Summary
Detta protokoll beskriver generering av 3D-tumörodlingsmodeller från primära cancerceller och utvärdering av deras känslighet för läkemedel med hjälp av cellviabilitetsanalyser och mikroskopiska undersökningar.
Abstract
Trots anmärkningsvärda framsteg när det gäller att förstå tumörbiologi misslyckas de allra flesta onkologiska läkemedelskandidater som går in i kliniska prövningar, ofta på grund av brist på klinisk effekt. Denna höga felfrekvens belyser oförmågan hos de nuvarande prekliniska modellerna att förutsäga klinisk effekt, främst på grund av deras otillräcklighet när det gäller att reflektera tumörheterogenitet och tumörmikromiljön. Dessa begränsningar kan hanteras med 3-dimensionella (3D) odlingsmodeller (sfäroider) etablerade från humana tumörprover härrörande från enskilda patienter. Dessa 3D-kulturer representerar verklig biologi bättre än etablerade cellinjer som inte återspeglar tumörheterogenitet. Dessutom är 3D-kulturer bättre än 2-dimensionella (2D) odlingsmodeller (monolagerstrukturer) eftersom de replikerar element i tumörmiljön, såsom hypoxi, nekros och celladhesion, och bevarar den naturliga cellformen och tillväxten. I den aktuella studien har en metod utvecklats för att förbereda primära kulturer av cancerceller från enskilda patienter som är 3D och växer i flercelliga sfäroider. Cellerna kan härledas direkt från patienttumörer eller patient-derived xenotransplantts. Metoden är allmänt tillämplig på solida tumörer (t.ex. kolon, bröst och lunga) och är också kostnadseffektiv, eftersom den kan utföras i sin helhet i ett typiskt cancerforsknings- / cellbiologilaboratorium utan att förlita sig på specialutrustning. Här presenteras ett protokoll för att generera 3D-tumörodlingsmodeller (multicellulära sfäroider) från primära cancerceller och utvärdera deras känslighet för läkemedel med hjälp av två komplementära metoder: en cellviabilitetsanalys (MTT) och mikroskopiska undersökningar. Dessa flercelliga sfäroider kan användas för att bedöma potentiella läkemedelskandidater, identifiera potentiella biomarkörer eller terapeutiska mål och undersöka mekanismerna för respons och resistens.
Introduction
In vitro- och in vivo-studier representerar kompletterande metoder för att utveckla cancerbehandlingar. In vitro-modeller möjliggör kontroll av de flesta experimentella variabler och underlättar kvantitativa analyser. De fungerar ofta som billiga screeningplattformar och kan också användas för mekanistiska studier1. Deras biologiska relevans är emellertid i sig begränsad, eftersom sådana modeller endast delvis återspeglar tumörmikromiljön1. Däremot fångar in vivo-modeller, såsom patient-derived xenografts (PDX), komplexiteten i tumörmikromiljön och är mer lämpade för translationella studier och individualiserande behandling hos patienter (dvs. undersöker svaret på läkemedel i en modell härledd från en enskild patient)1. In vivo-modeller bidrar dock inte till metoder med hög kapacitet för läkemedelsscreening, eftersom de experimentella parametrarna inte kan kontrolleras lika noggrant som i in vitro-modeller och eftersom deras utveckling är tidskrävande, arbetsintensiv och kostsam 1,2.
