Создание 3-мерных сфероидов из образцов опухолей, полученных от пациентов, и оценка их чувствительности к лекарствам
Summary
Настоящий протокол описывает создание 3D-моделей опухолевых культур из первичных раковых клеток и оценку их чувствительности к лекарственным средствам с использованием анализов жизнеспособности клеток и микроскопических исследований.
Abstract
Несмотря на замечательные успехи в понимании биологии опухоли, подавляющее большинство кандидатов на онкологические препараты, участвующие в клинических испытаниях, терпят неудачу, часто из-за отсутствия клинической эффективности. Эта высокая частота неудач подчеркивает неспособность современных доклинических моделей предсказывать клиническую эффективность, главным образом из-за их неадекватности в отражении гетерогенности опухоли и микроокружения опухоли. Эти ограничения могут быть устранены с помощью 3-мерных (3D) культуральных моделей (сфероидов), созданных из образцов опухолей человека, полученных от отдельных пациентов. Эти 3D-культуры представляют реальную биологию лучше, чем установленные клеточные линии, которые не отражают гетерогенность опухоли. Кроме того, 3D-культуры лучше, чем 2-мерные (2D) модели культур (монослойные структуры), поскольку они воспроизводят элементы опухолевой среды, такие как гипоксия, некроз и клеточная адгезия, и сохраняют естественную форму и рост клеток. В настоящем исследовании был разработан метод получения первичных культур раковых клеток от отдельных пациентов, которые являются 3D и растут в многоклеточных сфероидах. Клетки могут быть получены непосредственно из опухолей пациента или ксенотрансплантатов, полученных от пациентов. Метод широко применим к солидным опухолям (например, толстой кишки, молочной железы и легких), а также является экономически эффективным, поскольку он может быть выполнен в полном объеме в типичной лаборатории исследования рака / клеточной биологии, не полагаясь на специализированное оборудование. Представлен протокол генерации 3D-моделей опухолевых культур (многоклеточных сфероидов) из первичных раковых клеток и оценки их чувствительности к лекарственным препаратам с использованием двух взаимодополняющих подходов: анализа жизнеспособности клеток (МТТ) и микроскопических исследований. Эти многоклеточные сфероиды могут быть использованы для оценки потенциальных кандидатов в лекарства, выявления потенциальных биомаркеров или терапевтических мишеней, а также для исследования механизмов ответа и резистентности.
Introduction
Исследования in vitro и in vivo представляют собой взаимодополняющие подходы к разработке методов лечения рака. Модели in vitro позволяют контролировать большинство экспериментальных переменных и облегчают количественный анализ. Они часто служат недорогими платформами для скрининга, а также могут использоваться для механистических исследований1. Однако их биологическая значимость по своей сути ограничена, поскольку такие модели лишь частично отражают микроокружение опухоли1. Напротив, модели in vivo, такие как ксенотрансплантаты, полученные от пациента (PDX), фиксируют сложность микроокружения опухоли и больше подходят для трансляционных исследований и индивидуализации лечения у пациентов (т.е. исследования реакции на лекарства в модели, полученной от отдельного пациента)1. Однако модели in vivo не способствуют высокопроизводительным подходам к скринингу лекарств, поскольку экспериментальные параметры не могут контролироваться так же жестко, как модели in vitro, и потому что их разработка требует много времени, труда и средств 1,2.
Модели in vitro доступны уже более 100 лет, а клеточные линии доступны уже более 70 лет3. Однако за последние несколько десятилетий сложность доступных моделей солидных опухолей in vitro резко возросла. Эта сложность варьируется от 2-мерных (2D) моделей культивирования (монослойных структур), которые являются либо укоренившимися клеточными линиями, полученными из опухоли, либо первичными клеточными линиями, до более поздних подходов, включающих 3-мерные (3D) модели1. В 2D-моделях ключевое различие между установленными и первичными клеточными линиями4. Установленные клеточные линии увековечены; Таким образом, одна и та же клеточная линия может использоваться во всем мире в течение многих лет, что с исторической точки зрения облегчает сотрудничество, накопление данных и разработку многих стратегий лечения. Однако генетические аберрации в этих клеточных линиях накапливаются с каждым проходом, что ставит под угрозу их биологическую значимость. Кроме того, ограниченное количество доступных клеточных линий не отражает гетерогенность опухолей у пациентов 4,5. Первичные линии раковых клеток получают непосредственно из резецированных образцов опухолей, полученных с помощью биопсии, плеврального выпота или резекций. Таким образом, первичные линии раковых клеток более биологически значимы, поскольку они сохраняют элементы микроокружения опухоли и характеристики опухоли, такие как межклеточное поведение (например, перекрестные помехи между здоровыми и раковыми клетками) и стволовые фенотипы раковых клеток. Однако репликативная способность первичных клеточных линий ограничена, что приводит к узкому времени культивирования и ограничивает количество опухолевых клеток, которые могут быть использованы для анализов 4,5.
Модели, использующие 3D-культуры, более биологически значимы, чем модели 2D-культур, поскольку сохраняются условия in vivo. Таким образом, 3D-модели культур сохраняют естественную форму и рост клеток и воспроизводят элементы опухолевой среды, такие как гипоксия, некроз и клеточная адгезия. Наиболее часто используемые 3D-модели в исследованиях рака включают многоклеточные сфероиды, структуры на основе скаффолдов и культуры с матрицей 4,6,7.
Настоящий протокол генерирует 3D-модели опухолевых культур (многоклеточных сфероидов) из первичных раковых клеток и оценивает их чувствительность к лекарственным средствам с использованием двух взаимодополняющих подходов: анализа жизнеспособности клеток (МТТ) и микроскопических исследований. Репрезентативные результаты, представленные в настоящем документе, относятся к раку молочной железы и толстой кишки; Тем не менее, этот протокол широко применим к другим типам солидных опухолей (например, холангиокарциноме, раку желудка, легких и поджелудочной железы), а также является экономически эффективным, поскольку он может быть выполнен полностью в типичной лаборатории исследования рака / клеточной биологии, не полагаясь на специализированное оборудование. Многоклеточные сфероиды, полученные с использованием этого подхода, могут быть использованы для оценки потенциальных кандидатов на лекарственные средства, выявления потенциальных биомаркеров или терапевтических мишеней, а также для исследования механизмов ответа и резистентности.
Этот протокол разделен на три раздела: (1) генерация, сбор и подсчет сфероидов при подготовке к их использованию в качестве модели для тестирования эффективности лекарств; (2) анализ МТТ для оценки эффективности лекарственного средства на сфероидах; и (3) микроскопическая оценка морфологических изменений после обработки сфероидов лекарственными препаратами в качестве еще одного подхода к оценке эффективности лекарственного средства (рис. 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящий протокол описывает простой способ получения 3D-первичных клеточных культур (сфероидов), полученных из образцов опухолей человека. Эти сфероиды могут быть использованы для различных анализов, включая оценку потенциальных кандидатов на лекарства и комбинации лекарств, иденти?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Никакой.
Materials
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
| Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann – La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
Riferimenti
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
- Richter, M., et al. From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).
- Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy. Revista de Investigación Clínica. 71 (6), 369-380 (2019).
- Choi, J. R., et al. In vitro human cancer models for biomedical applications. Cancers. 14 (9), 2284 (2022).
- Eglen, R. M., Randle, D. H. Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).
- Kodack, D. P., et al. Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care. Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).
- Moskovits, N., et al. Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types. Cancer Letters. 536, 215665 (2022).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).
- Brajša, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jelić, D. Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery. Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).
- Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).
- van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: The MTT assay. Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).
- Walzl, A., et al. The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).
