Summary
Il presente protocollo descrive la generazione di modelli di coltura tumorale 3D da cellule tumorali primarie e la valutazione della loro sensibilità ai farmaci utilizzando saggi di vitalità cellulare ed esami microscopici.
Abstract
Nonostante i notevoli progressi nella comprensione della biologia tumorale, la stragrande maggioranza dei candidati farmaci oncologici che entrano negli studi clinici falliscono, spesso a causa della mancanza di efficacia clinica. Questo alto tasso di fallimento illumina l'incapacità degli attuali modelli preclinici di prevedere l'efficacia clinica, principalmente a causa della loro inadeguatezza nel riflettere l'eterogeneità del tumore e il microambiente tumorale. Queste limitazioni possono essere affrontate con modelli di coltura tridimensionali (3D) (sferoidi) stabiliti da campioni di tumore umano derivati da singoli pazienti. Queste colture 3D rappresentano la biologia del mondo reale meglio delle linee cellulari stabilite che non riflettono l'eterogeneità del tumore. Inoltre, le colture 3D sono migliori dei modelli di coltura bidimensionale (2D) (strutture monostrato) poiché replicano elementi dell'ambiente tumorale, come ipossia, necrosi e adesione cellulare, e preservano la forma e la crescita naturale delle cellule. Nel presente studio, è stato sviluppato un metodo per preparare colture primarie di cellule tumorali da singoli pazienti che sono 3D e crescono in sferoidi multicellulari. Le cellule possono essere derivate direttamente da tumori del paziente o xenotrapianti derivati dal paziente. Il metodo è ampiamente applicabile ai tumori solidi (ad esempio, colon, seno e polmone) ed è anche conveniente, in quanto può essere eseguito nella sua interezza in un tipico laboratorio di ricerca sul cancro / biologia cellulare senza fare affidamento su attrezzature specializzate. Qui viene presentato un protocollo per generare modelli di coltura tumorale 3D (sferoidi multicellulari) da cellule tumorali primarie e valutare la loro sensibilità ai farmaci utilizzando due approcci complementari: un saggio di vitalità cellulare (MTT) e esami microscopici. Questi sferoidi multicellulari possono essere utilizzati per valutare potenziali candidati farmacologici, identificare potenziali biomarcatori o bersagli terapeutici e studiare i meccanismi di risposta e resistenza.
Introduction
Gli studi in vitro e in vivo rappresentano approcci complementari per lo sviluppo di trattamenti contro il cancro. I modelli in vitro consentono il controllo della maggior parte delle variabili sperimentali e facilitano le analisi quantitative. Spesso fungono da piattaforme di screening a basso costo e possono essere utilizzati anche per studi meccanicistici1. Tuttavia, la loro rilevanza biologica è intrinsecamente limitata, in quanto tali modelli riflettono solo parzialmente il microambiente tumorale1. Al contrario, i modelli in vivo, come gli xenotrapianti derivati dal paziente (PDX), catturano la complessità del microambiente tumorale e sono più adatti per studi traslazionali e trattamenti individualizzanti nei pazienti (cioè, studiando la risposta ai farmaci in un modello derivato da un singolo paziente)1. Tuttavia, i modelli in vivo non favoriscono approcci ad alto rendimento per lo screening dei farmaci, poiché i parametri sperimentali non possono essere controllati strettamente come nei modelli in vitro e perché il loro sviluppo richiede tempo, manodopera e costoso 1,2.
