Utilisation de la microscopie accélérée et de l’épuisement nucléaire spécifique au stade des protéines pour étudier la méiose chez S. cerevisiae
Summary
La microscopie time-lapse est un outil précieux pour étudier la méiose chez la levure bourgeonnante. Ce protocole décrit une méthode qui combine la synchronisation du cycle cellulaire, la microscopie accélérée et l’épuisement conditionnel d’une protéine cible pour démontrer comment étudier la fonction d’une protéine spécifique pendant la ségrégation chromosomique méiotique.
Abstract
La microscopie à fluorescence accélérée a révolutionné la compréhension des événements du cycle cellulaire méiotique en fournissant des données temporelles et spatiales qui ne sont souvent pas vues par imagerie des cellules fixes. La levure bourgeonnante s’est avérée être un organisme modèle important pour étudier la ségrégation des chromosomes méiotiques, car de nombreux gènes méiotiques sont hautement conservés. La microscopie accélérée de la méiose chez la levure bourgeonnante permet de surveiller différents mutants méiotiques pour montrer comment la mutation perturbe les processus méiotiques. Cependant, de nombreuses protéines fonctionnent à plusieurs points de la méiose. L’utilisation de mutants nuls méiotiques ou de perte de fonction peut donc perturber un processus précoce, bloquant ou perturbant le processus ultérieur et rendant difficile la détermination des phénotypes associés à chaque rôle individuel. Pour contourner ce défi, ce protocole décrit comment les protéines peuvent être épuisées conditionnellement du noyau à des stades spécifiques de la méiose tout en surveillant les événements méiotiques à l’aide de la microscopie accélérée. Plus précisément, ce protocole décrit comment les cellules sont synchronisées dans la prophase I, comment la technique d’ancrage est utilisée pour épuiser les protéines du noyau à des stades méiotiques spécifiques et comment l’imagerie accélérée est utilisée pour surveiller la ségrégation chromosomique méiotique. À titre d’exemple de l’utilité de la technique, la protéine kinétochore Ctf19 a été épuisée du noyau à différents moments de la méiose, et le nombre de masses de chromatine a été analysé à la fin de la méiose II. Dans l’ensemble, ce protocole peut être adapté pour épuiser différentes protéines nucléaires du noyau tout en surveillant les divisions méiotiques.
Introduction
La microcopie à fluorescence accélérée est un outil précieux pour étudier la dynamique de la ségrégation des chromosomes méiotiques chez la levure bourgeonnante 1,2. Les cellules de levure bourgeonnantes peuvent être induites à subir une méiose par la famine de nutriments clés3. Au cours de la méiose, les cellules subissent un cycle de ségrégation chromosomique suivi de deux divisions pour créer quatre produits méiotiques qui sont emballés dans des spores (Figure 1). Les cellules individuelles peuvent être visualisées à chaque étape de la méiose, ce qui génère des données spatiales et temporelles qui peuvent facilement être manquées par l’imagerie à cellules fixes. Ce protocole montre comment la combinaison de la microscopie à fluorescence time-lapse avec deux méthodes précédemment établies, le système NDT80 inductible (NDT80-in) et la technique d’ancrage, peut être utilisée pour étudier la fonction de protéines spécifiques à des stades méiotiques distincts.
Le système NDT80-in est un outil puissant de synchronisation du cycle cellulaire méiotique qui repose sur l’expression inductible du facteur de transcription de la méiose moyenne NDT80 4,5. L’expression de NDT80 est requise pour la sortie 6,7 de la prophaseI. Avec le système NDT80-in, NDT80 est sous le contrôle du promoteur GAL1-10 dans les cellules exprimant le facteur de transcription Gal4 fusionné à un récepteur d’œstrogènes (Gal4-ER)4,5. Parce que Gal4-ER ne pénètre dans le noyau que lorsqu’il est lié au β-estradiol, les cellules NDT80-in s’arrêtent dans la prophase I en l’absence de β-estradiol, ce qui permet la synchronisation des cellules dans la prophase I (Figure 1). β’ajout de -estradiol favorise la translocation du facteur de transcription Gal4-ER dans le noyau, où il lie GAL1-10 pour conduire l’expression de NDT80, conduisant à une entrée synchrone dans les divisions méiotiques. Bien que la microscopie accélérée puisse être réalisée sans synchronisation, l’avantage de l’utilisation de la synchronisation est la possibilité d’ajouter un inhibiteur ou un médicament alors que les cellules sont à un stade spécifique de la méiose.
