Einsatz von Zeitraffer-Mikroskopie und stadienspezifischer Kerndepletion von Proteinen zur Untersuchung der Meiose bei S. cerevisiae
Summary
Die Zeitraffer-Mikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Meiose in knospender Hefe. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die Zellzyklus-Synchronisation, Zeitraffer-Mikroskopie und bedingte Depletion eines Zielproteins kombiniert, um zu zeigen, wie die Funktion eines bestimmten Proteins während der meiotischen Chromosomentrennung untersucht werden kann.
Abstract
Die Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie hat das Verständnis von meiotischen Zellzyklusereignissen revolutioniert, indem sie zeitliche und räumliche Daten liefert, die von der Bildgebung fixierter Zellen oft nicht gesehen werden. Knospende Hefe hat sich als wichtiger Modellorganismus für die Untersuchung der meiotischen Chromosomentrennung erwiesen, da viele meiotische Gene hoch konserviert sind. Die Zeitraffer-Mikroskopie der Meiose in knospender Hefe ermöglicht die Überwachung verschiedener meiotischer Mutanten, um zu zeigen, wie die Mutation meiotische Prozesse stört. Viele Proteine funktionieren jedoch an mehreren Stellen in der Meiose. Die Verwendung von Funktionsverlust- oder meiotischen Nullmutanten kann daher einen frühen Prozess stören, den späteren Prozess blockieren oder stören und es schwierig machen, die Phänotypen zu bestimmen, die mit jeder einzelnen Rolle verbunden sind. Um diese Herausforderung zu umgehen, beschreibt dieses Protokoll, wie die Proteine in bestimmten Stadien der Meiose bedingt aus dem Zellkern abgereichert werden können, während meiotische Ereignisse mit Zeitraffermikroskopie überwacht werden. Insbesondere beschreibt dieses Protokoll, wie die Zellen in Prophase I synchronisiert werden, wie die Ankerweg-Technik verwendet wird, um Proteine aus dem Zellkern in bestimmten meiotischen Stadien zu entleeren, und wie Zeitraffer-Bildgebung verwendet wird, um die meiotische Chromosomentrennung zu überwachen. Als Beispiel für die Nützlichkeit der Technik wurde das Kinetochor-Protein Ctf19 zu verschiedenen Zeitpunkten während der Meiose aus dem Zellkern abgereichert, und die Anzahl der Chromatinmassen wurde am Ende der Meiose II analysiert. Insgesamt kann dieses Protokoll angepasst werden, um verschiedene Kernproteine aus dem Zellkern abzubauen und gleichzeitig die meiotischen Teilungen zu überwachen.
Introduction
Die Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Dynamik der meiotischen Chromosomentrennung in knospender Hefe 1,2. Knospende Hefezellen können durch Aushungern wichtiger Nährstoffe zu Meiose gebracht werden3. Während der Meiose durchlaufen die Zellen eine Chromosomentrennung, gefolgt von zwei Teilungen, um vier meiotische Produkte zu erzeugen, die in Sporen verpackt sind (Abbildung 1). Einzelne Zellen können in jedem Stadium der Meiose visualisiert werden, wodurch räumliche und zeitliche Daten generiert werden, die von der Fixed-Cell-Bildgebung leicht übersehen werden können. Dieses Protokoll zeigt, wie die Kombination der Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie mit zwei zuvor etablierten Methoden, dem induzierbaren NDT80-System (NDT80-in) und der Ankerweg-Technik, verwendet werden kann, um die Funktion bestimmter Proteine in verschiedenen meiotischen Stadien zu untersuchen.
Das NDT80-in-System ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Synchronisation des meiotischen Zellzyklus, das auf der induzierbaren Expression des mittleren Meiose-Transkriptionsfaktors NDT80 4,5 beruht. Die NDT80-Expression ist für den Ausgang der ProphaseI 6,7 erforderlich. Mit dem NDT80-in-System steht NDT80 unter der Kontrolle des GAL1-10-Promotors in Zellen, die den Gal4-Transkriptionsfaktor exprimieren, der mit einem Östrogenrezeptor (Gal4-ER)4,5 fusioniert ist. Da Gal4-ER nur dann in den Zellkern gelangt, wenn es an β-Östradiol gebunden ist, werden NDT80-in-Zellen in Prophase I in Abwesenheit von β-Östradiol blockiert, was die Synchronisation von Zellen in Prophase I ermöglicht (Abbildung 1). β-Östradiol-Addition fördert die Translokation des Gal4-ER-Transkriptionsfaktors in den Zellkern, wo er GAL1-10 bindet, um die Expression von NDT80 zu steuern, was zu einem synchronen Eintritt in die meiotischen Divisionen führt. Obwohl die Zeitraffermikroskopie ohne Synchronisation durchgeführt werden kann, besteht der Vorteil der Synchronisation darin, dass ein Inhibitor oder ein Medikament hinzugefügt werden kann, während sich die Zellen in einem bestimmten Stadium der Meiose befinden.