I modelli in vitro sono disponibili da oltre 100 anni e le linee cellulari sono disponibili da oltre 70 anni3. Negli ultimi decenni, tuttavia, la complessità dei modelli in vitro disponibili di tumori solidi è aumentata drammaticamente. Questa complessità varia da modelli di coltura 2-dimensionali (2D) (strutture monostrato) che sono linee cellulari stabilite derivate dal tumore o linee cellulari primarie agli approcci più recenti che coinvolgono modelli tridimensionali (3D)1. All'interno dei modelli 2D, una distinzione chiave è tra le linee cellulari stabilite e primarie4. Le linee cellulari stabilite sono immortalate; Pertanto, la stessa linea cellulare può essere utilizzata globalmente per molti anni, il che da una prospettiva storica, facilita la collaborazione, l'accumulo di dati e lo sviluppo di molte strategie di trattamento. Tuttavia, le aberrazioni genetiche in queste linee cellulari si accumulano ad ogni passaggio, compromettendo così la loro rilevanza biologica. Inoltre, il numero limitato di linee cellulari disponibili non riflette l'eterogeneità dei tumori nei pazienti 4,5. Le linee cellulari tumorali primarie derivano direttamente da campioni tumorali resecati ottenuti tramite biopsie, versamenti pleurici o resezioni. Pertanto, le linee cellulari tumorali primarie sono biologicamente più rilevanti in quanto conservano elementi del microambiente tumorale e le caratteristiche tumorali, come i comportamenti intercellulari (ad esempio, cross-talk tra cellule sane e cancerose) e i fenotipi staminali delle cellule tumorali. Tuttavia, la capacità replicativa delle linee cellulari primarie è limitata, il che porta a un tempo di coltura ristretto e limita il numero di cellule tumorali che possono essere utilizzate per le analisi 4,5.
I modelli che utilizzano colture 3D sono biologicamente più rilevanti dei modelli di coltura 2D poiché le condizioni in vivo vengono mantenute. Pertanto, i modelli di coltura 3D preservano la forma e la crescita naturale delle cellule e replicano elementi dell'ambiente tumorale, come ipossia, necrosi e adesione cellulare. I modelli 3D più comunemente usati nella ricerca sul cancro includono sferoidi multicellulari, strutture basate su scaffold e colture incorporate nella matrice 4,6,7.
Il presente protocollo genera modelli di coltura tumorale 3D (sferoidi multicellulari) da cellule tumorali primarie e valuta la loro sensibilità ai farmaci utilizzando due approcci complementari: un saggio di vitalità cellulare (MTT) ed esami microscopici. I risultati rappresentativi qui presentati provengono dal cancro al seno e al colon; Tuttavia, questo protocollo è ampiamente applicabile ad altri tipi di tumore solido (ad esempio, colangiocarcinoma, cancro gastrico, polmonare e pancreatico) ed è anche conveniente, in quanto può essere eseguito nella sua interezza in un tipico laboratorio di ricerca sul cancro / biologia cellulare senza fare affidamento su attrezzature specializzate. Gli sferoidi multicellulari generati utilizzando questo approccio possono essere utilizzati per valutare potenziali candidati farmacologici, identificare potenziali biomarcatori o bersagli terapeutici e studiare i meccanismi di risposta e resistenza.
Questo protocollo è diviso in tre sezioni: (1) la generazione, la raccolta e il conteggio degli sferoidi in preparazione al loro uso come modello per testare l'efficacia dei farmaci; (2) Saggio MTT per valutare l'efficacia del farmaco sugli sferoidi; e (3) la valutazione microscopica dei cambiamenti morfologici a seguito del trattamento degli sferoidi con farmaci come un altro approccio per valutare l'efficacia del farmaco (Figura 1).
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Protocol
La raccolta di campioni di tumore umano utilizzati per le colture di cellule tumorali primarie è stata eseguita secondo i protocolli approvati dal comitato di revisione istituzionale (IRB) presso il Rabin Medical Center con il consenso informato scritto dei pazienti. I pazienti eleggibili per la partecipazione allo studio includevano pazienti con cancro adulto e pediatrico di sesso maschile e femminile con cancro al seno, al colon, al fegato, ai polmoni, neuroendocrino, ovarico o pancreatico non metastatico, qualsiasi cancro pediatrico o qualsiasi cancro metastatico. L'unico criterio di esclusione era la mancanza di capacità di fornire il consenso informato.
1. Generazione e raccolta di sferoidi
NOTA: L'isolamento delle cellule tumorali primarie può essere eseguito come descritto da Kodak et al.8. È importante sottolineare che le cellule tumorali primarie utilizzate per generare gli sferoidi possono essere derivate direttamente da campioni di pazienti ottenuti da biopsia, resezione, ecc., O indirettamente utilizzando campioni tumorali da modelli di xenotrapianto derivati dal paziente (PDX), come descritto da Moskovits et al.9.