La technique de l’ancrage est un système inductible par lequel une protéine peut être épuisée du noyau avec l’ajout de rapamycine8. Cette technique est idéale pour étudier les protéines nucléaires lors de la division cellulaire dans la levure bourgeonnante car les cellules de levure subissent une mitose fermée et une méiose, dans lesquelles l’enveloppe nucléaire ne se décompose pas. De plus, cette technique est très utile pour les protéines qui ont de multiples fonctions tout au long de la méiose. Contrairement aux délétions, aux allèles mutants ou aux allèles nuls méiotiques, l’élimination d’une protéine cible du noyau à un stade spécifique ne compromet pas l’activité de la protéine cible aux stades antérieurs, ce qui permet une interprétation plus précise des résultats. Le système d’ancrage utilise la navette des sous-unités ribosomales entre le noyau et le cytoplasme qui se produit lors de la maturation ribosomique8. Pour épuiser la protéine cible du noyau, la protéine cible est marquée avec le domaine de liaison à la rapamycine (FRB) FKBP12 dans une souche dans laquelle la sous-unité ribosomique Rpl13A est marquée avec FKBP12. Sans rapamycine, FRB et FKBP12 n’interagissent pas, et la protéine marquée FRB reste dans le noyau. Lors de l’ajout de rapamycine, la rapamycine forme un complexe stable avec FKBP12 et FRB, et le complexe est évacué du noyau en raison de l’interaction avec Rpl13A (Figure 1). Pour prévenir la mort cellulaire lors de l’ajout de rapamycine, les cellules hébergent la mutation tor1-1 du gène TOR1 . De plus, ces cellules contiennent fpr1Δ , un allèle nul de la protéine S. cerevisiae FKBP12, qui empêche Fpr1 endogène de supplanter Rpl13A-FKBP12 pour la liaison FRB et rapamycine. Les mutations de fond d’ancrage, tor1-1 et fpr1Δ, n’affectent pas les moments méiotiques ou la ségrégation chromosomique2.
Pour démontrer l’utilité de cette technique, la protéine kinétochore Ctf19 a été épuisée à différents moments de la méiose. Ctf19 est un composant de la kinétochore qui est dispensable en mitose mais nécessaire pour une ségrégation chromosomique appropriée dans la méiose 9,10,11,12,13. Dans la méiose, la kinétochore est éliminée dans la prophase I, et Ctf19 est importante pour le réassemblagede kinétochore 9,14. Pour ce protocole, les cellules avec le système NDT80-in ont été synchronisées, et la technique d’ancrage loin a été utilisée pour épuiser la protéine cible Ctf19 du noyau avant et après la libération de la prophase I, et après la ségrégation du chromosome I de la méiose (Figure 1). Ce protocole peut être adapté pour épuiser d’autres protéines d’intérêt à n’importe quel stade de la méiose et de la mitose.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole combine le système NDT80-in pour synchroniser les cellules, la technique d’ancrage pour épuiser les protéines du noyau et la microscopie accélérée à fluorescence pour imager les cellules de levure bourgeonnantes pendant la méiose. Le système NDT80-in est une méthode de synchronisation du cycle cellulaire méiotique qui utilise un arrêt et une libération 4,8 de la prophaseI. Bien que le temps passé dans chacune des ét…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Light Microscopy Imaging Center de l’Université de l’Indiana. Ce travail a été soutenu par une subvention des National Institutes of Health (GM105755).
Materials
| β-estradiol | Millipore Sigma | E8875 | Make 1mM stocks in 95% EtOH |
| 0.22 uM Threaded Bottle-top Filter | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
| 100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Dilute 1:10 to use as solvent for ConA |
| 24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 | VWR North American | 48393241 | |
| 25 mm x 75 mm microscope slides | VWR North American | 48300-026 | |
| Adenine hemisulfate salt | Millipore Sigma | A9126 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Bacto Agar | BD | 214030 | |
| Concanavialin A | Mllipore Sigma | C2010 | Make as 1mg/mL in 1X PBS |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | Used in Section 4.3 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD | 291920 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
| Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| Fiji | NIH | Download from https://fiji.sc/ | |
| GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| L-Tryptophan | Millipore Sigma | T0254 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | To secure coverslip in slide holder |
| NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Used in Section 4.4 |
| Plastic pipette tip holder | Dot Scientific | LTS1000-HR | Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. |
| Pottassium Acetate | Fisher Scientific | BP264 | |
| Rapamycin | Fisher Scientific | BP29631 | Make 1mg/mL stocks in DMSO |
| Silicone Sealant | Aqueon | 100165001 | Also known as aquarium glue. |
| SoftWorx7.0.0 Imaging Software | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| Synthetic Complete Mixture (Kaiser) | Formedium | DSCK2500 | |
| Type N immersion oil | Nikon | MXA22166 |
Riferimenti
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