إنشاء كرويات 3 الأبعاد من عينات الورم المشتقة من المريض وتقييم حساسيتها للأدوية
Summary
يصف البروتوكول الحالي توليد نماذج زراعة الورم 3D من الخلايا السرطانية الأولية وتقييم حساسيتها للأدوية باستخدام مقايسات صلاحية الخلية والفحوصات المجهرية.
Abstract
على الرغم من التقدم الملحوظ في فهم بيولوجيا الورم ، فإن الغالبية العظمى من أدوية الأورام المرشحة التي تدخل التجارب السريرية تفشل ، غالبا بسبب نقص الفعالية السريرية. يسلط معدل الفشل المرتفع هذا الضوء على عدم قدرة النماذج قبل السريرية الحالية على التنبؤ بالفعالية السريرية ، ويرجع ذلك أساسا إلى عدم كفايتها في عكس عدم تجانس الورم والبيئة المكروية للورم. يمكن معالجة هذه القيود من خلال نماذج الثقافة ثلاثية الأبعاد (3D) (كروية) التي تم إنشاؤها من عينات الورم البشري المشتقة من المرضى الفرديين. تمثل ثقافات 3D هذه بيولوجيا في العالم الحقيقي أفضل من خطوط الخلايا الراسخة التي لا تعكس عدم تجانس الورم. علاوة على ذلك ، تعد الثقافات ثلاثية الأبعاد أفضل من نماذج الثقافة ثنائية الأبعاد (2D) (هياكل أحادية الطبقة) لأنها تكرر عناصر بيئة الورم ، مثل نقص الأكسجة والنخر والتصاق الخلايا ، وتحافظ على شكل الخلية الطبيعية ونموها. في الدراسة الحالية ، تم تطوير طريقة لإعداد الثقافات الأولية للخلايا السرطانية من المرضى الفرديين الذين هم 3D وتنمو في كرويات متعددة الخلايا. يمكن اشتقاق الخلايا مباشرة من أورام المريض أو الطعوم الخارجية المشتقة من المريض. هذه الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع على الأورام الصلبة (مثل القولون والثدي والرئة) وهي أيضا فعالة من حيث التكلفة ، حيث يمكن إجراؤها بالكامل في مختبر نموذجي لأبحاث السرطان / بيولوجيا الخلية دون الاعتماد على معدات متخصصة. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتوليد نماذج ثقافة الورم 3D (كرويات متعددة الخلايا) من الخلايا السرطانية الأولية وتقييم حساسيتها للأدوية باستخدام نهجين متكاملين: فحص صلاحية الخلية (MTT) والفحوصات المجهرية. يمكن استخدام هذه الكرويات متعددة الخلايا لتقييم الأدوية المرشحة المحتملة ، وتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة أو الأهداف العلاجية ، والتحقيق في آليات الاستجابة والمقاومة.
Introduction
تمثل الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي مناهج تكميلية لتطوير علاجات السرطان. تسمح النماذج في المختبر بالتحكم في معظم المتغيرات التجريبية وتسهيل التحليلات الكمية. غالبا ما تكون بمثابة منصات فحص منخفضة التكلفة ويمكن استخدامها أيضا للدراسات الميكانيكية1. ومع ذلك ، فإن أهميتها البيولوجية محدودة بطبيعتها ، لأن هذه النماذج تعكس جزئيا فقط البيئة المكروية للورم1. في المقابل ، في النماذج في الجسم الحي ، مثل الطعوم الخارجية المشتقة من المريض (PDX) ، تلتقط تعقيد البيئة المكروية للورم وهي أكثر ملاءمة للدراسات الانتقالية والعلاج الفردي في المرضى (أي التحقيق في الاستجابة للأدوية في نموذج مشتق من مريض فردي)1. ومع ذلك ، فإن النماذج في الجسم الحي لا تفضي إلى مناهج عالية الإنتاجية لفحص الأدوية ، حيث لا يمكن التحكم في المعلمات التجريبية بإحكام كما هو الحال في النماذج المختبرية ولأن تطويرها يستغرق وقتا طويلا وكثيف العمالة ومكلفا 1,2.
