Gebruik van time-lapse microscopie en stadiumspecifieke nucleaire uitputting van eiwitten om meiose in S. cerevisiae te bestuderen
Summary
Time-lapse microscopie is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van meiose in ontluikende gist. Dit protocol beschrijft een methode die celcyclussynchronisatie, time-lapse-microscopie en voorwaardelijke uitputting van een doeleiwit combineert om aan te tonen hoe de functie van een specifiek eiwit tijdens meiotische chromosoomsegregatie kan worden bestudeerd.
Abstract
Time-lapse fluorescentiemicroscopie heeft een revolutie teweeggebracht in het begrip van meiotische celcyclusgebeurtenissen door temporele en ruimtelijke gegevens te verstrekken die vaak niet worden gezien door het afbeelden van vaste cellen. Ontluikende gist is een belangrijk modelorganisme gebleken om meiotische chromosoomsegregatie te bestuderen, omdat veel meiotische genen sterk geconserveerd zijn. Time-lapse microscopie van meiose in ontluikende gist maakt de monitoring van verschillende meiotische mutanten mogelijk om aan te tonen hoe de mutatie meiotische processen verstoort. Veel eiwitten functioneren echter op meerdere punten bij meiose. Het gebruik van functieverlies of meiotische nulmutanten kan daarom een vroeg proces verstoren, het latere proces blokkeren of verstoren en het moeilijk maken om de fenotypen te bepalen die bij elke individuele rol horen. Om deze uitdaging te omzeilen, beschrijft dit protocol hoe de eiwitten voorwaardelijk uit de kern kunnen worden uitgeput in specifieke stadia van meiose, terwijl meiotische gebeurtenissen worden gevolgd met behulp van time-lapse-microscopie. Specifiek beschrijft dit protocol hoe de cellen worden gesynchroniseerd in profase I, hoe de anker weg techniek wordt gebruikt om eiwitten uit de kern uit te putten in specifieke meiotische stadia, en hoe time-lapse beeldvorming wordt gebruikt om meiotische chromosoomsegregatie te monitoren. Als voorbeeld van het nut van de techniek werd het kinetochore-eiwit Ctf19 op verschillende tijdstippen tijdens meiose uit de kern uitgeput en werd het aantal chromatinemassa’s geanalyseerd aan het einde van meiose II. Over het algemeen kan dit protocol worden aangepast om verschillende nucleaire eiwitten uit de kern uit te putten terwijl de meiotische delingen worden bewaakt.
Introduction
Time-lapse fluorescentiemicroscopie is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van de dynamiek van meiotische chromosoomsegregatie in ontluikende gist 1,2. Ontluikende gistcellen kunnen worden geïnduceerd om meiose te ondergaan door uithongering van belangrijke voedingsstoffen3. Tijdens meiose ondergaan cellen één ronde van chromosoomsegregatie gevolgd door twee delingen om vier meiotische producten te creëren die in sporen zijn verpakt (figuur 1). Individuele cellen kunnen worden gevisualiseerd in elk stadium van meiose, wat ruimtelijke en temporele gegevens genereert die gemakkelijk kunnen worden gemist door beeldvorming met vaste cellen. Dit protocol laat zien hoe het combineren van time-lapse fluorescentiemicroscopie met twee eerder vastgestelde methoden, het induceerbare NDT80-systeem (NDT80-in) en de ankerwegtechniek, kan worden gebruikt om de functie van specifieke eiwitten in verschillende meiotische stadia te bestuderen.
Het NDT80-in systeem is een krachtig hulpmiddel voor meiotische celcyclussynchronisatie dat vertrouwt op de induceerbare expressie van de transcriptiefactor van de middelste meiose NDT80 4,5. NDT80-expressie is vereist voor profase I-uitgang 6,7. Met het NDT80-in-systeem staat NDT80 onder controle van de GAL1-10-promotor in cellen die de Gal4-transcriptiefactor tot expressie brengen die is gefuseerd tot een oestrogeenreceptor (Gal4-ER)4,5. Omdat Gal4-ER alleen de kern binnenkomt wanneer het gebonden is aan β-oestradiol, arresteren NDT80-in-cellen in profase I bij afwezigheid van β-oestradiol, wat de synchronisatie van cellen in profase I mogelijk maakt (figuur 1). β-oestradioltoevoeging bevordert de translocatie van de Gal4-ER transcriptiefactor in de kern, waar het GAL1-10 bindt om de expressie van NDT80 aan te drijven, wat leidt tot synchrone toegang tot de meiotische delingen. Hoewel time-lapse microscopie zonder synchronisatie kan worden uitgevoerd, is het voordeel van het gebruik van synchronisatie de mogelijkheid om een remmer of een medicijn toe te voegen terwijl cellen zich in een specifiek stadium van meiose bevinden.
