S. cerevisiae'de Mayozu İncelemek için Hızlandırılmış Mikroskopi ve Proteinlerin Aşamaya Özgü Nükleer Tükenmesinin Kullanılması
Summary
Hızlandırılmış mikroskopi, tomurcuklanan mayadaki mayozu incelemek için değerli bir araçtır. Bu protokol, mayotik kromozom ayrışması sırasında belirli bir proteinin işlevinin nasıl çalışılacağını göstermek için hücre döngüsü senkronizasyonunu, hızlandırılmış mikroskopiyi ve bir hedef proteinin koşullu tükenmesini birleştiren bir yöntemi açıklar.
Abstract
Hızlandırılmış floresan mikroskopi, genellikle sabit hücreleri görüntüleyerek görülmeyen zamansal ve mekansal veriler sağlayarak mayotik hücre döngüsü olaylarının anlaşılmasında devrim yaratmıştır. Tomurcuklanan maya, mayotik kromozom ayrışmasını incelemek için önemli bir model organizma olduğunu kanıtlamıştır, çünkü birçok mayotik gen oldukça korunmuştur. Tomurcuklanan mayadaki mayozun hızlandırılmış mikroskopisi, mutasyonun mayotik süreçleri nasıl bozduğunu göstermek için farklı mayotik mutantların izlenmesine izin verir. Bununla birlikte, birçok protein mayozda birden fazla noktada işlev görür. Bu nedenle, fonksiyon kaybı veya mayotik null mutantların kullanımı, erken bir süreci bozabilir, daha sonraki süreci bloke edebilir veya rahatsız edebilir ve her bir bireysel rolle ilişkili fenotipleri belirlemeyi zorlaştırabilir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, bu protokol, proteinlerin mayozun belirli aşamalarında çekirdekten şartlı olarak nasıl tükenebileceğini açıklarken, hızlandırılmış mikroskopi kullanarak mayotik olayları izler. Spesifik olarak, bu protokol, hücrelerin faz I’de nasıl senkronize edildiğini, çapa atma tekniğinin belirli mayotik aşamalarda çekirdekten proteinleri tüketmek için nasıl kullanıldığını ve mayotik kromozom ayrışmasını izlemek için hızlandırılmış görüntülemenin nasıl kullanıldığını açıklar. Tekniğin yararlılığına bir örnek olarak, kinetochore proteini Ctf19, mayozis sırasında farklı zaman noktalarında çekirdekten tükenmiş ve mayoz II’nin sonunda kromatin kütlelerinin sayısı analiz edilmiştir. Genel olarak, bu protokol mayotik bölünmeleri izlerken çekirdekten farklı nükleer proteinleri tüketmek için uyarlanabilir.
Introduction
Hızlandırılmış floresan mikroskobu, tomurcuklanan maya 1,2’deki mayotik kromozom ayrışmasının dinamiklerini incelemek için değerli bir araçtır. Tomurcuklanan maya hücreleri, temel besin maddelerinin açlığı yoluyla mayoza uğramaya teşvik edilebilir3. Mayoz sırasında, hücreler bir tur kromozom ayrışmasına ve ardından sporlara paketlenmiş dört mayotik ürün oluşturmak için iki bölüme ayrılır (Şekil 1). Bireysel hücreler, mayozun her aşamasında görselleştirilebilir, bu da sabit hücreli görüntüleme ile kolayca kaçırılabilecek uzamsal ve zamansal veriler üretir. Bu protokol, hızlandırılmış floresan mikroskopisinin daha önce kurulmuş iki yöntemle, indüklenebilir NDT80 sistemi (NDT80-in) ve çapa uzaklaştırma tekniği ile birleştirilmesinin farklı mayotik aşamalardaki spesifik proteinlerin işlevini incelemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
NDT80-in sistemi, orta mayoz transkripsiyon faktörü NDT80 4,5’in indüklenebilir ekspresyonuna dayanan mayotik hücre döngüsü senkronizasyonu için güçlü bir araçtır. NDT80 ifadesi faz I çıkış 6,7 için gereklidir. NDT80-in sistemi ile NDT80, bir östrojen reseptörüne (Gal4-ER) kaynaşmış Gal4 transkripsiyon faktörünü eksprese eden hücrelerde GAL1-10 promotörünün kontrolü altındadır4,5. Gal4-ER çekirdeğe sadece β-östradiol’e bağlandığında girdiğinden, NDT80-in hücreleri β-östradiol yokluğunda faz I’de durur ve bu da faz I’deki hücrelerin senkronizasyonuna izin verir (Şekil 1). β-östradiol ilavesi, Gal4-ER transkripsiyon faktörünün çekirdeğe translokasyonunu teşvik eder, burada NDT80’in ekspresyonunu sürmek için GAL1-10’u bağlar ve mayotik bölünmelere senkron girişe yol açar. Hızlandırılmış mikroskopi senkronizasyon olmadan yapılabilmesine rağmen, senkronizasyon kullanmanın avantajı, hücreler mayozun belirli bir aşamasındayken bir inhibitör veya ilaç ekleme yeteneğidir.
