रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर नमूनों से 3-आयामी स्फेरॉइड स्थापित करना और दवाओं के प्रति उनकी संवेदनशीलता का मूल्यांकन करना
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल प्राथमिक कैंसर कोशिकाओं से 3 डी ट्यूमर कल्चर मॉडल उत्पन्न करने और सेल-व्यवहार्यता परख और सूक्ष्म परीक्षाओं का उपयोग करके दवाओं के प्रति उनकी संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने का वर्णन करता है।
Abstract
ट्यूमर जीव विज्ञान को समझने में उल्लेखनीय प्रगति के बावजूद, नैदानिक परीक्षणों में प्रवेश करने वाले ऑन्कोलॉजी दवा उम्मीदवारों का विशाल बहुमत विफल हो जाता है, अक्सर नैदानिक प्रभावकारिता की कमी के कारण। यह उच्च विफलता दर नैदानिक प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करने के लिए वर्तमान प्रीक्लिनिकल मॉडल की अक्षमता को उजागर करती है, मुख्य रूप से ट्यूमर विषमता और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को प्रतिबिंबित करने में उनकी अपर्याप्तता के कारण। इन सीमाओं को व्यक्तिगत रोगियों से प्राप्त मानव ट्यूमर के नमूनों से स्थापित 3-आयामी (3 डी) संस्कृति मॉडल (स्फेरॉइड) के साथ संबोधित किया जा सकता है। ये 3 डी संस्कृतियां स्थापित सेल लाइनों की तुलना में वास्तविक दुनिया के जीव विज्ञान का बेहतर प्रतिनिधित्व करती हैं जो ट्यूमर विषमता को प्रतिबिंबित नहीं करती हैं। इसके अलावा, 3 डी संस्कृतियां 2-आयामी (2 डी) संस्कृति मॉडल (मोनोलेयर संरचनाओं) से बेहतर हैं क्योंकि वे ट्यूमर पर्यावरण के तत्वों को दोहराते हैं, जैसे हाइपोक्सिया, नेक्रोसिस और सेल आसंजन, और प्राकृतिक कोशिका आकार और विकास को संरक्षित करते हैं। वर्तमान अध्ययन में, व्यक्तिगत रोगियों से कैंसर कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृतियों को तैयार करने के लिए एक विधि विकसित की गई थी जो 3 डी हैं और बहुकोशिकीय स्फेरॉइड में बढ़ते हैं। कोशिकाओं को सीधे रोगी ट्यूमर या रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स से प्राप्त किया जा सकता है। विधि ठोस ट्यूमर (जैसे, बृहदान्त्र, स्तन और फेफड़े) के लिए व्यापक रूप से लागू होती है और लागत प्रभावी भी है, क्योंकि इसे विशेष उपकरणों पर भरोसा किए बिना एक विशिष्ट कैंसर अनुसंधान / सेल जीव विज्ञान प्रयोगशाला में अपनी संपूर्णता में किया जा सकता है। इसमें, प्राथमिक कैंसर कोशिकाओं से 3 डी ट्यूमर कल्चर मॉडल (बहुकोशिकीय स्फेरॉइड) उत्पन्न करने और दो पूरक दृष्टिकोणों का उपयोग करके दवाओं के प्रति उनकी संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है: एक सेल-व्यवहार्यता परख (एमटीटी) और सूक्ष्म परीक्षाएं। इन बहुकोशिकीय स्फेरॉइड का उपयोग संभावित दवा उम्मीदवारों का आकलन करने, संभावित बायोमाकर्स या चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने और प्रतिक्रिया और प्रतिरोध के तंत्र की जांच करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
इन विट्रो और विवो अध्ययनों में कैंसर उपचार विकसित करने के लिए पूरक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं। इन विट्रो मॉडल अधिकांश प्रयोगात्मक चर के नियंत्रण की अनुमति देते हैं और मात्रात्मक विश्लेषण की सुविधा प्रदान करते हैं। वे अक्सर कम लागत वाले स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म के रूप में काम करते हैं और यांत्रिक अध्ययन के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकताहै। हालांकि, उनकी जैविक प्रासंगिकता स्वाभाविक रूप से सीमित है, क्योंकि ऐसे मॉडल केवल आंशिक रूप से ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट1 को दर्शाते हैं। इसके विपरीत, विवो मॉडल में, जैसे कि रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स (पीडीएक्स), ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की जटिलता को पकड़ते हैं और ट्रांसलेशनल अध्ययन और रोगियों में व्यक्तिगत उपचार के लिए अधिक उपयुक्त होते हैं (यानी, एक व्यक्तिगत रोगी से प्राप्त मॉडल में दवाओं की प्रतिक्रिया की जांच करना)1। हालांकि, विवो मॉडल में दवा स्क्रीनिंग के लिए उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोण के लिए अनुकूल नहीं हैं, क्योंकि प्रयोगात्मक मापदंडों को इन विट्रो मॉडल के रूप में कसकर नियंत्रित नहीं किया जा सकता है और क्योंकि उनका विकास समय लेने वाला, श्रम गहन और महंगा 1,2 है।
