Anvendelse af timelapsemikroskopi og fasespecifik nuklear udtømning af proteiner til undersøgelse af meiose i S. cerevisiae
Summary
Time-lapse mikroskopi er et værdifuldt værktøj til at studere meiose i spirende gær. Denne protokol beskriver en metode, der kombinerer cellecyklussynkronisering, time-lapse-mikroskopi og betinget udtømning af et målprotein for at demonstrere, hvordan man studerer funktionen af et specifikt protein under meiotisk kromosomadskillelse.
Abstract
Time-lapse fluorescensmikroskopi har revolutioneret forståelsen af meiotiske cellecyklushændelser ved at levere tidsmæssige og rumlige data, der ofte ikke ses ved billeddannelse af faste celler. Spirende gær har vist sig at være en vigtig modelorganisme til at studere meiotisk kromosomadskillelse, fordi mange meiotiske gener er stærkt bevarede. Time-lapse mikroskopi af meiose i spirende gær tillader overvågning af forskellige meiotiske mutanter for at vise, hvordan mutationen forstyrrer meiotiske processer. Imidlertid fungerer mange proteiner på flere punkter i meiose. Brugen af tab-af-funktion eller meiotiske nulmutanter kan derfor forstyrre en tidlig proces, blokere eller forstyrre den senere proces og gøre det vanskeligt at bestemme fænotyperne forbundet med hver enkelt rolle. For at omgå denne udfordring beskriver denne protokol, hvordan proteinerne kan udtømmes betinget fra kernen på bestemte stadier af meiose, mens de overvåger meiotiske begivenheder ved hjælp af time-lapse-mikroskopi. Specifikt beskriver denne protokol, hvordan cellerne synkroniseres i profase I, hvordan anker væk-teknikken bruges til at nedbryde proteiner fra kernen på specifikke meiotiske stadier, og hvordan time-lapse-billeddannelse bruges til at overvåge meiotisk kromosomadskillelse. Som et eksempel på teknikkens anvendelighed blev kinetochoreproteinet Ctf19 udtømt fra kernen på forskellige tidspunkter under meiose, og antallet af kromatinmasser blev analyseret i slutningen af meiose II. Samlet set kan denne protokol tilpasses til at nedbryde forskellige nukleare proteiner fra kernen, mens de meiotiske divisioner overvåges.
Introduction
Time-lapse fluorescensmikrokopi er et værdifuldt værktøj til at studere dynamikken i meiotisk kromosomadskillelse i spirende gær 1,2. Spirende gærceller kan induceres til at gennemgå meiose gennem sult af vigtige næringsstoffer3. Under meiose gennemgår celler en runde kromosomadskillelse efterfulgt af to divisioner for at skabe fire meiotiske produkter, der pakkes i sporer (figur 1). Individuelle celler kan visualiseres gennem hvert trin af meiose, hvilket genererer rumlige og tidsmæssige data, der let kan gå glip af fastcellebilleddannelse. Denne protokol viser, hvordan kombination af time-lapse fluorescensmikroskopi med to tidligere etablerede metoder, det inducerbare NDT80-system (NDT80-in) og anker væk-teknikken, kan bruges til at studere funktionen af specifikke proteiner i forskellige meiotiske stadier.
NDT80-in-systemet er et kraftfuldt værktøj til meiotisk cellecyklussynkronisering, der er afhængig af den inducerbare ekspression af den midterste meiosetranskriptionsfaktor NDT80 4,5. NDT80-ekspression er påkrævet for profase I frakørsel 6,7. Med NDT80-in-systemet er NDT80 under kontrol af GAL1-10-promotoren i celler, der udtrykker Gal4-transkriptionsfaktoren smeltet sammen med en østrogenreceptor (Gal4-ER)4,5. Fordi Gal4-ER kun kommer ind i kernen, når den er bundet til β-østradiol, standses NDT80-in-celler i profase I i fravær af β-østradiol, hvilket tillader synkronisering af celler i profase I (figur 1). β-østradiol-tilsætning fremmer translokationen af Gal4-ER-transkriptionsfaktoren ind i kernen, hvor den binder GAL1-10 for at drive ekspression af NDT80, hvilket fører til synkron indtræden i de meiotiske divisioner. Selvom time-lapse-mikroskopi kan udføres uden synkronisering, er fordelen ved at bruge synkronisering evnen til at tilføje en hæmmer eller et lægemiddel, mens cellerne er på et bestemt stadium af meiose.