Die Anker-weg-Technik ist ein induzierbares System, durch das ein Protein aus dem Zellkern unter Zugabe von Rapamycin8 abgereichert werden kann. Diese Technik ist ideal für die Untersuchung von Kernproteinen während der Zellteilung in knospender Hefe, da Hefezellen eine geschlossene Mitose und Meiose durchlaufen, bei der die Kernhülle nicht zusammenbricht. Darüber hinaus ist diese Technik sehr nützlich für Proteine, die während der gesamten Meiose mehrere Funktionen haben. Anders als bei Deletionen, mutierten Allelen oder meiotischen Null-Allelen beeinträchtigt die Entfernung eines Zielproteins aus dem Zellkern in einem bestimmten Stadium nicht die Aktivität des Zielproteins in früheren Stadien, was eine genauere Interpretation der Ergebnisse ermöglicht. Das Ankerwegsystem nutzt das Pendeln von ribosomalen Untereinheiten zwischen dem Kern und dem Zytoplasma, das bei der ribosomalen Reifungauftritt 8. Um das Zielprotein aus dem Zellkern zu entfernen, wird das Zielprotein mit der FKBP12-Rapamycin-bindenden Domäne (FRB) in einem Stamm markiert, in dem die ribosomale Untereinheit Rpl13A mit FKBP12 markiert ist. Ohne Rapamycin interagieren FRB und FKBP12 nicht, und das FRB-markierte Protein verbleibt im Zellkern. Bei zusätzlicher Gabe von Rapamycin bildet das Rapamycin einen stabilen Komplex mit FKBP12 und FRB, der aufgrund der Wechselwirkung mit Rpl13A aus dem Zellkern geschleudert wird (Abbildung 1). Um den Zelltod durch Rapamycin zusätzlich zu verhindern, beherbergen Zellen die tor1-1-Mutation des TOR1-Gens . Zusätzlich enthalten diese Zellen fpr1Δ , ein Null-Allel des S. cerevisiae FKBP12-Proteins, das verhindert, dass endogenes Fpr1 Rpl13A-FKBP12 für FRB- und Rapamycin-Bindung übertrifft. Die Anker-Hintergrundmutationen, tor1-1 und fpr1Δ, haben keinen Einfluss auf meiotische Timings oder Chromosomentrennung2.
Um die Nützlichkeit dieser Technik zu demonstrieren, wurde das Kinetochor-Protein Ctf19 zu verschiedenen Zeitpunkten während der Meiose abgebaut. Ctf19 ist eine Komponente des Kinetochors, die bei der Mitose entbehrlich ist, aber für die richtige Chromosomentrennung in der Meiose 9,10,11,12,13 erforderlich ist. Bei der Meiose wird das Kinetochor in der Prophase I ausgeschieden, und Ctf19 ist wichtig für die Remontagedes Kinetochors 9,14. Für dieses Protokoll wurden Zellen mit dem NDT80-in-System synchronisiert, und die Ankerweg-Technik wurde verwendet, um das Zielprotein Ctf19 vor und nach der Freisetzung aus der Prophase I und nach der Meiose-I-Chromosomentrennung aus dem Zellkern zu entfernen (Abbildung 1). Dieses Protokoll kann angepasst werden, um andere Proteine von Interesse in jedem Stadium der Meiose und Mitose zu erschöpfen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll kombiniert das NDT80-in-System zur Synchronisierung von Zellen, die Ankertechnik, um Proteine aus dem Zellkern zu entfernen, und die Fluoreszenz-Zeitraffermikroskopie, um knospende Hefezellen während der Meiose abzubilden. Das NDT80-in-System ist eine Methode zur Synchronisation des meiotischen Zellzyklus, die einen Prophase-I-Arrest und -Release 4,8 verwendet. Obwohl die einzelnen Zellen in der Zeit, die sie in jedem der nachf…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Light Microscopy Imaging Center der Indiana University. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health (GM105755) unterstützt.
Materials
| β-estradiol | Millipore Sigma | E8875 | Make 1mM stocks in 95% EtOH |
| 0.22 uM Threaded Bottle-top Filter | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
| 100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Dilute 1:10 to use as solvent for ConA |
| 24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 | VWR North American | 48393241 | |
| 25 mm x 75 mm microscope slides | VWR North American | 48300-026 | |
| Adenine hemisulfate salt | Millipore Sigma | A9126 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Bacto Agar | BD | 214030 | |
| Concanavialin A | Mllipore Sigma | C2010 | Make as 1mg/mL in 1X PBS |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | Used in Section 4.3 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD | 291920 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
| Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| Fiji | NIH | Download from https://fiji.sc/ | |
| GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| L-Tryptophan | Millipore Sigma | T0254 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | To secure coverslip in slide holder |
| NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Used in Section 4.4 |
| Plastic pipette tip holder | Dot Scientific | LTS1000-HR | Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. |
| Pottassium Acetate | Fisher Scientific | BP264 | |
| Rapamycin | Fisher Scientific | BP29631 | Make 1mg/mL stocks in DMSO |
| Silicone Sealant | Aqueon | 100165001 | Also known as aquarium glue. |
| SoftWorx7.0.0 Imaging Software | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| Synthetic Complete Mixture (Kaiser) | Formedium | DSCK2500 | |
| Type N immersion oil | Nikon | MXA22166 |
Riferimenti
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