In vitro-modeller har funnits i över 100 år, och cellinjer har funnits i över 70 år3. Under de senaste decennierna har dock komplexiteten hos de tillgängliga in vitro-modellerna av solida tumörer ökat dramatiskt. Denna komplexitet sträcker sig från 2-dimensionella (2D) odlingsmodeller (monolagerstrukturer) som antingen är tumörhärledda etablerade cellinjer eller primära cellinjer till de nyare metoderna som involverar 3-dimensionella (3D) modeller1. Inom 2D-modellerna är en viktig skillnad mellan de etablerade och primära cellinjerna4. Etablerade cellinjer förevigas; Därför kan samma cellinje användas globalt under många år, vilket ur ett historiskt perspektiv underlättar samarbete, ackumulering av data och utveckling av många behandlingsstrategier. Men genetiska avvikelser i dessa cellinjer ackumuleras med varje passage, vilket äventyrar deras biologiska relevans. Dessutom återspeglar det begränsade antalet tillgängliga cellinjer inte heterogeniteten hos tumörer hos patienter 4,5. Primära cancercellinjer härrör direkt från resekterade tumörprover erhållna via biopsier, pleurautgjutningar eller resektioner. Därför är primära cancercellinjer mer biologiskt relevanta eftersom de bevarar delar av tumörmikromiljön och tumöregenskaperna, såsom intercellulära beteenden (t.ex. överhörning mellan friska och cancerceller) och de stamliknande fenotyperna av cancerceller. Den replikerande kapaciteten hos primära cellinjer är dock begränsad, vilket leder till en smal odlingstid och begränsar antalet tumörceller som kan användas för analyser 4,5.
Modeller som använder 3D-kulturer är mer biologiskt relevanta än 2D-odlingsmodeller eftersom in vivo-förhållandena bibehålls. Således bevarar 3D-odlingsmodeller den naturliga cellformen och tillväxten och replikerar element i tumörmiljön, såsom hypoxi, nekros och celladhesion. De vanligaste 3D-modellerna inom cancerforskning inkluderar flercelliga sfäroider, byggnadsställningsbaserade strukturer och matrisinbäddade kulturer 4,6,7.
Det nuvarande protokollet genererar 3D-tumörodlingsmodeller (multicellulära sfäroider) från primära cancerceller och utvärderar deras känslighet för läkemedel med hjälp av två komplementära metoder: en cellviabilitetsanalys (MTT) och mikroskopiska undersökningar. De representativa resultaten som presenteras här är från bröst- och tjocktarmscancer; Detta protokoll är emellertid allmänt tillämpligt på andra solida tumörtyper (t.ex. kolangiokarcinom, mag-, lung- och bukspottskörtelcancer) och är också kostnadseffektivt, eftersom det kan utföras i sin helhet i ett typiskt cancerforsknings- / cellbiologilaboratorium utan att förlita sig på specialutrustning. De flercelliga sfäroiderna som genereras med detta tillvägagångssätt kan användas för att bedöma potentiella läkemedelskandidater, identifiera potentiella biomarkörer eller terapeutiska mål och undersöka mekanismerna för respons och resistens.
Detta protokoll är uppdelat i tre avsnitt: (1) generering, insamling och räkning av sfäroiderna som förberedelse för deras användning som modell för testning av läkemedelseffektivitet; (2) MTT-analys för att bedöma läkemedelseffektivitet på sfäroiderna; och (3) den mikroskopiska utvärderingen av morfologiska förändringar efter behandling av sfäroiderna med läkemedel som en annan metod för att utvärdera läkemedelseffektivitet (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Insamlingen av humana tumörprover som används för de primära tumörcellkulturerna utfördes enligt institutionella granskningsnämndens (IRB) godkända protokoll vid Rabin Medical Center med skriftligt informerat samtycke från patienterna. Patienter som var lämpliga att delta i studien inkluderade manliga och kvinnliga vuxna och pediatriska cancerpatienter med icke-metastaserande bröst-, kolon-, lever-, lung-, neuroendokrina, äggstocks- eller bukspottkörtelcancer, någon barncancer eller någon metastaserad cancer. Det enda uteslutningskriteriet var bristen på förmåga att ge informerat samtycke.
1. Generering och insamling av sfäroider
OBS: Isoleringen av primära tumörceller kan utföras enligt beskrivningen av Kodak et al.8. Viktigt är att primära tumörceller som används för att generera sfäroiderna kan härledas direkt från patientprover erhållna genom biopsi, resektion etc., eller indirekt med hjälp av tumörprover från patienthärledda xenograftmodeller (PDX), som beskrivs av Moskovits et al.9.