Anker væk teknikken er et inducerbart system, hvormed et protein kan udtømmes fra kernen med tilsætning af rapamycin8. Denne teknik er ideel til at studere nukleare proteiner under celledeling i spirende gær, fordi gærceller gennemgår lukket mitose og meiose, hvor den nukleare kuvert ikke nedbrydes. Desuden er denne teknik meget nyttig til proteiner, der har flere funktioner gennem meiose. I modsætning til deletioner, mutante alleler eller meiotiske nullalleler kompromitterer fjernelsen af et målprotein fra kernen på et bestemt stadium ikke målproteinaktiviteten på tidligere stadier, hvilket giver mulighed for en mere nøjagtig fortolkning af resultaterne. Anker væk-systemet udnytter shuttling af ribosomale underenheder mellem kernen og cytoplasmaet, der opstår ved ribosomal modning8. For at nedbryde målproteinet fra kernen mærkes målproteinet med FKBP12-rapamycinbindingsdomænet (FRB) i en stamme, hvor den ribosomale underenhed Rpl13A er mærket med FKBP12. Uden rapamycin interagerer FRB og FKBP12 ikke, og det FRB-mærkede protein forbliver i kernen. Ved rapamycintilsætning danner rapamycin et stabilt kompleks med FKBP12 og FRB, og komplekset transporteres ud af kernen på grund af interaktionen med Rpl13A (figur 1). For at forhindre celledød ved rapamycintilsætning har celler tor1-1-mutationen af TOR1-genet . Derudover indeholder disse celler fpr1Δ , en nullallel af S. cerevisiae FKBP12-proteinet, som forhindrer endogen Fpr1 i at udkonkurrere Rpl13A-FKBP12 for FRB og rapamycinbinding. Ankeret væk baggrundsmutationer, tor1-1 og fpr1Δ, påvirker ikke meiotiske timinger eller kromosomadskillelse2.
For at demonstrere nytten af denne teknik blev kinetochore-proteinet Ctf19 udtømt på forskellige tidspunkter gennem hele meiosen. Ctf19 er en komponent i kinetochore, der kan undværes i mitose, men kræves for korrekt kromosomadskillelse i meiose 9,10,11,12,13. Ved meiose kastes kinetochore i profase I, og Ctf19 er vigtig for kinetochore genmontering 9,14. Til denne protokol blev celler med NDT80-in-systemet synkroniseret, og ankervækteknikken blev brugt til at nedbryde målproteinet Ctf19 fra kernen før og efter frigivelsen fra profase I og efter meiose I-kromosomadskillelse (figur 1). Denne protokol kan tilpasses til at nedbryde andre proteiner af interesse på ethvert stadium af meiose og mitose.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol kombinerer NDT80-in-systemet til at synkronisere celler, anker-væk-teknikken til at nedbryde proteiner fra kernen og fluorescens time-lapse-mikroskopi til at afbilde spirende gærceller under meiose. NDT80-in-systemet er en metode til meiotisk cellecyklussynkronisering, der bruger en profase I-arrestation og frigivelseaf 4,8. Selvom individuelle celler vil variere lidt i mængden af tid brugt i hvert af de efterfølgende meiotisk…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Light Microscopy Imaging Center ved Indiana University. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra National Institutes of Health (GM105755).
Materials
| β-estradiol | Millipore Sigma | E8875 | Make 1mM stocks in 95% EtOH |
| 0.22 uM Threaded Bottle-top Filter | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
| 100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Dilute 1:10 to use as solvent for ConA |
| 24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 | VWR North American | 48393241 | |
| 25 mm x 75 mm microscope slides | VWR North American | 48300-026 | |
| Adenine hemisulfate salt | Millipore Sigma | A9126 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Bacto Agar | BD | 214030 | |
| Concanavialin A | Mllipore Sigma | C2010 | Make as 1mg/mL in 1X PBS |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | Used in Section 4.3 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD | 291920 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
| Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| Fiji | NIH | Download from https://fiji.sc/ | |
| GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| L-Tryptophan | Millipore Sigma | T0254 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | To secure coverslip in slide holder |
| NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Used in Section 4.4 |
| Plastic pipette tip holder | Dot Scientific | LTS1000-HR | Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. |
| Pottassium Acetate | Fisher Scientific | BP264 | |
| Rapamycin | Fisher Scientific | BP29631 | Make 1mg/mL stocks in DMSO |
| Silicone Sealant | Aqueon | 100165001 | Also known as aquarium glue. |
| SoftWorx7.0.0 Imaging Software | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| Synthetic Complete Mixture (Kaiser) | Formedium | DSCK2500 | |
| Type N immersion oil | Nikon | MXA22166 |
Riferimenti
- Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).
- Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136 (2020).
- van Werven, F. J., Amon, A. Regulation of entry into gametogenesis. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).
- Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
- Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).
- Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).
- Chu, S., Herskowitz, I. Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80. Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Borek, W. E., et al. The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly. Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).
- Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).
- Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore. Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).
- Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).
- Fernius, J., Marston, A. L. Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3. PLoS Genetics. 5 (9), 1000629 (2009).
- Meyer, R. E., et al. Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).
- Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).
- Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast. Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).
- Ben-Ari, G., et al. Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast. PLoS Genetics. 2 (11), 195 (2006).
- Primig, M., et al. The core meiotic transcriptome in budding yeasts. Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).
- Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae. Genetica. 124 (2), 237-249 (1990).
- Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
- Byers, B., Goetsch, L. Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature. Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).
- Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetica. 189 (3), 737-765 (2011).
- Robinett, C., et al. C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).
- Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion. Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).
- Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis. Cell. 72 (3), 365-378 (1993).
- Scherthan, H., et al. Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).
