Het vaststellen van 3-dimensionale sferoïden uit van de patiënt afgeleide tumormonsters en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen
Summary
Het huidige protocol beschrijft het genereren van 3D-tumorcultuurmodellen van primaire kankercellen en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen met behulp van cel-levensvatbaarheidstests en microscopische onderzoeken.
Abstract
Ondanks opmerkelijke vooruitgang in het begrijpen van tumorbiologie, faalt de overgrote meerderheid van de kandidaat-oncologische geneesmiddelen die deelnemen aan klinische onderzoeken, vaak als gevolg van een gebrek aan klinische werkzaamheid. Dit hoge faalpercentage verlicht het onvermogen van de huidige preklinische modellen om de klinische werkzaamheid te voorspellen, voornamelijk vanwege hun ontoereikendheid in het weerspiegelen van tumorheterogeniteit en de micro-omgeving van de tumor. Deze beperkingen kunnen worden aangepakt met 3-dimensionale (3D) cultuurmodellen (sferoïden) die zijn vastgesteld op basis van menselijke tumormonsters die zijn afgeleid van individuele patiënten. Deze 3D-culturen vertegenwoordigen de biologie van de echte wereld beter dan gevestigde cellijnen die de heterogeniteit van de tumor niet weerspiegelen. Bovendien zijn 3D-culturen beter dan 2-dimensionale (2D) cultuurmodellen (monolaagstructuren) omdat ze elementen van de tumoromgeving repliceren, zoals hypoxie, necrose en celadhesie, en de natuurlijke celvorm en -groei behouden. In de huidige studie werd een methode ontwikkeld voor het bereiden van primaire culturen van kankercellen van individuele patiënten die 3D zijn en groeien in meercellige sferoïden. De cellen kunnen rechtstreeks worden afgeleid van patiënttumoren of van de patiënt afgeleide xenografts. De methode is breed toepasbaar op solide tumoren (bijv. Dikke darm, borst en long) en is ook kosteneffectief, omdat het in zijn geheel kan worden uitgevoerd in een typisch kankeronderzoek / celbiologisch laboratorium zonder afhankelijk te zijn van gespecialiseerde apparatuur. Hierin wordt een protocol gepresenteerd voor het genereren van 3D-tumorcultuurmodellen (meercellige sferoïden) uit primaire kankercellen en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen met behulp van twee complementaire benaderingen: een cel-levensvatbaarheidstest (MTT) en microscopisch onderzoek. Deze meercellige sferoïden kunnen worden gebruikt om potentiële kandidaat-geneesmiddelen te beoordelen, potentiële biomarkers of therapeutische doelen te identificeren en de mechanismen van respons en resistentie te onderzoeken.
Introduction
In vitro en in vivo studies vertegenwoordigen complementaire benaderingen voor het ontwikkelen van kankerbehandelingen. In vitro modellen maken de controle van de meeste experimentele variabelen mogelijk en vergemakkelijken kwantitatieve analyses. Ze dienen vaak als goedkope screeningplatforms en kunnen ook worden gebruikt voor mechanistische studies1. Hun biologische relevantie is echter inherent beperkt, omdat dergelijke modellen slechts gedeeltelijk de micro-omgeving van de tumor weerspiegelen1. In vivo modellen, zoals patiënt-afgeleide xenografts (PDX), vangen daarentegen de complexiteit van de tumormicro-omgeving en zijn meer geschikt voor translationele studies en individualisering van de behandeling bij patiënten (d.w.z. het onderzoeken van de respons op geneesmiddelen in een model afgeleid van een individuele patiënt)1. In vivo modellen zijn echter niet bevorderlijk voor high-throughput benaderingen voor geneesmiddelenscreening, omdat de experimentele parameters niet zo strak kunnen worden gecontroleerd als in in vitro modellen en omdat hun ontwikkeling tijdrovend, arbeidsintensief en kostbaar is 1,2.
