Uso de microscopía de lapso de tiempo y agotamiento nuclear de proteínas en etapa específica para estudiar la meiosis en S. cerevisiae

Summary

La microscopía de lapso de tiempo es una herramienta valiosa para estudiar la meiosis en levaduras en ciernes. Este protocolo describe un método que combina la sincronización del ciclo celular, la microscopía de lapso de tiempo y el agotamiento condicional de una proteína diana para demostrar cómo estudiar la función de una proteína específica durante la segregación cromosómica meiótica.

Abstract

La microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo ha revolucionado la comprensión de los eventos del ciclo celular meiótico al proporcionar datos temporales y espaciales que a menudo no se ven al obtener imágenes de células fijas. La levadura en ciernes ha demostrado ser un organismo modelo importante para estudiar la segregación cromosómica meiótica porque muchos genes meióticos están altamente conservados. La microscopía de lapso de tiempo de la meiosis en levaduras en ciernes permite el monitoreo de diferentes mutantes meióticos para mostrar cómo la mutación interrumpe los procesos meióticos. Sin embargo, muchas proteínas funcionan en múltiples puntos de la meiosis. Por lo tanto, el uso de mutantes nulos meióticos o de pérdida de función puede interrumpir un proceso temprano, bloqueando o perturbando el proceso posterior y dificultando la determinación de los fenotipos asociados con cada rol individual. Para eludir este desafío, este protocolo describe cómo las proteínas pueden agotarse condicionalmente del núcleo en etapas específicas de la meiosis mientras se monitorean los eventos meióticos utilizando microscopía de lapso de tiempo. Específicamente, este protocolo describe cómo se sincronizan las células en la profase I, cómo se utiliza la técnica de anclaje para agotar las proteínas del núcleo en etapas meióticas específicas y cómo se utilizan las imágenes de lapso de tiempo para monitorear la segregación cromosómica meiótica. