Établissement de sphéroïdes en 3 dimensions à partir d’échantillons tumoraux dérivés de patients et évaluation de leur sensibilité aux médicaments
Summary
Le présent protocole décrit la génération de modèles de culture tumorale 3D à partir de cellules cancéreuses primaires et l’évaluation de leur sensibilité aux médicaments à l’aide de tests de viabilité cellulaire et d’examens microscopiques.
Abstract
Malgré des progrès remarquables dans la compréhension de la biologie tumorale, la grande majorité des candidats médicaments oncologiques entrant dans les essais cliniques échouent, souvent en raison d’un manque d’efficacité clinique. Ce taux d’échec élevé met en lumière l’incapacité des modèles précliniques actuels à prédire l’efficacité clinique, principalement en raison de leur incapacité à refléter l’hétérogénéité tumorale et le microenvironnement tumoral. Ces limitations peuvent être résolues avec des modèles de culture (sphéroïdes) en 3 dimensions (3D) établis à partir d’échantillons de tumeurs humaines provenant de patients individuels. Ces cultures 3D représentent mieux la biologie du monde réel que les lignées cellulaires établies qui ne reflètent pas l’hétérogénéité tumorale. De plus, les cultures 3D sont meilleures que les modèles de culture en 2 dimensions (2D) (structures monocouches) car elles reproduisent des éléments de l’environnement tumoral, tels que l’hypoxie, la nécrose et l’adhésion cellulaire, et préservent la forme et la croissance naturelles des cellules. Dans la présente étude, une méthode a été développée pour préparer des cultures primaires de cellules cancéreuses provenant de patients individuels qui sont 3D et se développent dans des sphéroïdes multicellulaires. Les cellules peuvent être dérivées directement de tumeurs de patients ou de xénogreffes dérivées de patients. La méthode est largement applicable aux tumeurs solides (par exemple, le côlon, le sein et le poumon) et est également rentable, car elle peut être réalisée dans son intégralité dans un laboratoire typique de recherche sur le cancer / biologie cellulaire sans compter sur un équipement spécialisé. Ici, un protocole est présenté pour générer des modèles de culture tumorale 3D (sphéroïdes multicellulaires) à partir de cellules cancéreuses primaires et évaluer leur sensibilité aux médicaments en utilisant deux approches complémentaires: un test de viabilité cellulaire (MTT) et des examens microscopiques. Ces sphéroïdes multicellulaires peuvent être utilisés pour évaluer des candidats médicaments potentiels, identifier des biomarqueurs potentiels ou des cibles thérapeutiques, et étudier les mécanismes de réponse et de résistance.
Introduction
Les études in vitro et in vivo représentent des approches complémentaires pour le développement de traitements contre le cancer. Les modèles in vitro permettent de contrôler la plupart des variables expérimentales et facilitent les analyses quantitatives. Ils servent souvent de plates-formes de criblage à faible coût et peuvent également être utilisés pour des études mécanistes1. Cependant, leur pertinence biologique est intrinsèquement limitée, car de tels modèles ne reflètent que partiellement le microenvironnement tumoral1. En revanche, les modèles in vivo, tels que les xénogreffes dérivées de patients (PDX), capturent la complexité du microenvironnement tumoral et conviennent mieux aux études translationnelles et à l’individualisation du traitement chez les patients (c’est-à-dire l’étude de la réponse aux médicaments dans un modèle dérivé d’un patient individuel)1. Cependant, les modèles in vivo ne sont pas propices aux approches à haut débit pour le dépistage des médicaments, car les paramètres expérimentaux ne peuvent pas être contrôlés aussi étroitement que les modèles in vitro et parce que leur développement prend du temps, exige beaucoup de main-d’œuvre et coûtecher 1,2.