De anker weg techniek is een induceerbaar systeem waarbij een eiwit uit de kern kan worden uitgeput met de toevoeging van rapamycine8. Deze techniek is ideaal voor het bestuderen van nucleaire eiwitten tijdens celdeling in ontluikende gist omdat gistcellen gesloten mitose en meiose ondergaan, waarbij de nucleaire envelop niet afbreekt. Bovendien is deze techniek zeer nuttig voor eiwitten die meerdere functies hebben tijdens meiose. In tegenstelling tot deleties, mutante allelen of meiotische nul-allelen, brengt het verwijderen van een doeleiwit uit de kern in een specifiek stadium de doeleiwitactiviteit in eerdere stadia niet in gevaar, waardoor een nauwkeuriger interpretatie van de resultaten mogelijk is. Het ankersysteem maakt gebruik van het sluiten van ribosomale subeenheden tussen de kern en het cytoplasma die optreedt bij ribosomale rijping8. Om het doeleiwit uit de kern uit te putten, wordt het doeleiwit gelabeld met het FKBP12-rapamycine-bindingsdomein (FRB) in een stam waarin de ribosomale subeenheid Rpl13A is gelabeld met FKBP12. Zonder rapamycine werken FRB en FKBP12 niet op elkaar in en blijft het FRB-gelabelde eiwit in de kern. Bij toevoeging aan rapamycine vormt de rapamycine een stabiel complex met FKBP12 en FRB, en het complex wordt uit de kern gehaald vanwege de interactie met Rpl13A (figuur 1). Om celdood bij toevoeging van rapamycine te voorkomen, herbergen cellen de tor1-1-mutatie van het TOR1-gen . Bovendien bevatten deze cellen fpr1Δ, een nulallel van het S. cerevisiae FKBP12-eiwit, dat voorkomt dat endogene Fpr1 Rpl13A-FKBP12 voor FRB- en rapamycinebinding uitconcurreert. De ankerachtergrondmutaties, tor1-1 en fpr1Δ, hebben geen invloed op meiotische timings of chromosoomsegregatie2.
Om het nut van deze techniek aan te tonen, werd het kinetochore-eiwit Ctf19 op verschillende tijdstippen tijdens meiose uitgeput. Ctf19 is een component van het kinetochore dat overbodig is bij mitose, maar vereist is voor een goede chromosoomsegregatie bij meiose 9,10,11,12,13. Bij meiose wordt het kinetochore afgeworpen in profase I en ctf19 is belangrijk voor kinetochore re-assembly 9,14. Voor dit protocol werden cellen met het NDT80-in-systeem gesynchroniseerd en werd de ankerwegtechniek gebruikt om het doeleiwit Ctf19 uit de kern uit te putten voor en na de afgifte uit profase I en na meiose I-chromosoomsegregatie (figuur 1). Dit protocol kan worden aangepast om andere eiwitten van belang in elk stadium van meiose en mitose uit te putten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol combineert het NDT80-in-systeem om cellen te synchroniseren, de ankerwegtechniek om eiwitten uit de kern uit te putten en fluorescentie time-lapse-microscopie om ontluikende gistcellen tijdens meiose in beeld te brengen. Het NDT80-in systeem is een methode voor meiotische celcyclussynchronisatie die gebruik maakt van een profase I arrest en release 4,8. Hoewel individuele cellen enigszins zullen variëren in de hoeveelheid tijd die …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken het Light Microscopy Imaging Center aan de Indiana University. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health (GM105755).
Materials
| β-estradiol | Millipore Sigma | E8875 | Make 1mM stocks in 95% EtOH |
| 0.22 uM Threaded Bottle-top Filter | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
| 100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Dilute 1:10 to use as solvent for ConA |
| 24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 | VWR North American | 48393241 | |
| 25 mm x 75 mm microscope slides | VWR North American | 48300-026 | |
| Adenine hemisulfate salt | Millipore Sigma | A9126 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Bacto Agar | BD | 214030 | |
| Concanavialin A | Mllipore Sigma | C2010 | Make as 1mg/mL in 1X PBS |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | Used in Section 4.3 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD | 291920 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
| Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| Fiji | NIH | Download from https://fiji.sc/ | |
| GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| L-Tryptophan | Millipore Sigma | T0254 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | To secure coverslip in slide holder |
| NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Used in Section 4.4 |
| Plastic pipette tip holder | Dot Scientific | LTS1000-HR | Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. |
| Pottassium Acetate | Fisher Scientific | BP264 | |
| Rapamycin | Fisher Scientific | BP29631 | Make 1mg/mL stocks in DMSO |
| Silicone Sealant | Aqueon | 100165001 | Also known as aquarium glue. |
| SoftWorx7.0.0 Imaging Software | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| Synthetic Complete Mixture (Kaiser) | Formedium | DSCK2500 | |
| Type N immersion oil | Nikon | MXA22166 |
Riferimenti
- Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).
- Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136 (2020).
- van Werven, F. J., Amon, A. Regulation of entry into gametogenesis. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).
- Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
- Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).
- Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).
- Chu, S., Herskowitz, I. Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80. Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Borek, W. E., et al. The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly. Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).
- Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).
- Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore. Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).
- Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).
- Fernius, J., Marston, A. L. Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3. PLoS Genetics. 5 (9), 1000629 (2009).
- Meyer, R. E., et al. Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).
- Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).
- Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast. Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).
- Ben-Ari, G., et al. Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast. PLoS Genetics. 2 (11), 195 (2006).
- Primig, M., et al. The core meiotic transcriptome in budding yeasts. Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).
- Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae. Genetica. 124 (2), 237-249 (1990).
- Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
- Byers, B., Goetsch, L. Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature. Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).
- Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetica. 189 (3), 737-765 (2011).
- Robinett, C., et al. C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).
- Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion. Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).
- Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis. Cell. 72 (3), 365-378 (1993).
- Scherthan, H., et al. Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).