تتوفر النماذج في المختبر منذ أكثر من 100 عام ، وكانت خطوط الخلايا متاحة لأكثر من 70 عاما3. ومع ذلك ، خلال العقود العديدة الماضية ، زاد تعقيد النماذج المتاحة في المختبر للأورام الصلبة بشكل كبير. يتراوح هذا التعقيد من نماذج الثقافة ثنائية الأبعاد (2D) (الهياكل أحادية الطبقة) التي هي إما خطوط خلايا ثابتة مشتقة من الورم أو خطوط خلايا أولية إلى الأساليب الأحدث التي تتضمن نماذج ثلاثية الأبعاد (3D)1. ضمن نماذج 2D ، هناك تمييز رئيسي بين خطوط الخلايا الثابتة والأولية4. يتم تخليد خطوط الخلايا المنشأة. لذلك ، يمكن استخدام نفس خط الخلية على مستوى العالم على مدار سنوات عديدة ، مما يسهل التعاون وتراكم البيانات وتطوير العديد من استراتيجيات العلاج من منظور تاريخي. ومع ذلك ، تتراكم الانحرافات الجينية في خطوط الخلايا هذه مع كل مرور ، مما يضر بأهميتها البيولوجية. علاوة على ذلك ، فإن العدد المحدود من خطوط الخلايا المتاحة لا يعكس عدم تجانس الأورام في المرضى 4,5. يتم اشتقاق خطوط الخلايا السرطانية الأولية مباشرة من عينات الورم المقطوعة التي تم الحصول عليها عن طريق الخزعات أو الانصباب الجنبي أو الاستئصال. لذلك ، فإن خطوط الخلايا السرطانية الأولية أكثر أهمية من الناحية البيولوجية لأنها تحافظ على عناصر البيئة المكروية للورم وخصائص الورم ، مثل السلوكيات بين الخلايا (على سبيل المثال ، الحديث المتبادل بين الخلايا السليمة والسرطانية) والأنماط الظاهرية الشبيهة بالجذع للخلايا السرطانية. ومع ذلك ، فإن القدرة المتماثلة لخطوط الخلايا الأولية محدودة ، مما يؤدي إلى ضيق وقت الثقافة ويحد من عدد الخلايا السرطانية التي يمكن استخدامها للتحليلات 4,5.
النماذج التي تستخدم ثقافات 3D أكثر صلة بيولوجيا من نماذج ثقافة 2D حيث يتم الاحتفاظ بالظروف في الجسم الحي. وبالتالي ، تحافظ نماذج ثقافة 3D على شكل الخلية الطبيعية ونموها وتكرار عناصر بيئة الورم ، مثل نقص الأكسجة والنخر والتصاق الخلايا. تشمل نماذج 3D الأكثر استخداما في أبحاث السرطان كرويات متعددة الخلايا ، وهياكل قائمة على السقالات ، وثقافات مدمجة في المصفوفة4،6،7.
يولد البروتوكول الحالي نماذج زراعة الورم 3D (كرويات متعددة الخلايا) من الخلايا السرطانية الأولية ويقيم حساسيتها للأدوية باستخدام نهجين متكاملين: مقايسة صلاحية الخلية (MTT) والفحوصات المجهرية. النتائج التمثيلية المعروضة هنا هي من سرطان الثدي والقولون. ومع ذلك ، فإن هذا البروتوكول قابل للتطبيق على نطاق واسع على أنواع الأورام الصلبة الأخرى (على سبيل المثال ، سرطان القنوات الصفراوية وسرطان المعدة والرئة والبنكرياس) وهو أيضا فعال من حيث التكلفة ، حيث يمكن إجراؤه بالكامل في مختبر نموذجي لأبحاث السرطان / بيولوجيا الخلية دون الاعتماد على معدات متخصصة. يمكن استخدام الأجسام الكروية متعددة الخلايا المتولدة باستخدام هذا النهج لتقييم الأدوية المرشحة المحتملة ، وتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة أو الأهداف العلاجية ، والتحقيق في آليات الاستجابة والمقاومة.
ينقسم هذا البروتوكول إلى ثلاثة أقسام: (1) توليد وجمع وعد الأجسام الكروية استعدادا لاستخدامها كنموذج لاختبار فعالية الدواء. (2) مقايسة MTT لتقييم فعالية الدواء على الأجسام الكروية ؛ و (3) التقييم المجهري للتغيرات المورفولوجية بعد علاج الأجسام الكروية بالأدوية كنهج آخر لتقييم فعالية الدواء (الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف البروتوكول الحالي طريقة بسيطة لتوليد ثقافات الخلايا الأولية 3D (كروية) المستمدة من عينات الورم البشري. يمكن استخدام هذه الأجسام الكروية في تحليلات مختلفة ، بما في ذلك تقييم الأدوية المرشحة المحتملة ومجموعات الأدوية ، وتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة أو الأهداف العلاجية ، والتحقيق في …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
اي.
Materials
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
| Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann – La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
Riferimenti
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
- Richter, M., et al. From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).
- Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy. Revista de Investigación Clínica. 71 (6), 369-380 (2019).
- Choi, J. R., et al. In vitro human cancer models for biomedical applications. Cancers. 14 (9), 2284 (2022).
- Eglen, R. M., Randle, D. H. Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).
- Kodack, D. P., et al. Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care. Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).
- Moskovits, N., et al. Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types. Cancer Letters. 536, 215665 (2022).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).
- Brajša, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jelić, D. Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery. Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).
- Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).
- van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: The MTT assay. Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).
- Walzl, A., et al. The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).