- Bered en encellssuspension av vidhäftande primära tumörcellkulturer med 75–100 % sammanflöde genom att ta en liten kolv (T25) med en encellsvidhäftande primärcellodling, avlägsna cellodlingsmediet, tvätta med PBS och sedan tillsätta 1 ml 1x accutas (en cellavskiljningslösning) (se materialförteckningen) i 3 minuter vid 37 °C.
- Neutralisera accutase-lösningen genom att tillsätta 5 ml cellodlingsmedium (RPMI-1640-odlingsmedium kompletterat med 10% FBS, 1:100 penicillin-streptomycin, 1% icke-essentiella aminosyror och 1% L-glutamin; se materialtabellen).
- Aspirera cellerna med en 10 ml serologisk pipett och deponera dem i ett 15 ml koniskt rör. Centrifugera röret vid 800 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Ta bort cellodlingsmediet, tillsätt 5 ml färskt cellodlingsmedium ovanpå cellpelleten och blanda försiktigt.
- Räkna de livskraftiga cellerna med en hemocytometer10. För att göra detta, ta en alikvot av 50 μL av cellsuspensionen och blanda den med 50 μL trypanblått. Räkna de levande cellerna (cellerna som är negativa för blå färg) och beräkna det totala antalet levande celler i suspensionen.
- Bered ett "3D-odlingsmedium" (ett cellodlingsmedium kompletterat med 5% basalmembranmatris; se materialtabellen).
OBS: "3D-odlingsmediet" är vätskeliknande vid rumstemperatur. Vid 37 °C blir konsistensen mer gelliknande (så att cellerna håller ihop), även om den fortfarande kan pipetteras (eftersom den endast innehåller 5% basalmembranmatris). - Beräkna antalet celler som behövs för analysen och den totala volymen som krävs; varje brunn måste innehålla 2 000-8 000 celler i 200 μL medium.
- Bered en cellsuspension med önskat antal celler (t.ex. 4 000 celler) i 200 μL av "3D-odlingsmediet" och blanda försiktigt med pipetten för att säkerställa en homogen fördelning.
- Överför suspensionen till en pipetteringsbehållare. Tillsätt med hjälp av en flerkanalig pipett 200 μL av cellsuspensionen till varje brunn på en 96-brunnsplatta med ultralåg infästning (se materialtabellen). Blanda suspensionen väl före varje samling av cellerna.
- Centrifugera plattan vid 300 x g i 10 minuter vid rumstemperatur för att framtvinga klustring av cellerna och därigenom förbättra cellaggregeringen och inkubera plattan vid 37 °C i en 5% CO2 fuktad inkubator.
- Var 2-3: e dag, uppdatera "3D-kulturmediet". Centrifugera plattan vid 300 x g i 10 minuter vid rumstemperatur, ta försiktigt bort och kassera 50% av mediet (100 μL) och tillsätt 100 μL färskt "3D-odlingsmedium" för att ersätta den befintliga lösningen. Upprepa steg 1.11 och sätt tillbaka plattan i den fuktade inkubatorn på 37 °C, 5 % CO2.
OBS: Avlägsnandet av mediet måste utföras när plattan hålls vid 45 °, och mediet får endast samlas upp från den övre delen för att undvika att cellerna samlas upp. Ett vakuumsugsystem bör inte användas. Det färska mediet måste tillsättas långsamt och försiktigt för att inte störa sfäroiderna, som redan har börjat bildas. - Inspektera cellerna under ett mikroskop var 1-2: e dag för att övervaka sfäroidbildning. Mät diametern på sfäroiderna som bildas med hjälp av "skalverktyget" i bildbehandlingsprogrammet (se materialtabellen).
OBS: Mikroskopisk inspektion bör först avslöja oregelbundna runda till ovala kroppar som antar en sfäroid form när tiden går11,12.- När sfäroiddiametern når 100-200 μm, utför läkemedelseffektivitetsexperimenten.
OBS: Läkemedelseffektivitetsexperimenten utförs när sfäroiderna når denna diameter eftersom majoriteten av cellerna vid den tiden sprider sig, vilket bidrar till att utvärdera svaret på behandlingen. Sfäroider med större diameter innehåller en nekrotisk kärna och ett vilande skikt11,12, vilket resulterar i en mindre andel prolifererande celler som svarar på behandlingen.