Les modèles in vitro sont disponibles depuis plus de 100 ans et les lignées cellulaires depuis plus de 70 ans3. Au cours des dernières décennies, cependant, la complexité des modèles in vitro disponibles de tumeurs solides a considérablement augmenté. Cette complexité va des modèles de culture en 2 dimensions (2D) (structures monocouches) qui sont soit des lignées cellulaires établies dérivées de tumeurs, soit des lignées cellulaires primaires aux approches plus récentes impliquant des modèles 3 dimensions (3D)1. Dans les modèles 2D, une distinction clé est entre les lignées cellulaires établies et primaires4. Les lignées cellulaires établies sont immortalisées; Par conséquent, la même lignée cellulaire peut être utilisée à l’échelle mondiale pendant de nombreuses années, ce qui, d’un point de vue historique, facilite la collaboration, l’accumulation de données et le développement de nombreuses stratégies de traitement. Cependant, les aberrations génétiques dans ces lignées cellulaires s’accumulent à chaque passage, compromettant ainsi leur pertinence biologique. De plus, le nombre limité de lignées cellulaires disponibles ne reflète pas l’hétérogénéité des tumeurs chez les patients 4,5. Les lignées cellulaires cancéreuses primaires sont dérivées directement d’échantillons tumoraux réséqués obtenus par biopsies, épanchements pleuraux ou résections. Par conséquent, les lignées cellulaires cancéreuses primaires sont plus pertinentes sur le plan biologique car elles préservent des éléments du microenvironnement tumoral et des caractéristiques tumorales, telles que les comportements intercellulaires (par exemple, la diaphonie entre les cellules saines et cancéreuses) et les phénotypes souches des cellules cancéreuses. Cependant, la capacité de réplication des lignées cellulaires primaires est limitée, ce qui conduit à un temps de culture étroit et limite le nombre de cellules tumorales pouvant être utilisées pour les analyses 4,5.
Les modèles utilisant des cultures 3D sont plus pertinents sur le plan biologique que les modèles de culture 2D puisque les conditions in vivo sont conservées. Ainsi, les modèles de culture 3D préservent la forme et la croissance naturelles des cellules et reproduisent des éléments de l’environnement tumoral, tels que l’hypoxie, la nécrose et l’adhésion cellulaire. Les modèles 3D les plus couramment utilisés dans la recherche sur le cancer comprennent les sphéroïdes multicellulaires, les structures à base d’échafaudages et les cultures matricielles intégrées 4,6,7.
Le présent protocole génère des modèles de culture tumorale 3D (sphéroïdes multicellulaires) à partir de cellules cancéreuses primaires et évalue leur sensibilité aux médicaments à l’aide de deux approches complémentaires : un test de viabilité cellulaire (MTT) et des examens microscopiques. Les résultats représentatifs présentés ici proviennent du cancer du sein et du côlon; Cependant, ce protocole est largement applicable à d’autres types de tumeurs solides (par exemple, le cholangiocarcinome, le cancer gastrique, le cancer du poumon et le cancer du pancréas) et est également rentable, car il peut être effectué dans son intégralité dans un laboratoire typique de recherche sur le cancer / biologie cellulaire sans compter sur un équipement spécialisé. Les sphéroïdes multicellulaires générés à l’aide de cette approche peuvent être utilisés pour évaluer les candidats médicaments potentiels, identifier des biomarqueurs potentiels ou des cibles thérapeutiques, et étudier les mécanismes de réponse et de résistance.
Ce protocole est divisé en trois sections : (1) la génération, la collecte et le comptage des sphéroïdes en vue de leur utilisation comme modèle pour tester l’efficacité des médicaments; (2) dosage MTT pour évaluer l’efficacité du médicament sur les sphéroïdes; et (3) l’évaluation microscopique des changements morphologiques à la suite du traitement des sphéroïdes avec des médicaments comme autre approche pour évaluer l’efficacité des médicaments (Figure 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Le présent protocole décrit une méthode simple pour générer des cultures cellulaires primaires 3D (sphéroïdes) dérivées d’échantillons de tumeurs humaines. Ces sphéroïdes peuvent être utilisés pour diverses analyses, y compris l’évaluation de candidats médicaments potentiels et de combinaisons de médicaments, l’identification de biomarqueurs potentiels ou de cibles thérapeutiques, et l’étude des mécanismes de réponse et de résistance. Le protocole utilise soit des cellules tumorales primaire…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Aucun.
Materials
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
| Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann – La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
Riferimenti
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