In vitro modellen zijn al meer dan 100 jaar beschikbaar en cellijnen zijn al meer dan 70 jaar beschikbaar3. In de afgelopen decennia is de complexiteit van de beschikbare in vitro modellen van solide tumoren echter dramatisch toegenomen. Deze complexiteit varieert van 2-dimensionale (2D) cultuurmodellen (monolaagstructuren) die ofwel tumor-afgeleide gevestigde cellijnen of primaire cellijnen zijn tot de meer recente benaderingen met 3-dimensionale (3D) modellen1. Binnen de 2D-modellen is een belangrijk onderscheid tussen de gevestigde en primaire cellijnen4. Gevestigde cellijnen worden vereeuwigd; Daarom kan dezelfde cellijn wereldwijd gedurende vele jaren worden gebruikt, wat vanuit een historisch perspectief samenwerking, de accumulatie van gegevens en de ontwikkeling van vele behandelingsstrategieën vergemakkelijkt. Genetische afwijkingen in deze cellijnen hopen zich echter op met elke passage, waardoor hun biologische relevantie in gevaar komt. Bovendien weerspiegelt het beperkte aantal beschikbare cellijnen niet de heterogeniteit van tumoren bij patiënten 4,5. Primaire kankercellijnen zijn rechtstreeks afgeleid van gereseceerde tumormonsters verkregen via biopsieën, pleurale effusies of resecties. Daarom zijn primaire kankercellijnen biologisch relevanter omdat ze elementen van de micro-omgeving van de tumor en tumorkenmerken behouden, zoals intercellulair gedrag (bijv. Cross-talk tussen gezonde en kankercellen) en de stamachtige fenotypen van kankercellen. De replicerende capaciteit van primaire cellijnen is echter beperkt, wat leidt tot een smalle kweektijd en het aantal tumorcellen beperkt dat kan worden gebruikt voor analyses 4,5.
Modellen met 3D-culturen zijn biologisch relevanter dan 2D-cultuurmodellen, omdat de in vivo omstandigheden behouden blijven. Zo behouden 3D-cultuurmodellen de natuurlijke celvorm en -groei en repliceren ze elementen van de tumoromgeving, zoals hypoxie, necrose en celadhesie. De meest gebruikte 3D-modellen in kankeronderzoek omvatten meercellige sferoïden, op steigers gebaseerde structuren en matrix-ingebedde culturen 4,6,7.
Het huidige protocol genereert 3D-tumorcultuurmodellen (meercellige sferoïden) uit primaire kankercellen en evalueert hun gevoeligheid voor geneesmiddelen met behulp van twee complementaire benaderingen: een cel-levensvatbaarheidstest (MTT) en microscopisch onderzoek. De representatieve resultaten die hierin worden gepresenteerd, zijn van borst- en darmkanker; Dit protocol is echter breed toepasbaar op andere solide tumortypen (bijv. Cholangiocarcinoom, maag-, long- en alvleesklierkanker) en is ook kosteneffectief, omdat het in zijn geheel kan worden uitgevoerd in een typisch kankeronderzoek / celbiologisch laboratorium zonder te vertrouwen op gespecialiseerde apparatuur. De meercellige sferoïden die met behulp van deze aanpak worden gegenereerd, kunnen worden gebruikt om potentiële kandidaat-geneesmiddelen te beoordelen, potentiële biomarkers of therapeutische doelen te identificeren en de mechanismen van respons en resistentie te onderzoeken.
Dit protocol is verdeeld in drie secties: (1) het genereren, verzamelen en tellen van de sferoïden ter voorbereiding op hun gebruik als model voor het testen van de werkzaamheid van geneesmiddelen; (2) MTT-test om de werkzaamheid van het geneesmiddel op de sferoïden te beoordelen; en (3) de microscopische evaluatie van morfologische veranderingen na de behandeling van de sferoïden met geneesmiddelen als een andere benadering voor het evalueren van de werkzaamheid van geneesmiddelen (figuur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Het huidige protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het genereren van 3D primaire celculturen (sferoïden) afgeleid van menselijke tumormonsters. Deze sferoïden kunnen worden gebruikt voor verschillende analyses, waaronder het evalueren van potentiële kandidaat-geneesmiddelen en medicijncombinaties, het identificeren van potentiële biomarkers of therapeutische doelen en het onderzoeken van de mechanismen van respons en resistentie. Het protocol maakt gebruik van primaire tumorcellen die rechtstreeks zijn afgel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Geen.
Materials
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
| Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann – La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
Riferimenti
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
- Richter, M., et al. From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).
- Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy. Revista de Investigación Clínica. 71 (6), 369-380 (2019).
- Choi, J. R., et al. In vitro human cancer models for biomedical applications. Cancers. 14 (9), 2284 (2022).
- Eglen, R. M., Randle, D. H. Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).
- Kodack, D. P., et al. Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care. Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).
- Moskovits, N., et al. Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types. Cancer Letters. 536, 215665 (2022).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).
- Brajša, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jelić, D. Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery. Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).
- Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).
- van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: The MTT assay. Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).
- Walzl, A., et al. The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).