- Preparare una sospensione unicellulare di colture cellulari tumorali primarie aderenti di confluenza del 75%-100% prendendo un piccolo matraccio (T25) con una coltura cellulare primaria aderente unicellulare, rimuovendo il terreno di coltura cellulare, lavando con PBS e quindi aggiungendo 1 mL di 1x Accutase (una soluzione di distacco cellulare) (vedere la Tabella dei materiali) per 3 minuti a 37 °C.
- Neutralizzare la soluzione di Accutase aggiungendo 5 ml di terreno di coltura cellulare (terreno di coltura RPMI-1640 integrato con 10% FBS, 1:100 penicillina-streptomicina, 1% aminoacidi non essenziali e 1% L-glutammina; vedere la Tabella dei materiali).
- Aspirare le cellule con una pipetta sierologica da 10 ml e depositarle in una provetta conica da 15 ml. Centrifugare il tubo a 800 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il terreno di coltura cellulare, aggiungere 5 ml di terreno di coltura cellulare fresco sopra il pellet cellulare e mescolare delicatamente.
- Contare le cellule vitali con un emocitometro10. Per fare ciò, prendere un'aliquota di 50 μL della sospensione cellulare e mescolarla con 50 μL di tripano blu. Contare le celle vive (le celle negative per il colore blu) e calcolare il numero totale di celle vive nella sospensione.
- Preparare un "terreno di coltura 3D" (un terreno di coltura cellulare integrato con una matrice di membrana basale al 5%; vedere la tabella dei materiali).
NOTA: Il "terreno di coltura 3D" è liquido a temperatura ambiente. A 37 °C, la consistenza diventa più gelatinosa (in modo che le cellule rimangano unite), sebbene possa ancora essere pipettata (poiché contiene solo il 5% di matrice di membrana basale). - Calcolare il numero di celle necessarie per il test e il volume totale richiesto; ogni pozzetto deve contenere 2.000-8.000 cellule in 200 μL di mezzo.
- Preparare una sospensione cellulare con il numero desiderato di cellule (ad esempio, 4.000 cellule) in 200 μL del "terreno di coltura 3D" e mescolare delicatamente con la pipetta per garantire una distribuzione omogenea.
- Trasferire la sospensione in un serbatoio di pipettaggio. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 200 μL della sospensione della cella a ciascun pozzetto di una piastra ultra-bassa di attacco a 96 pozzetti (vedere la tabella dei materiali). Prima di ogni raccolta delle cellule, mescolare bene la sospensione.
- Centrifugare la piastra a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente per rafforzare il raggruppamento delle cellule, migliorando così l'aggregazione cellulare, e incubare la piastra a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2.
- Ogni 2-3 giorni, aggiorna il "mezzo di coltura 3D". Centrifugare la piastra a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente, rimuovere delicatamente ed eliminare il 50% del terreno (100 μL) e aggiungere 100 μL di "terreno di coltura 3D" fresco per sostituire la soluzione esistente. Ripetere il punto 1.11 e riposizionare la piastra nell'incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: La rimozione del mezzo deve essere eseguita quando la piastra è tenuta a 45°, e il mezzo deve essere raccolto solo dalla parte superiore per evitare di raccogliere le celle. Non utilizzare un sistema di aspirazione a vuoto. Il mezzo fresco deve essere aggiunto lentamente e delicatamente per non interrompere gli sferoidi, che avranno già iniziato a formarsi. - Ispezionare le cellule al microscopio ogni 1-2 giorni per monitorare la formazione di sferoidi. Misurare il diametro degli sferoidi formati utilizzando lo strumento "scala" nel software di imaging (vedere la tabella dei materiali).
NOTA: L'ispezione microscopica dovrebbe prima rivelare corpi irregolari da rotondi a ovali che assumono una forma sferoidale con il progredire del tempo11,12.- Quando il diametro sferoidale raggiunge 100-200 μm, eseguire gli esperimenti di efficacia del farmaco.
NOTA: Gli esperimenti di efficacia dei farmaci vengono eseguiti quando gli sferoidi raggiungono questo diametro poiché, in quel momento, la maggior parte delle cellule sta proliferando, il che è favorevole alla valutazione della risposta al trattamento. Gli sferoidi di diametro maggiore contengono un nucleo necrotico e uno strato quiescente11,12, risultando in una percentuale minore di cellule proliferanti che rispondono al trattamento.