- När sfäroiddiametern når 100-200 μm, utför läkemedelseffektivitetsexperimenten.
- För sfäroiduppsamling, använd en 1 000 μL pipett för att samla upp sfäroiderna från varje brunn och deponera dem i ett 15 ml koniskt rör.
OBS: Sfäroider är i sig ömtåliga och kräver skonsam hantering. När du överför mediet med sfäroiderna till det koniska röret, håll röret vid 45 ° och pipettera långsamt på rörets vägg. Sfäroider är synliga för ögat. - Centrifugera det koniska röret vid 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur och aspirera försiktigt och kassera supernatanten med en pipett.
- Tillsätt 0,5 ml av cellodlingsmediet och suspendera pelleten väl men försiktigt. Undvik att göra bubblor.
- Utför sfäroidräkning enligt stegen nedan.
- Använd en platta med 96 brunnar och rita ett plustecken på undersidan av en brunn för att dela brunnen i kvadranter (för att hjälpa till att spåra räkningen).
- Tillsätt 50 μL av suspensionen i brunnen och räkna sfäroiderna manuellt under mikroskopet (med en 10x objektivlins).
- Räkna sfäroiderna i varje kvadrant, var försiktig så att du inte dubbelräknar och beräkna det totala antalet sfäroider i brunnen.
OBS: För noggrannhet i räkningen, räkna minst 50 sfäroider i en brunn. Om det finns mindre än 50 sfäroider, blanda försiktigt suspensionen för att säkerställa homogen fördelning och räkna igen med en större volym av suspensionen tillsatt till en ny brunn. Alternativt, om det finns mindre än 50 sfäroider i en brunn, kan sfäroiderna centrifugeras och återsuspenderas försiktigt i en volym av <0,5 ml. Om det finns över 100 sfäroider, tillsätt cellodlingsmedium till sfäroidsuspensionen, blanda försiktigt och berätta. - Beräkna sfäroidkoncentrationen (antal sfäroider/räknevolym [μL]) och beräkna sedan det totala antalet sfäroider i suspensionen (sfäroidkoncentration × total volym).
2. Analys av läkemedelseffekt (MTT-analys)
OBS: För mer information, se van Meerloo et al.13. För MTT-testet måste dessutom endast cellodlingsmediet och inte "3D-odlingsmediet" användas (tillsats av basalmembranmatrisen är inte nödvändig och kan potentiellt störa MTT-testet).
- I ett nytt rör, bereda en sfäroidsuspension i en koncentration av 200 sfäroider per 200 μL cellodlingsmedium (RPMI-1640 odlingsmedium kompletterat med 10% FBS, 1:100 penicillin-streptomycin, 1% icke-essentiella aminosyror och 1% L-glutamin).
- För varje läkemedelsbehandling, förbered ett lager av sfäroider i ett 15 ml rör. Beräkna den mängd som behövs för varje läkemedel med antalet brunnar som behövs för upprepningar: (5-8) × 200 μL. Tillsätt läkemedlet till röret till den slutliga koncentrationen som behövs.
OBS: Se avsnittet representativa resultat om de läkemedel som används för den aktuella studien och deras dosering. Dessutom anges de kommersiella detaljerna för drogerna i materialförteckningen.
- För varje läkemedelsbehandling, förbered ett lager av sfäroider i ett 15 ml rör. Beräkna den mängd som behövs för varje läkemedel med antalet brunnar som behövs för upprepningar: (5-8) × 200 μL. Tillsätt läkemedlet till röret till den slutliga koncentrationen som behövs.
- Överför 200 μl sfäroidsuspension till brunnarna på en 96-brunnsplatta med ultralåg fastsättning och inkubera plattan vid 37 °C i en 5 % CO2 fuktad inkubator. Använd inte de yttre raderna och kolumnerna på 96-brunnsplattan för analysen, eftersom dessa brunnar kännetecknas av ökad avdunstning, vilket kan leda till ökad variation mellan de upprepade experimenten; lägg istället till PBS till dessa brunnar.
