Etablering af 3-dimensionelle sfæroider fra patientafledte tumorprøver og evaluering af deres følsomhed over for lægemidler
Summary
Denne protokol beskriver generering af 3D-tumorkulturmodeller fra primære kræftceller og evaluering af deres følsomhed over for lægemidler ved hjælp af cellelevedygtighedsassays og mikroskopiske undersøgelser.
Abstract
På trods af bemærkelsesværdige fremskridt i forståelsen af tumorbiologi mislykkes langt de fleste onkologiske lægemiddelkandidater, der går ind i kliniske forsøg, ofte på grund af manglende klinisk effekt. Denne høje fejlrate belyser de nuværende prækliniske modellers manglende evne til at forudsige klinisk effekt, hovedsageligt på grund af deres utilstrækkelighed i at afspejle tumorheterogenitet og tumormikromiljøet. Disse begrænsninger kan løses med 3-dimensionelle (3D) kulturmodeller (sfæroider) etableret fra humane tumorprøver afledt af individuelle patienter. Disse 3D-kulturer repræsenterer biologi i den virkelige verden bedre end etablerede cellelinjer, der ikke afspejler tumorheterogenitet. Desuden er 3D-kulturer bedre end 2-dimensionelle (2D) kulturmodeller (monolagsstrukturer), da de replikerer elementer i tumormiljøet, såsom hypoxi, nekrose og celleadhæsion, og bevarer den naturlige celleform og vækst. I denne undersøgelse blev der udviklet en metode til fremstilling af primære kulturer af kræftceller fra individuelle patienter, der er 3D og vokser i flercellede sfæroider. Cellerne kan udledes direkte fra patienttumorer eller patientafledte xenotransplantater. Metoden er bredt anvendelig til solide tumorer (fx tyktarm, bryst og lunge) og er også omkostningseffektiv, da den kan udføres i sin helhed i et typisk kræftforsknings- / cellebiologilaboratorium uden at stole på specialudstyr. Heri præsenteres en protokol til generering af 3D-tumorkulturmodeller (multicellulære sfæroider) fra primære kræftceller og evaluering af deres følsomhed over for lægemidler ved hjælp af to komplementære tilgange: et cellelevedygtighedsassay (MTT) og mikroskopiske undersøgelser. Disse multicellulære sfæroider kan bruges til at vurdere potentielle lægemiddelkandidater, identificere potentielle biomarkører eller terapeutiske mål og undersøge mekanismerne for respons og resistens.
Introduction
In vitro- og in vivo-undersøgelser repræsenterer komplementære tilgange til udvikling af kræftbehandlinger. In vitro-modeller giver mulighed for kontrol af de fleste eksperimentelle variabler og letter kvantitative analyser. De fungerer ofte som billige screeningsplatforme og kan også bruges til mekanistiske undersøgelser1. Imidlertid er deres biologiske relevans i sagens natur begrænset, da sådanne modeller kun delvist afspejler tumormikromiljøet1. I modsætning hertil fanger in vivo-modeller, såsom patientafledte xenotransplantater (PDX), kompleksiteten af tumormikromiljøet og er mere egnede til translationelle undersøgelser og individualisering af behandling hos patienter (dvs. undersøgelse af respons på lægemidler i en model afledt af en individuel patient)1. In vivo-modeller er imidlertid ikke befordrende for high-throughput-tilgange til lægemiddelscreening, da de eksperimentelle parametre ikke kan kontrolleres så tæt som in vitro-modeller, og fordi deres udvikling er tidskrævende, arbejdskrævende og dyr 1,2.