- Quando il diametro sferoidale raggiunge 100-200 μm, eseguire gli esperimenti di efficacia del farmaco.
- Per la raccolta degli sferoidi, utilizzare una pipetta da 1.000 μL per raccogliere gli sferoidi da ciascun pozzetto e depositarli in un tubo conico da 15 ml.
NOTA: Gli sferoidi sono intrinsecamente fragili e richiedono una manipolazione delicata. Quando si trasferisce il mezzo con gli sferoidi nel tubo conico, tenere il tubo a 45° e pipettare lentamente sulla parete del tubo. Gli sferoidi sono visibili agli occhi. - Centrifugare il tubo conico a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, aspirare ed eliminare con cura il surnatante utilizzando una pipetta.
- Aggiungere 0,5 ml di terreno di coltura cellulare e risospendere il pellet bene ma delicatamente. Evita di fare bolle.
- Eseguire il conteggio degli sferoidi seguendo i passaggi seguenti.
- Usa una piastra a 96 pozzetti e disegna un segno più sul lato inferiore di un pozzo per dividere il pozzo in quadranti (per aiutare a tracciare il conteggio).
- Aggiungere 50 μL della sospensione al pozzetto e contare manualmente gli sferoidi al microscopio (usando una lente obiettivo 10x).
- Conta gli sferoidi in ogni quadrante, fai attenzione a non contare due volte e calcola il numero totale di sferoidi nel pozzo.
NOTA: Per la precisione del conteggio, contare almeno 50 sferoidi in un pozzo. Se ci sono meno di 50 sferoidi, mescolare delicatamente la sospensione per garantire una distribuzione omogenea e contare di nuovo utilizzando un volume maggiore della sospensione aggiunto a un nuovo pozzetto. In alternativa, se ci sono meno di 50 sferoidi in un pozzo, gli sferoidi possono essere centrifugati e risospesi delicatamente in un volume di <0,5 ml. Se ci sono più di 100 sferoidi, aggiungere terreno di coltura cellulare alla sospensione sferoide, mescolare delicatamente e ricontare. - Calcolare la concentrazione sferoidale (conta degli sferoidi/volume di conteggio [μL]), quindi calcolare il numero totale di sferoidi nella sospensione (concentrazione sferoide × volume totale).
2. Saggio di efficacia del farmaco (saggio MTT)
NOTA: Per i dettagli, vedere van Meerloo et al.13. Inoltre, per il test MTT, deve essere utilizzato solo il terreno di coltura cellulare e non il "terreno di coltura 3D" (l'aggiunta della matrice della membrana basale non è necessaria e potrebbe potenzialmente interferire con il test MTT).
- In una nuova provetta, preparare una sospensione sferoidale ad una concentrazione di 200 sferoidi per 200 μL di terreno di coltura cellulare (terreno di coltura RPMI-1640 integrato con 10% FBS, 1:100 penicillina-streptomicina, 1% aminoacidi non essenziali e 1% L-glutammina).
- Per ogni trattamento farmacologico, preparare una scorta di sferoidi in un tubo da 15 ml. Calcolare la quantità necessaria per ciascun farmaco in base al numero di pozzetti necessari per le ripetizioni: (5-8) × 200 μL. Aggiungere il farmaco al tubo alla concentrazione finale necessaria.
NOTA: Si prega di consultare la sezione dei risultati rappresentativi per quanto riguarda i farmaci utilizzati per il presente studio e il loro dosaggio. Inoltre, i dettagli commerciali dei farmaci sono elencati nella tabella dei materiali.
- Per ogni trattamento farmacologico, preparare una scorta di sferoidi in un tubo da 15 ml. Calcolare la quantità necessaria per ciascun farmaco in base al numero di pozzetti necessari per le ripetizioni: (5-8) × 200 μL. Aggiungere il farmaco al tubo alla concentrazione finale necessaria.
- Trasferire 200 μL della sospensione sferoidale nei pozzetti di una piastra ultra-bassa di attacco a 96 pozzetti e incubare la piastra a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2. Non utilizzare le righe e le colonne esterne della piastra a 96 pozzetti per il test, poiché questi pozzetti sono caratterizzati da una maggiore evaporazione, che potrebbe portare ad una maggiore variabilità tra gli esperimenti ripetuti; invece, aggiungi PBS a questi pozzi.