OBS: Det är viktigt att kulturen av sfäroiderna är homogen innan kulturen alikvoteras i 96-brunnsplattan. Dessutom måste ett kontrollvillkor (dvs. obehandlade sfäroider) inkluderas i varje experiment. - Efter inkubation av sfäroiderna med studieläkemedlet i 24-72 timmar, centrifugera plattan vid 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur och avlägsna försiktigt 170 μL av cellodlingsmediet och lämna 30 μL (som inkluderar sfäroiderna) i botten brunnen.
OBS: Avlägsnandet av 170 μL cellodlingsmedium måste göras försiktigt för att inte avlägsna sfäroiderna. Håll plattan i 45° och placera ena handen (med en mörk handske som kontrast) under brunnarna så att sfäroiderna syns (vita prickar). - Bered MTT-lösningen (0,714 mg/ml i fenolfritt RPMI, se materialtabellen).
- Tillsätt 70 μL MTT-lösning till varje brunn till en slutlig volym på 100 μl per brunn (den slutliga MTT-koncentrationen i brunnen blir 0,05 mg per 100 μl). Förbered dessutom "Blank" brunnar med MTT-lösning utan celler.
MTT är ljuskänslig. Därför måste ljuset i huven stängas av och röret som innehåller MTT-lösningen måste täckas med aluminiumfolie. - Inkubera plattan vid 37 °C i en 5% CO2 fuktad inkubator i 3-4 timmar tills en förändring i lösningens färg i brunnarna (lila färg representerar levande celler) observeras.
- När en förändring observeras, tillsätt 100 μL stopplösning (0,1N HCl i isopropanol) till varje brunn och blanda försiktigt innehållet i brunnarna utan att skapa bubblor.
- Läs plattans absorbans i en fluorometer-ELISA-läsare (se materialtabellen) vid en våglängd på 570 nm och en bakgrundsvåglängd på 630-690 nM.
OBS: Om den tillgängliga fluormätaren-ELISA-läsaren inte kan läsa den ultralåga 96-brunnsplattan, överför innehållet i varje brunn till en motsvarande 96-brunnsplatta med platt botten. - Beräkna cellviabiliteten enligt stegen nedan.
- För varje brunn beräknar du den "specifika signalen" ("specifik signal" = signalen vid 570 nm - signalen vid 630-690 nm). Beräkna sedan medelvärdet för de "tomma" brunnarna och subtrahera detta värde från varje brunn.
- Beräkna medelvärdet av de "specifika signalerna" i kontrollbrunnarna som innehåller celler som inte behandlades med studieläkemedlet ("AV-SS-unt").
- Beräkna livskraften (procent) av celler i varje brunn i förhållande till brunnarna med obehandlade celler.
OBS: Viability = (specifik signal i varje brunn/"AV-SS-unt") × 100
3. Övervakning och analys av de morfologiska förändringarna i sfäroiderna
OBS: När det gäller MTT-analysen bör endast cellodlingsmediet och inte "3D-odlingsmediet" användas i denna utvärdering (tillsats av basalmembranmatrisen är inte nödvändig och kan potentiellt störa analysen).
- Efter räkning av sfäroiderna, späd suspensionen i cellodlingsmediet (RPMI-1640-odlingsmediet kompletterat med 10% FBS, 1:100 penicillin-streptomycin, 1% icke-essentiella aminosyror och 1% L-glutamin) till cirka 1-2 sfäroider per 20 μl.
- Sätt 80 μL cellodlingsmedium i brunnarna på en 96-brunnsplatta med ultralåg fastsättning och tillsätt sedan 20 μL sfäroidsuspension till brunnarna.
OBS: Brunnarna kommer därför att innehålla 1-2 sfäroider i en volym av 100 μL. - Kontrollera noggrant brunnarna under mikroskopet och markera brunnarna som innehåller en sfäroid, eftersom de kommer att användas för denna analys.
- Förbered studieläkemedlet i en koncentration som är dubbelt så stor som koncentrationen av intresse. Tillsätt 100 μL av läkemedelslösningen till relevanta brunnar (den totala koncentrationen i brunnen blir då 1x).
