المركبات (مثل تلك المستخدمة في فحوصات البقاء) في الكروية14. القيد الرئيسي للبروتوكول الحالي هو أنه حتى مع إمكانية تطبيقه على نطاق واسع ، هناك حالات يفشل فيها النهج في توليد كرويات. الأهم من ذلك ، أن مثل هذا الفشل ليس خاصا بالورم ولكنه خاص بالمريض. هناك حاجة إلى دراسات إضافية لاستكشاف سبب عدم تشكيل عينات الورم من بعض المرضى كرويات باستخدام هذا البروتوكول.
يعتمد البروتوكول الحالي على مبدأين رئيسيين: (1) وجود تعليق خلية بدون مجموعات خلايا (أي تعليق أحادي الخلية) و (2) استخدام لوحة ربط منخفضة للغاية مع وسيط يحتوي على 5٪ مصفوفة غشاء قاعدي (مصفوفة خارج الخلية قابلة للذوبان). يؤثر العدد الأولي للخلايا المصنفة على عدد الأجسام الكروية التي تتشكل ولكن ليس الوقت اللازم لتكوين كروي ، مما يشير إلى أن كل كروية يتم إنشاؤها من خلية ورمية واحدة. والجدير بالذكر أن تجمع الأجسام الكروية يحدث ، خاصة بعد الحضانة الطويلة. هذا التجميع يعطل الثقافة المتجانسة ويحظر استخدام MTT (بسبب صعوبة توزيع عدد متساو من الكرويات في كل بئر). يمكن تجنب هذا التجمع عن طريق تخفيف الثقافة ونقل الكرويات إلى آبار أكبر. إذا تعذر تحقيق ثقافة متجانسة ، فلا يمكن استخدام مقايسات MTT ، على الرغم من أنه لا يزال من الممكن إجراء التقييم المورفولوجي وقياس أقطار الكرة الأرضية. وتجدر الإشارة إلى أن التقييم المورفولوجي أكثر كثافة في العمل لأنه يتطلب تخصيص كروي واحد لكل بئر ومراقبة كل كروي تحت المجهر.
يعد تحديد العدد المناسب من الأجسام الكروية لمقايسة MTT أمرا مهما لتفسيره. وبالتالي ، يوصى أولا بإنشاء منحنى قياسي بأعداد معروفة من الكرات (على سبيل المثال ، 50 و 100 و 200 و 400 لكل بئر ، في النسخ المتماثلة) من أجل تحديد العدد الأمثل للكرويات لفحص MTT. يجب استخدام منتصف النطاق الخطي للمخطط للتحليل بحيث يكون هناك ما يكفي من الأجسام الكروية للكشف عن إشارة ولكن ليس كثيرا (أي بحيث لا يتم الوصول إلى مرحلة الهضبة للإشارة). علاوة على ذلك ، يسمح استخدام المدى المتوسط بإبقاء الإشارة ضمن النطاق الخطي في حالات الاستجابة للدواء (أي الإشارة المنخفضة) ، وكذلك عدم الاستجابة (أي النمو المستمر للكروية وزيادة الإشارة). أخيرا ، نظرا لأن اختبار MTT يقيم النشاط الأيضي للخلايا ، والذي يمكن أن يكون مختلفا بين الأورام من مرضى مختلفين ، يجب إنشاء منحنى قياسي لكل عينة ورم أولية.
باختصار ، يمثل هذا البروتوكول لتوليد نماذج ثقافة الورم 3D من الخلايا السرطانية الأولية وتقييم حساسيتها للأدوية باستخدام مقايسة صلاحية الخلية (MTT) والفحص المورفولوجي تحت المجهر أداة قيمة وذات صلة بيولوجيا تكمل نهج 2D الحالية في المختبر وكذلك النهج في الجسم الحي .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
اي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
| Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
References
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
- Richter, M., et al. From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).
- Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy. Revista de Investigación Clínica. 71 (6), 369-380 (2019).
- Choi, J. R., et al. In vitro human cancer models for biomedical applications. Cancers. 14 (9), 2284 (2022).
- Eglen, R. M., Randle, D. H. Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).
- Kodack, D. P., et al. Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care. Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).
- Moskovits, N., et al. Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types. Cancer Letters. 536, 215665 (2022).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).
- Brajša, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jelić, D. Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery. Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).
- Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).
- van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: The MTT assay. Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).
- Walzl, A., et al. The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).