NOTA: È fondamentale che la coltura degli sferoidi sia omogenea prima che la coltura venga aliquotata nella piastra a 96 pozzetti. Inoltre, una condizione di controllo (cioè sferoidi non trattati) deve essere inclusa in ogni esperimento. - Dopo aver incubato gli sferoidi con il farmaco in studio per 24-72 ore, centrifugare la piastra a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e rimuovere delicatamente 170 μL del terreno di coltura cellulare, lasciando 30 μL (che include gli sferoidi) sul fondo del pozzetto.
NOTA: La rimozione dei 170 μL di terreno di coltura cellulare deve essere effettuata con attenzione, in modo da non rimuovere gli sferoidi. Tenere la piastra a 45° e posizionare una mano (indossando un guanto scuro per contrasto) sotto i pozzetti in modo che gli sferoidi siano visibili (punti bianchi). - Preparare la soluzione MTT (0,714 mg/ml in RPMI privo di fenolo, vedere la Tabella dei materiali).
- Aggiungere 70 μL di soluzione MTT a ciascun pozzetto fino a un volume finale di 100 μL per pozzetto (la concentrazione finale di MTT nel pozzetto sarà di 0,05 mg per 100 μL). Inoltre, preparare pozzetti "vuoti" con soluzione MTT senza celle.
NOTA: MTT è sensibile alla luce. Pertanto, la luce nella cappa deve essere spenta e il tubo contenente la soluzione MTT deve essere coperto con un foglio di alluminio. - Incubare la piastra a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 per 3-4 ore fino a quando non si osserva un cambiamento nel colore della soluzione nei pozzetti (il colore viola rappresenta le cellule vive).
- Quando si osserva un cambiamento, aggiungere 100 μL di soluzione di arresto (0,1N HCl in isopropanolo) a ciascun pozzetto e mescolare delicatamente il contenuto dei pozzetti senza creare bolle.
- Leggere l'assorbanza della piastra in un lettore Fluorometer-ELISA (vedere la Tabella dei Materiali) ad una lunghezza d'onda di 570 nm e una lunghezza d'onda di fondo di 630-690 nM.
NOTA: Se il lettore Fluorometer-ELISA disponibile non è in grado di leggere la piastra ultrabassa con attacco a 96 pozzetti, trasferire il contenuto di ciascun pozzetto su una corrispondente piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. - Calcola la vitalità cellulare seguendo i passaggi seguenti.
- Per ogni pozzetto, calcolare il "segnale specifico" ("segnale specifico" = il segnale a 570 nm - il segnale a 630-690 nm). Quindi, calcolare il valore medio dei pozzi "Blank" e sottrarre questo valore da ciascun pozzo.
- Calcolare la media dei "segnali specifici" nei pozzetti di controllo che contengono cellule che non sono state trattate con il farmaco in studio ("AV-SS-unt").
- Calcola la vitalità (percentuale) delle cellule in ciascun pozzetto rispetto ai pozzetti con cellule non trattate.
NOTA: Viabilità = (segnale specifico in ciascun pozzetto/"AV-SS-unt") × 100
3. Monitoraggio e analisi dei cambiamenti morfologici negli sferoidi
NOTA: Per quanto riguarda il test MTT, in questa valutazione deve essere utilizzato solo il terreno di coltura cellulare e non il "terreno di coltura 3D" (l'aggiunta della matrice della membrana basale non è necessaria e potrebbe potenzialmente interferire con l'analisi).
- Dopo aver contato gli sferoidi, diluire la sospensione in terreno di coltura cellulare (terreno di coltura RPMI-1640 integrato con 10% FBS, 1:100 penicillina-streptomicina, 1% aminoacidi non essenziali e 1% L-glutammina) a circa 1-2 sferoidi per 20 μL.
- Inserire 80 μL di terreno di coltura cellulare nei pozzetti di una piastra ultra-bassa di attacco a 96 pozzetti, quindi aggiungere 20 μL della sospensione sferoidale ai pozzetti.
NOTA: I pozzetti conterranno quindi 1-2 sferoidi in un volume di 100 μL. - Controllare attentamente i pozzetti al microscopio e contrassegnare i pozzetti che contengono uno sferoide, poiché verranno utilizzati per questa analisi.