इन विट्रो मॉडल 100 से अधिक वर्षों के लिए उपलब्ध हैं, और सेल लाइनें 70 से अधिक वर्षों से उपलब्धहैं। पिछले कई दशकों के दौरान, हालांकि, ठोस ट्यूमर के उपलब्ध इन विट्रो मॉडल की जटिलता नाटकीय रूप से बढ़ गई है। यह जटिलता 2-आयामी (2 डी) संस्कृति मॉडल (मोनोलेयर संरचनाएं) से होती है जो या तो ट्यूमर-व्युत्पन्न स्थापित सेल लाइनें या प्राथमिक सेल लाइनें हैं, जो 3-आयामी (3 डी) मॉडल 1 से जुड़े हाल के दृष्टिकोणहैं। 2 डी मॉडल के भीतर, एक महत्वपूर्ण अंतर स्थापित और प्राथमिक सेल लाइनों4 के बीच है। स्थापित सेल लाइनें अमर हो जाती हैं; इसलिए, एक ही सेल लाइन का उपयोग कई वर्षों में विश्व स्तर पर किया जा सकता है, जो ऐतिहासिक परिप्रेक्ष्य से, सहयोग, डेटा के संचय और कई उपचार रणनीतियों के विकास की सुविधा प्रदान करता है। हालांकि, इन सेल लाइनों में आनुवंशिक विचलन हर मार्ग के साथ जमा होते हैं, इस प्रकार उनकी जैविक प्रासंगिकता से समझौता करते हैं। इसके अलावा, उपलब्ध सेल लाइनों की सीमित संख्या रोगियों में ट्यूमर की विषमता को प्रतिबिंबित नहीं करती है 4,5। प्राथमिक कैंसर सेल लाइनें सीधे बायोप्सी, फुफ्फुस बहाव, या शोधन के माध्यम से प्राप्त ट्यूमर के नमूनों से प्राप्त होती हैं। इसलिए, प्राथमिक कैंसर सेल लाइनें जैविक रूप से अधिक प्रासंगिक हैं क्योंकि वे ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट और ट्यूमर विशेषताओं के तत्वों को संरक्षित करते हैं, जैसे कि अंतरकोशिकीय व्यवहार (जैसे, स्वस्थ और कैंसर कोशिकाओं के बीच क्रॉस-टॉक) और कैंसर कोशिकाओं के स्टेम जैसे फेनोटाइप। हालांकि, प्राथमिक सेल लाइनों की प्रतिकृति क्षमता सीमित है, जो एक संकीर्ण संस्कृति समय की ओर जाता है और ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या को सीमित करता है जिनका उपयोग विश्लेषण के लिए किया जा सकता है 4,5।
3 डी संस्कृतियों का उपयोग करने वाले मॉडल 2 डी संस्कृति मॉडल की तुलना में अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक हैं क्योंकि विवो स्थितियों को बरकरार रखा गया है। इस प्रकार, 3 डी संस्कृति मॉडल प्राकृतिक कोशिका आकार और विकास को संरक्षित करते हैं और ट्यूमर के वातावरण के तत्वों को दोहराते हैं, जैसे हाइपोक्सिया, नेक्रोसिस और सेल आसंजन। कैंसर अनुसंधान में सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले 3 डी मॉडल में बहुकोशिकीय स्फेरॉइड, पाड़-आधारित संरचनाएं और मैट्रिक्स-एम्बेडेड संस्कृतियां 4,6,7 शामिल हैं।
वर्तमान प्रोटोकॉल प्राथमिक कैंसर कोशिकाओं से 3 डी ट्यूमर कल्चर मॉडल (बहुकोशिकीय स्फेरॉइड) उत्पन्न करता है और दो पूरक दृष्टिकोणों का उपयोग करके दवाओं के प्रति उनकी संवेदनशीलता का मूल्यांकन करता है: एक सेल-व्यवहार्यता परख (एमटीटी) और सूक्ष्म परीक्षाएं। यहां प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम स्तन और बृहदान्त्र कैंसर से हैं; हालांकि, यह प्रोटोकॉल अन्य ठोस ट्यूमर प्रकारों (जैसे, कोलेंजियोकार्सिनोमा, गैस्ट्रिक, फेफड़े और अग्नाशय के कैंसर) पर व्यापक रूप से लागू होता है और लागत प्रभावी भी है, क्योंकि इसे विशेष उपकरणों पर भरोसा किए बिना एक विशिष्ट कैंसर अनुसंधान / सेल जीवविज्ञान प्रयोगशाला में अपनी संपूर्णता में किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके उत्पन्न बहुकोशिकीय स्फेरॉइड का उपयोग संभावित दवा उम्मीदवारों का आकलन करने, संभावित बायोमाकर्स या चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने और प्रतिक्रिया और प्रतिरोध के तंत्र की जांच करने के लिए किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल को तीन वर्गों में विभाजित किया गया है: (1) दवा प्रभावकारिता के परीक्षण के लिए एक मॉडल के रूप में उनके उपयोग की तैयारी में स्फेरॉइड की पीढ़ी, संग्रह और गिनती; (2) स्फेरॉइड पर दवा प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए एमटीटी परख; और (3) दवा प्रभावकारिता के मूल्यांकन के लिए एक अन्य दृष्टिकोण के रूप में दवाओं के साथ स्फेरॉइड के उपचार के बाद रूपात्मक परिवर्तनों का सूक्ष्म मूल्यांकन (चित्रा 1)।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल मानव ट्यूमर के नमूनों से प्राप्त 3 डी प्राथमिक सेल संस्कृतियों (स्फेरॉइड) को उत्पन्न करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करता है। इन स्फेरॉइड का उपयोग विभिन्न विश्लेषणों के लिए किया जा स?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कोई नहीं।
Materials
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
| Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann – La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
Riferimenti
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