从患者来源的肿瘤样本中建立三维微球并评估其对药物的敏感性
Summary
本协议描述了从原代癌细胞生成3D肿瘤培养模型，并使用细胞活力测定和显微镜检查评估其对药物的敏感性。
Abstract
尽管在理解肿瘤生物学方面取得了显着进展，但绝大多数进入临床试验的肿瘤候选药物都失败了，通常是由于缺乏临床疗效。这种高失败率说明了目前的临床前模型无法预测临床疗效，主要是因为它们在反映肿瘤异质性和肿瘤微环境方面存在不足。这些限制可以通过从个体患者身上的人类肿瘤样本建立的三维（3D）培养模型（球状体）来解决。这些3D培养物比不反映肿瘤异质性的已建立细胞系更能代表现实世界的生物学。此外，3D培养优于二维（2D）培养模型（单层结构），因为它们复制肿瘤环境的元素，如缺氧，坏死和细胞粘附，并保持天然细胞形状和生长。在本研究中，开发了一种用于制备来自个体患者的癌细胞原代培养物的方法，这些患者是3D的并在多细胞球状体中生长。这些细胞可以直接来源于患者肿瘤或患者来源的异种移植物。该方法广泛适用于实体瘤（例如结肠、乳腺癌和肺癌），并且还具有成本效益，因为它可以在典型的癌症研究/细胞生物学实验室中完整地进行，而无需依赖专用设备。本文提出了一种协议，用于从原代癌细胞生成3D肿瘤培养模型（多细胞球状体），并使用两种互补方法评估其对药物的敏感性：细胞活力测定（MTT）和显微镜检查。这些多细胞球体可用于评估潜在的候选药物，识别潜在的生物标志物或治疗靶点，并研究反应和耐药的机制。
Introduction
体外 和 体内 研究代表了开发癌症治疗方法的补充方法。 体外 模型允许控制大多数实验变量并促进定量分析。它们通常用作低成本的筛选平台，也可用于机理研究1。然而，它们的生物学相关性本质上是有限的，因为这样的模型只能部分反映肿瘤微环境1。相比之下， 体内 模型，如患者来源的异种移植物（PDX），捕获了肿瘤微环境的复杂性，更适合于患者的转化研究和个体化治疗（即，在源自个体患者的模型中研究对药物的反应）1。然而， 体内 模型不利于药物筛选的高通量方法，因为实验参数不能像 体外 模型那样严格控制，并且它们的开发耗时、劳动密集型且成本高昂1，2.
体外模型已经有100多年的历史，细胞系已经有70多年的历史3。然而，在过去的几十年中，实体瘤体外模型的复杂性急剧增加。这种复杂性的范围从肿瘤衍生的已建立细胞系或原代细胞系的二维（2D）培养模型（单层结构）到涉及三维（3D）模型的最新方法1。在2D模型中，一个关键的区别是已建立的细胞系和原代细胞系之间的区别4。已建立的细胞系永生化;因此，同一细胞系可以在全球范围内使用多年，从历史的角度来看，这促进了协作、数据的积累和许多治疗策略的开发。然而，这些细胞系中的遗传畸变随着每次传代而积累，从而损害了它们的生物学相关性。此外，可用细胞系的数量有限并不能反映患者肿瘤的异质性4，5。原代癌细胞系直接来源于通过活检、胸腔积液或切除获得的切除肿瘤样本。因此，原代癌细胞系更具生物学相关性，因为它们保留了肿瘤微环境和肿瘤特征的元素，例如细胞间行为（例如，健康和癌细胞之间的串扰）和癌细胞的干细胞样表型。然而，原代细胞系的复制能力有限，这导致培养时间较窄，并限制了可用于分析的肿瘤细胞数量4，5。
使用3D培养物的模型比2D培养模型更具生物学相关性，因为保留了体内条件。因此，3D培养模型保留了天然细胞的形状和生长，并复制了肿瘤环境的元素，例如缺氧，坏死和细胞粘附。癌症研究中最常用的3D模型包括多细胞球状体，基于支架的结构和基质嵌入的培养物4，6，7。
本协议从原发癌细胞生成3D肿瘤培养模型（多细胞球状体），并使用两种互补方法评估其对药物的敏感性：细胞活力测定（MTT）和显微镜检查。本文介绍的代表性结果来自乳腺癌和结肠癌;然而，该方案广泛适用于其他实体瘤类型（例如，胆管癌，胃癌，肺癌和胰腺癌），并且也具有成本效益，因为它可以在典型的癌症研究/细胞生物学实验室中完整进行，而无需依赖专用设备。使用这种方法生成的多细胞微球可用于评估潜在的候选药物，识别潜在的生物标志物或治疗靶点，并研究反应和耐药的机制。
该协议分为三个部分：（1）微球的生成，收集和计数，以准备将其用作测试药物疗效的模型;（2）MTT测定以评估药物对球状体的疗效;（3）用药物治疗微球后形态变化的显微镜评估，作为评估药物疗效的另一种方法（图1）。
Protocol
Representative Results
Discussion
本协议描述了一种从人类肿瘤样品中提取3D原代细胞培养物（球状体）的简单方法。这些微球可用于各种分析，包括评估潜在的候选药物和药物组合，识别潜在的生物标志物或治疗靶点，以及研究反应和耐药的机制。该方案使用直接来自患者样本的原代肿瘤细胞或来自PDX模型的肿瘤细胞，可以使用患者样本建立。后一种方法允许对相同的原发肿瘤进行 体外 和 体内 实验。PDX模型和源?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
没有。
Materials
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
| Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann – La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
Riferimenti
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