- Preparare il farmaco in studio in una concentrazione che è il doppio della concentrazione di interesse. Aggiungere 100 μL della soluzione farmacologica ai pozzetti pertinenti (la concentrazione totale nel pozzetto sarà quindi 1x).
- Acquisire un'immagine di ciascun pozzetto al giorno 0 (prima di aggiungere il farmaco in studio) e utilizzare lo strumento "scala" nel software di imaging (vedere la tabella dei materiali) per determinare i diametri degli sferoidi.
- Incubare la piastra a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2, esaminare la morfologia e misurare il diametro degli sferoidi (utilizzando lo strumento "scala") ogni giorno per 3-7 giorni, a seconda di quando si osserva l'effetto del farmaco (ad esempio, disseminazione cellulare, baccelli invasivi, distruzione della struttura, ecc.).
- Alla fine dell'esperimento, tracciare i cambiamenti nei diametri sferoidi (relativi al giorno 0) nel tempo.
NOTA: Variazione (percentuale) = (diametro sferoide in un giorno specifico/diametro di quello sferoide al giorno 0) × 100
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Representative Results
Questo protocollo presenta procedure per generare una coltura omogenea di sferoidi da cellule tumorali primarie, valutando quantitativamente l'efficacia del farmaco sulla coltura sferoidale (saggio MTT) e determinando l'effetto dei farmaci in studio sulla morfologia sferoide. Vengono presentati i dati degli esperimenti rappresentativi in sferoidi generati da colture cellulari di cancro al colon e al seno. Esperimenti simili sono stati eseguiti utilizzando altri tipi di tumore, tra cui colangiocarcinoma, gastrico, polmonare e pancreatico (dati non mostrati). Tutti gli esperimenti qui presentati sono stati eseguiti in triplice copia.
La figura 2 mostra gli sferoidi generati dalla coltura primaria di cellule tumorali del colon. Come mostrato nella Figura 2, il numero di sferoidi generati dipende dal numero di cellule inizialmente seminate in ciascun pozzetto. La crescita degli sferoidi a oltre 100 μm di diametro ha richiesto 10-14 giorni. L'origine delle cellule tumorali (ad esempio, pazienti diversi e origini diverse) ha determinato il tasso di crescita. La semina dei pozzetti con più cellule non ha ridotto il tempo necessario per la generazione di sferoidi, ma piuttosto ha aumentato il numero di sferoidi formati. In particolare, dopo una coltura prolungata degli sferoidi del cancro del colon, hanno iniziato ad attaccarsi l'un l'altro e hanno formato gruppi di sferoidi in strutture simili all'uva (Figura 3), che hanno impedito una coltura omogenea e, quindi, hanno proibito l'uso degli sferoidi nei saggi MTT.
La Figura 4 presenta l'effetto di tre trattamenti (10 μM palbociclib, 10 μM sunitinib e la loro combinazione a 10 μM ciascuno) sulla vitalità degli sferoidi derivati da due tumori primari. In questo caso, è stato stabilito per primo un modello PDX e le cellule tumorali utilizzate per l'analisi sferoidale sono state derivate dal modello PDX9. Il primo modello PDX è stato stabilito utilizzando un campione di cancro al colon di un paziente maschio di 50 anni e il secondo utilizzando un campione di cancro al seno di una donna di 62 anni. Come dimostrato nella Figura 4A,B, dopo 3 giorni di trattamento, la combinazione di palbociclib più sunitinib ha portato ad una significativa riduzione della vitalità misurata dal test MTT. Come dimostrato nella Figura 4C,D, i cambiamenti morfologici che si verificano con il trattamento sono stati molto chiari. Il giorno 0, tutti gli sferoidi erano intatti. Al contrario, il giorno 3, gli sferoidi trattati con il controllo (DMSO) erano ancora intatti, mentre gli sferoidi trattati con la combinazione sono stati smontati e la loro morfologia era "aperta", con cellule che si staccavano dalla struttura solida, suggerendo la distruzione della struttura sferoide.