In vitro-modeller har været tilgængelige i over 100 år, og cellelinjer har været tilgængelige i over 70 år3. I løbet af de sidste årtier er kompleksiteten af de tilgængelige in vitro-modeller af solide tumorer imidlertid steget dramatisk. Denne kompleksitet spænder fra 2-dimensionelle (2D) kulturmodeller (monolagsstrukturer), der enten er tumorafledte etablerede cellelinjer eller primære cellelinjer til de nyere tilgange, der involverer 3-dimensionelle (3D) modeller1. Inden for 2D-modellerne er en nøgleforskel mellem de etablerede og primære cellelinjer4. Etablerede cellelinjer er udødeliggjort; Derfor kan den samme cellelinje bruges globalt over mange år, hvilket fra et historisk perspektiv letter samarbejde, akkumulering af data og udvikling af mange behandlingsstrategier. Imidlertid akkumuleres genetiske aberrationer i disse cellelinjer med hver passage, hvilket kompromitterer deres biologiske relevans. Desuden afspejler det begrænsede antal tilgængelige cellelinjer ikke heterogeniteten af tumorer hos patienter 4,5. Primære kræftcellelinjer stammer direkte fra resekterede tumorprøver opnået via biopsier, pleurale effusioner eller resektioner. Derfor er primære kræftcellelinjer mere biologisk relevante, da de bevarer elementer i tumormikromiljøet og tumoregenskaber, såsom intercellulær adfærd (fx krydstale mellem sunde og kræftceller) og de stammelignende fænotyper af kræftceller. Imidlertid er den replikative kapacitet af primære cellelinjer begrænset, hvilket fører til en smal dyrkningstid og begrænser antallet af tumorceller, der kan bruges til analyser 4,5.
Modeller, der bruger 3D-kulturer, er mere biologisk relevante end 2D-kulturmodeller, da in vivo-betingelserne bevares. Således bevarer 3D-kulturmodeller den naturlige celleform og vækst og replikerer elementer i tumormiljøet, såsom hypoxi, nekrose og celleadhæsion. De mest almindeligt anvendte 3D-modeller inden for kræftforskning omfatter multicellulære sfæroider, stilladsbaserede strukturer og matrixindlejrede kulturer 4,6,7.
Denne protokol genererer 3D-tumorkulturmodeller (multicellulære sfæroider) fra primære kræftceller og evaluerer deres følsomhed over for lægemidler ved hjælp af to komplementære tilgange: et cellelevedygtighedsassay (MTT) og mikroskopiske undersøgelser. De repræsentative resultater, der præsenteres heri, er fra bryst- og tyktarmskræft; Denne protokol er imidlertid bredt anvendelig til andre solide tumortyper (f.eks. Cholangiocarcinom, mave-, lunge- og bugspytkirtelkræft) og er også omkostningseffektiv, da den kan udføres i sin helhed i et typisk kræftforsknings- / cellebiologilaboratorium uden at stole på specialudstyr. De multicellulære sfæroider, der genereres ved hjælp af denne tilgang, kan bruges til at vurdere potentielle lægemiddelkandidater, identificere potentielle biomarkører eller terapeutiske mål og undersøge mekanismerne for respons og resistens.
Denne protokol er opdelt i tre sektioner: (1) generering, indsamling og tælling af sfæroiderne som forberedelse til deres anvendelse som model til test af lægemiddeleffektivitet; (2) MTT-assay til vurdering af lægemiddeleffektivitet på sfæroiderne; og (3) den mikroskopiske evaluering af morfologiske ændringer efter behandling af sfæroiderne med lægemidler som en anden tilgang til evaluering af lægemiddeleffektivitet (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver en simpel metode til generering af 3D primære cellekulturer (sfæroider) afledt af humane tumorprøver. Disse sfæroider kan bruges til forskellige analyser, herunder evaluering af potentielle lægemiddelkandidater og lægemiddelkombinationer, identifikation af potentielle biomarkører eller terapeutiske mål og undersøgelse af mekanismerne for respons og resistens. Protokollen bruger enten primære tumorceller afledt direkte fra patientprøver eller tumorceller fra PDX-modeller, som kan etable…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen.
Materials
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
| Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann – La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
Riferimenti
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
- Richter, M., et al. From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).
- Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy. Revista de Investigación Clínica. 71 (6), 369-380 (2019).
- Choi, J. R., et al. In vitro human cancer models for biomedical applications. Cancers. 14 (9), 2284 (2022).
- Eglen, R. M., Randle, D. H. Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).
- Kodack, D. P., et al. Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care. Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).
- Moskovits, N., et al. Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types. Cancer Letters. 536, 215665 (2022).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).
- Brajša, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jelić, D. Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery. Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).
- Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).
- van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: The MTT assay. Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).
- Walzl, A., et al. The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).