- Ta en bild av varje brunn vid dag 0 (innan du lägger till studieläkemedlet) och använd "skala" -verktyget i bildprogramvaran (se materialtabellen) för att bestämma sfäroidernas diametrar.
- Inkubera plattan vid 37 °C i en 5% CO2 fuktad inkubator och undersök morfologin och mät sfäroidernas diameter (med hjälp av "skalverktyget") dagligen i 3-7 dagar, beroende på när läkemedelseffekten observeras (t.ex. cellspridning, invasiva skida, strukturförstöring etc.).
- I slutet av experimentet plottar du förändringarna i sfäroiddiametrar (i förhållande till dag 0) över tiden.
OBS: Förändring (procent) = (sfäroiddiameter vid en viss dag / diametern på den sfäroiden vid dag 0) × 100
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll presenterar procedurer för att generera en homogen kultur av sfäroider från primära tumörceller, kvantitativt utvärdera läkemedelseffekt på sfäroidkultur (MTT-analys) och bestämma effekten av studieläkemedel på sfäroidmorfologi. Data från representativa experiment i sfäroider genererade från kolon- och bröstcancercellkulturer presenteras. Liknande experiment utfördes med användning av andra tumörtyper, inklusive kolangiokarcinom, mag-, lung- och bukspottskörtelcancer (data visas inte). Alla experiment som presenteras här utfördes i tre exemplar.
Figur 2 visar sfäroiderna som genererades från den primära koloncancercellkulturen. Som framgår av figur 2 beror antalet sfäroider som genereras på antalet celler som ursprungligen såddes i varje brunn. Tillväxten av sfäroiderna till över 100 μm i diameter tog 10-14 dagar. Tumörcellernas ursprung (t.ex. olika patienter och olika ursprung) bestämde tillväxthastigheten. Sådd av brunnarna med fler celler förkortade inte den tid som krävdes för sfäroidgenerering utan ökade snarare antalet sfäroider som bildades. I synnerhet, vid långvarig odling av koloncancersfäroiderna, började de fästa vid varandra och bildade kluster av sfäroider i druvliknande strukturer (figur 3), vilket förhindrade en homogen kultur och därmed förbjöd användningen av sfäroiderna i MTT-analyserna.
Figur 4 visar effekten av tre behandlingar (10 μM palbociclib, 10 μM sunitinib och deras kombination vid 10 μM vardera) på livskraften hos sfäroider härrörande från två primära cancerformer. I detta fall etablerades en PDX-modell först, och tumörcellerna som användes för sfäroidanalysen härleddes från PDX-modellen9. Den första PDX-modellen etablerades med hjälp av ett koloncancerprov från en 50-årig manlig patient och den andra med ett bröstcancerprov från en 62-årig kvinna. Som framgår av figur 4A,B ledde kombinationen palbociklib plus sunitinib efter 3 dagars behandling till en signifikant minskning av viabiliteten mätt med MTT-testet. Som framgår av figur 4C,D var de morfologiska förändringar som inträffade vid behandling mycket tydliga. På dag 0 var alla sfäroider intakta. Däremot var sfäroiderna behandlade med kontrollen (DMSO) på dag 3 fortfarande intakta, medan sfäroiderna behandlade med kombinationen demonterades och deras morfologi var "öppen", med celler som lossnade från den fasta strukturen, vilket tyder på förstörelsen av sfäroidstrukturen.
Figur 5 visar uppföljningen av sfäroiderna över tid. Dessa sfäroider, genererade från bröstcancerceller härrörande från en 44-årig kvinnlig patient, behandlades med en av två kombinationer (trastuzumab [10 μg/ml] plus vinorelbin [1 μg/ml], eller 5-fluorouracil [200 μM] plus cisplatin [300 μM]). Som visas i figur 5A minskade storleken på sfäroiderna som behandlades med 5-fluorouracil plus cisplatin dag 3 och sfäroiderna var helt förstörda dag 7. Däremot hade behandlingen med trastuzumab plus vinorelbin endast en mindre effekt på sfäroidernas morfologi (t.ex. en viss nivå av en "öppen" struktur), men effekten var inte signifikant. Figur 5B visar den genomsnittliga förändringen i sfäroidernas diameter jämfört med dag 0 (fem sfäroider följdes i varje behandlingsgrupp).