La figura 5 presenta il follow-up degli sferoidi nel tempo. Questi sferoidi, generati da cellule di cancro al seno derivate da una paziente di 44 anni, sono stati trattati con una delle due combinazioni (trastuzumab [10 μg / ml] più vinorelbina [1 μg / ml], o 5-fluorouracile [200 μM] più cisplatino [300 μM]). Come mostrato nella Figura 5A, la dimensione degli sferoidi trattati con 5-fluorouracile più cisplatino è stata ridotta entro il Giorno 3 e gli sferoidi sono stati completamente distrutti entro il Giorno 7. Al contrario, il trattamento con trastuzumab più vinorelbina ha avuto solo un effetto minore sulla morfologia degli sferoidi (ad esempio, un certo livello di una struttura "aperta"), ma l'effetto non è stato significativo. La figura 5B presenta la variazione media del diametro degli sferoidi rispetto al giorno 0 (cinque sferoidi sono stati seguiti in ciascun gruppo di trattamento).
Figura 1: Panoramica del protocollo per stabilire sferoidi 3D da campioni tumorali derivati da pazienti e valutare la loro sensibilità ai farmaci. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Formazione di sferoidi da una coltura primaria di cellule tumorali del colon nel tempo per il numero di cellule inizialmente seminate. Un numero diverso di cellule sono state seminate in "terreno di coltura 3D" in una piastra ultra-bassa a 96 pozzetti e osservate al microscopio (ingrandimento 4x). Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Sferoidi da cellule tumorali primarie del colon (con semina iniziale delle cellule di 2.000 per pozzetto) dopo 12 giorni di coltura. I due esempi (A,B) mostrano cluster creati dall'attaccamento di sferoidi tra loro (ingrandimento 10x). Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Gli effetti di palbociclib (10 μM), sunitinib (10 μM) e la loro combinazione (10 μM ciascuno) sugli sferoidi delle cellule tumorali primarie, incluso il cancro del colon e della mammella (PDX-derivato). Un test MTT è stato condotto su sferoidi derivati da (A) cellule di cancro al colon e (B) al seno. I segnali MTT sono stati normalizzati ai valori delle cellule trattate con DMSO. I valori rappresentano le medie da quattro a otto repliche. Le barre di errore rappresentano SEM. *p < 0,05 rispetto a un singolo agente (t-test). Gli effetti dei vari trattamenti sulla crescita cellulare sono stati valutati anche microscopicamente al Giorno 0 e dopo 3 giorni di trattamento degli sferoidi derivati da (C) colon e (D) cellule di cancro al seno (ingrandimento 10x). Barra di scala = 100 μm. La figura è adattata da Moskovits et al.9. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Gli effetti di trastuzumab (10 μg/mL) più vinorelbina (1 μg/mL) e 5-fluorouracile (200 μM) più cisplatino (300 μM) sugli sferoidi derivati dal cancro al seno nel tempo. (A) Ogni pozzo includeva uno sferoide ed è stato monitorato nel tempo al microscopio (ingrandimento 10x). Barra della scala = 100 μm. (B) La variazione del diametro degli sferoidi (rispetto al giorno 0) per la durata del trattamento. *p = 0,05 per 5-fluorouracile più cisplatino rispetto ai controlli (T-test). Ogni gruppo di trattamento comprendeva da quattro a sei pozzi, con uno sferoide in ciascun pozzetto. Viene presentata la variazione media. Le barre di errore rappresentano SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il presente protocollo descrive un metodo semplice per generare colture cellulari primarie 3D (sferoidi) derivate da campioni tumorali umani. Questi sferoidi possono essere utilizzati per varie analisi, tra cui la valutazione di potenziali candidati farmaci e combinazioni di farmaci, l'identificazione di potenziali biomarcatori o bersagli terapeutici e lo studio dei meccanismi di risposta e resistenza. Il protocollo utilizza cellule tumorali primarie derivate direttamente da campioni di pazienti o cellule tumorali da modelli PDX, che possono essere stabilite utilizzando campioni di pazienti. Quest'ultimo approccio consente di condurre esperimenti in vitro e in vivo con lo stesso tumore primario. La coerenza è stata precedentemente dimostrata nei risultati degli esperimenti di sensibilità ai farmaci tra modelli PDX e colture 3D derivate da questi modelli9, supportando così la rilevanza di questo approccio in vitro/in vivo .