Çapa atma tekniği, rapamisin8 ilavesiyle bir proteinin çekirdekten tükenebileceği indüklenebilir bir sistemdir. Bu teknik, tomurcuklanan mayadaki hücre bölünmesi sırasında nükleer proteinleri incelemek için idealdir, çünkü maya hücreleri, nükleer zarfın parçalanmadığı kapalı mitoz ve mayoza uğrar. Ayrıca, bu teknik mayozda birden fazla işlevi olan proteinler için çok yararlıdır. Delesyonlardan, mutant alellerden veya mayotik null alellerin aksine, bir hedef proteinin belirli bir aşamada çekirdekten uzaklaştırılması, daha erken aşamalarda hedef protein aktivitesinden ödün vermez ve sonuçların daha doğru bir şekilde yorumlanmasına izin verir. Ankraj uzaklaştırma sistemi, ribozomal olgunlaşma üzerine ortaya çıkan çekirdek ve sitoplazma arasındaki ribozomal alt birimlerin titremesini kullanır8. Hedef proteini çekirdekten tüketmek için, hedef protein, ribozomal alt birim Rpl13A’nın FKBP12 ile etiketlendiği bir suşta FKBP12-rapamisin bağlayıcı etki alanı (FRB) ile etiketlenir. Rapamisin olmadan, FRB ve FKBP12 etkileşime girmez ve FRB etiketli protein çekirdekte kalır. Rapamisin ilavesi üzerine, rapamisin FKBP12 ve FRB ile kararlı bir kompleks oluşturur ve kompleks Rpl13A ile etkileşim nedeniyle çekirdekten dışarı atılır (Şekil 1). Rapatisin ilavesi üzerine hücre ölümünü önlemek için, hücreler TOR1 geninin tor1-1 mutasyonunu barındırır. Ek olarak, bu hücreler, endojen Fpr1’in FRB ve rapamisin bağlanması için Rpl13A-FKBP12’nin rekabet etmesini önleyen S. cerevisiae FKBP12 proteininin boş bir aleli olan fpr1Δ’yu içerir. Arka plan mutasyonlarını (tor1-1 ve fpr1Δ) uzaklaştırmak, mayotik zamanlamaları veya kromozom ayrışması2’yi etkilemez.
Bu tekniğin yararlılığını göstermek için, kinetochore proteini Ctf19, mayozda farklı zaman noktalarında tükenmiştir. Ctf19, mitozda dağıtılabilen ancak mayoz9,10,11,12,13’te uygun kromozom ayrışması için gerekli olan kinetochore’un bir bileşenidir. Mayozda, kinetochore faz I’de dökülür ve Ctf19, kinetochore yeniden montajı 9,14 için önemlidir. Bu protokol için, NDT80-in sistemine sahip hücreler senkronize edildi ve çapa uzaklaştırma tekniği, faz I’den salınmadan önce ve sonra ve mayoz I kromozom ayrışmasından sonra çekirdekten hedef protein Ctf19’u tüketmek için kullanıldı (Şekil 1). Bu protokol, mayoz ve mitozun herhangi bir aşamasında ilgilenilen diğer proteinleri tüketmek için uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, hücreleri senkronize etmek için NDT80-in sistemini, çekirdekten proteinleri tüketmek için çapa uzaklaştırma tekniğini ve mayoz sırasında tomurcuklanan maya hücrelerini görüntülemek için floresan hızlandırılmış mikroskopiyi birleştirir. NDT80-in sistemi, bir faz I tutuklaması ve 4,8’i serbest bırakan mayotik hücre döngüsü senkronizasyonu için bir yöntemdir. Her ne kadar bireysel hücreler sonraki mayotik…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Indiana Üniversitesi Işık Mikroskobu Görüntüleme Merkezi’ne teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden (GM105755) bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| β-estradiol | Millipore Sigma | E8875 | Make 1mM stocks in 95% EtOH |
| 0.22 uM Threaded Bottle-top Filter | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
| 100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Dilute 1:10 to use as solvent for ConA |
| 24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 | VWR North American | 48393241 | |
| 25 mm x 75 mm microscope slides | VWR North American | 48300-026 | |
| Adenine hemisulfate salt | Millipore Sigma | A9126 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Bacto Agar | BD | 214030 | |
| Concanavialin A | Mllipore Sigma | C2010 | Make as 1mg/mL in 1X PBS |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | Used in Section 4.3 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD | 291920 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
| Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| Fiji | NIH | Download from https://fiji.sc/ | |
| GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| L-Tryptophan | Millipore Sigma | T0254 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | To secure coverslip in slide holder |
| NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Used in Section 4.4 |
| Plastic pipette tip holder | Dot Scientific | LTS1000-HR | Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. |
| Pottassium Acetate | Fisher Scientific | BP264 | |
| Rapamycin | Fisher Scientific | BP29631 | Make 1mg/mL stocks in DMSO |
| Silicone Sealant | Aqueon | 100165001 | Also known as aquarium glue. |
| SoftWorx7.0.0 Imaging Software | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| Synthetic Complete Mixture (Kaiser) | Formedium | DSCK2500 | |
| Type N immersion oil | Nikon | MXA22166 |
Riferimenti
- Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).
- Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136 (2020).
- van Werven, F. J., Amon, A. Regulation of entry into gametogenesis. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).
- Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
- Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).
- Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).
- Chu, S., Herskowitz, I. Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80. Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Borek, W. E., et al. The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly. Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).
- Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).
- Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore. Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).
- Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).
- Fernius, J., Marston, A. L. Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3. PLoS Genetics. 5 (9), 1000629 (2009).
- Meyer, R. E., et al. Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).
- Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).
- Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast. Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).
- Ben-Ari, G., et al. Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast. PLoS Genetics. 2 (11), 195 (2006).
- Primig, M., et al. The core meiotic transcriptome in budding yeasts. Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).
- Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae. Genetica. 124 (2), 237-249 (1990).
- Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
- Byers, B., Goetsch, L. Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature. Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).
- Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetica. 189 (3), 737-765 (2011).
- Robinett, C., et al. C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).
- Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion. Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).
- Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis. Cell. 72 (3), 365-378 (1993).
- Scherthan, H., et al. Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).