Figur 1: Översikt över protokollet för att etablera 3D-sfäroider från patienthärledda tumörprover och utvärdera deras känslighet för läkemedel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Bildning av sfäroider från en primär koloncancercellkultur över tid med antalet ursprungligen sådda celler. Olika antal celler såddes i "3D-odlingsmedium" i en ultralåg fästplatta med 96 brunnar och observerades under mikroskopet (4x förstoring). Skalstapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Sfäroider från primära koloncancerceller (med initial cellsådd på 2 000 per brunn) efter 12 dagar i odling. De två exemplen (A,B) visar kluster som skapats genom att sfäroider fästs vid varandra (10x förstoring). Skalstapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Effekterna av palbociklib (10 μM), sunitinib (10 μM) och deras kombination (10 μM vardera) på sfäroider från primära tumörceller, inklusive tjocktarms- och bröstcancer (PDX-härledd). En MTT-analys utfördes på sfäroider härrörande från (A) kolon och (B) bröstcancerceller. MTT-signalerna normaliserades till värden från DMSO-behandlade celler. Värdena representerar medelvärdet från fyra till åtta replikat. Felstaplarna representerar SEM. *p < 0,05 jämfört med en enskild agent (t-test). Effekterna av de olika behandlingarna på celltillväxt utvärderades också mikroskopiskt vid dag 0 och efter 3 dagars behandling av sfäroider härrörande från (C) kolon och (D) bröstcancerceller (10x förstoring). Skalstång = 100 μm. Figuren är anpassad från Moskovits et al.9. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Effekterna av trastuzumab (10 μg/ml) plus vinorelbin (1 μg/ml) och 5-fluorouracil (200 μM) plus cisplatin (300 μM) på sfäroider från bröstcancer över tid. (A) Varje brunn inkluderade en sfäroid och övervakades över tid under mikroskopet (10x förstoring). Skalstång = 100 μm. (B) Förändringen i sfäroidernas diameter (i förhållande till dag 0) med behandlingstiden. *p = 0,05 för 5-fluorouracil plus cisplatin jämfört med kontroller (t-test). Varje behandlingsgrupp inkluderade fyra till sex brunnar, med en sfäroid i varje brunn. Den genomsnittliga förändringen presenteras. Felstaplarna representerar SEM. Klicka här för att se en större version av denna bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en enkel metod för att generera primära 3D-cellkulturer (sfäroider) härledda från humana tumörprover. Dessa sfäroider kan användas för olika analyser, inklusive utvärdering av potentiella läkemedelskandidater och läkemedelskombinationer, identifiering av potentiella biomarkörer eller terapeutiska mål och undersökning av mekanismerna för respons och resistens. Protokollet använder antingen primära tumörceller som härrör direkt från patientprover eller tumörceller från PDX-modeller, som kan fastställas med hjälp av patientprover. Det senare tillvägagångssättet möjliggör in vitro - och in vivo-experiment med samma primära tumör. Konsistens har tidigare visats i resultaten av läkemedelskänslighetsexperiment mellan PDX-modeller och 3D-kulturer härledda från dessa modeller9, vilket stöder relevansen av denna in vitro / in vivo-strategi .