I principali vantaggi dell'attuale protocollo includono la sua ampia applicabilità alla maggior parte dei tumori solidi e il suo rapporto costo-efficacia, che deriva dalla sua compatibilità con le capacità / attrezzature tipiche dei laboratori di ricerca sul cancro / biologia cellulare (cioè, non c'è bisogno di attrezzature specializzate o outsourcing). Inoltre, l'attuale protocollo genera una popolazione sferoide omogenea, che consente l'uso di saggi di vitalità quantitativa ad alto rendimento (ad esempio, MTT). Generare una popolazione sferoide omogenea è importante per ottenere risultati significativi, poiché gli studi hanno dimostrato che la dimensione dello sferoide influisce sulla risposta al trattamento. Gli sferoidi più grandi, a differenza degli sferoidi più piccoli, sono caratterizzati da un nucleo necrotico. Tuttavia, la maggior parte delle cellule sono nella fase di crescita lineare in sferoidi più piccoli. Inoltre, la dimensione dello sferoide influisce anche sulla rigidità della sua struttura tissutale, che potrebbe influire sulla diffusione di composti (come quelli utilizzati per i saggi di vitalità) nello sferoide14. La principale limitazione del protocollo attuale è che, anche con la sua ampia applicabilità, ci sono casi in cui l'approccio non riesce a generare sferoidi. È importante sottolineare che un tale fallimento non è specifico del tipo di tumore, ma piuttosto specifico del paziente. Sono necessari ulteriori studi per esplorare perché i campioni tumorali di alcuni pazienti non formano sferoidi utilizzando questo protocollo.
L'attuale protocollo si basa su due principi chiave: (1) avere una sospensione cellulare senza cluster cellulari (cioè una sospensione monocellulare) e (2) utilizzare una piastra di attacco ultra-bassa con un mezzo contenente una matrice di membrana basale al 5% (una matrice extracellulare solubilizzata). Il numero iniziale di cellule seminate influenza il numero di sferoidi che si formano ma non il tempo necessario per la formazione degli sferoidi, suggerendo che ogni sferoide è generato da una singola cellula tumorale. In particolare, si verifica il raggruppamento di sferoidi, in particolare dopo un'incubazione prolungata. Questo raggruppamento interrompe la coltura omogenea e vieta l'uso di MTT (a causa della difficoltà di erogare un numero uguale di sferoidi in ciascun pozzetto). Questo raggruppamento può essere evitato diluendo la coltura e trasferendo gli sferoidi in pozzi più grandi. Se non è possibile ottenere una coltura omogenea, i saggi MTT non possono essere utilizzati, sebbene la valutazione morfologica e la misurazione dei diametri sferoidi possano ancora essere eseguite. Va notato che la valutazione morfologica è più laboriosa poiché richiede l'assegnazione di uno sferoide per pozzetto e il monitoraggio di ogni sferoide al microscopio.
Determinare il numero appropriato di sferoidi per un test MTT è importante per la sua interpretazione. Pertanto, si raccomanda di generare prima una curva standard con un numero noto di sferoidi (ad esempio, 50, 100, 200 e 400 per pozzetto, in repliche) al fine di determinare il numero ottimale di sferoidi per il saggio MTT. Il centro dell'intervallo lineare del grafico deve essere utilizzato per l'analisi in modo che ci siano abbastanza sferoidi per rilevare un segnale ma non troppi (cioè, in modo che la fase di plateau del segnale non venga raggiunta). Inoltre, l'utilizzo della gamma media consente di mantenere il segnale all'interno dell'intervallo lineare nei casi di risposta al farmaco (cioè segnale ridotto), così come di non risposta (cioè la continua crescita dello sferoide e l'aumento del segnale). Infine, poiché il test MTT valuta l'attività metabolica cellulare, che potrebbe essere diversa tra tumori di pazienti diversi, dovrebbe essere generata una curva standard per ciascun campione di tumore primario.
In sintesi, questo protocollo per generare modelli di coltura tumorale 3D da cellule tumorali primarie e valutare la loro sensibilità ai farmaci utilizzando un saggio di vitalità cellulare (MTT) e l'esame morfologico al microscopio rappresenta uno strumento prezioso e biologicamente rilevante che integra gli attuali approcci 2D in vitro e gli approcci in vivo .
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Nessuno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
| Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
References
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