De främsta fördelarna med det nuvarande protokollet inkluderar dess breda tillämplighet på de flesta solida tumörer och dess kostnadseffektivitet, som härrör från dess kompatibilitet med den typiska kapaciteten / utrustningen för cancerforskning / cellbiologilaboratorier (dvs. inget behov av specialutrustning eller outsourcing). Dessutom genererar det nuvarande protokollet en homogen sfäroidpopulation, vilket möjliggör användning av kvantitativa viabilitetsanalyser med hög genomströmning (t.ex. MTT). Att generera en homogen sfäroidpopulation är viktigt för att uppnå meningsfulla resultat, eftersom studier har visat att sfäroidstorleken påverkar svaret på behandlingen. Större sfäroider, till skillnad från mindre sfäroider, kännetecknas av en nekrotisk kärna. De flesta celler är emellertid i det linjära tillväxtstadiet i mindre sfäroider. Vidare påverkar sfäroidens storlek också styvheten i dess vävnadsstruktur, vilket kan påverka diffusionen av föreningar (såsom de som används för livskraftsanalyserna) i sfäroid14. Huvudbegränsningen i det nuvarande protokollet är att även med dess breda tillämplighet finns det fall då tillvägagångssättet misslyckas med att generera sfäroider. Det är viktigt att ett sådant misslyckande inte är tumörtypspecifikt utan snarare patientspecifikt. Ytterligare studier krävs för att undersöka varför tumörprover från vissa patienter inte bildar sfäroider med hjälp av detta protokoll.
Det nuvarande protokollet är baserat på två huvudprinciper: (1) att ha en cellsuspension utan cellkluster (dvs. en encellssuspension) och (2) att använda en ultralåg fästplatta med ett medium innehållande 5% basalmembranmatris (en solubiliserad extracellulär matris). Det initiala antalet seedade celler påverkar antalet sfäroider som bildas men inte den tid som krävs för sfäroidbildning, vilket tyder på att varje sfäroid genereras från en enda tumörcell. I synnerhet förekommer kluster av sfäroider, särskilt efter långvarig inkubation. Denna klustring stör den homogena kulturen och förbjuder användning av MTT (på grund av svårigheten att dispensera lika många sfäroider i varje brunn). Denna klustring kan undvikas genom att späda kulturen och överföra sfäroiderna till större brunnar. Om en homogen kultur inte kan uppnås kan MTT-tester inte användas, även om den morfologiska bedömningen och mätningen av sfäroiddiametrarna fortfarande kan utföras. Det måste noteras att den morfologiska bedömningen är mer arbetsintensiv eftersom den kräver tilldelning av en sfäroid per brunn och övervakning av varje sfäroid under mikroskopet.
Att bestämma lämpligt antal sfäroider för en MTT-analys är viktigt för dess tolkning. Därför rekommenderas att först generera en standardkurva med känt antal sfäroider (t.ex. 50, 100, 200 och 400 per brunn, i replikat) för att bestämma det optimala antalet sfäroider för MTT-analysen. Mitten av diagrammets linjära område måste användas för analysen så att det finns tillräckligt med sfäroider för att detektera en signal men inte för många (dvs. så att signalens platåfas inte uppnås). Vidare möjliggör användning av mellanområdet att hålla signalen inom det linjära området i fall av svar på läkemedlet (dvs reducerad signal), såväl som icke-svar (dvs den fortsatta tillväxten av sfäroiden och ökad signal). Slutligen, eftersom MTT-analysen bedömer cellmetabolisk aktivitet, som kan skilja sig mellan tumörer från olika patienter, bör en standardkurva genereras för varje primärt tumörprov.
Sammanfattningsvis representerar detta protokoll för att generera 3D-tumörodlingsmodeller från primära cancerceller och utvärdera deras känslighet för läkemedel med hjälp av en cellviabilitetsanalys (MTT) och morfologisk undersökning under mikroskopet ett värdefullt, biologiskt relevant verktyg som kompletterar de nuvarande 2D in vitro-metoderna såväl som in vivo-metoderna .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
| Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
References
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
- Richter, M., et al. From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).
- Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy. Revista de Investigación Clínica. 71 (6), 369-380 (2019).
- Choi, J. R., et al. In vitro human cancer models for biomedical applications. Cancers. 14 (9), 2284 (2022).
- Eglen, R. M., Randle, D. H. Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).
- Kodack, D. P., et al. Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care. Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).
- Moskovits, N., et al. Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types. Cancer Letters. 536, 215665 (2022).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).
- Brajša, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jelić, D. Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery. Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).
- Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).
- van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: The MTT assay. Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).
- Walzl, A., et al. The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).
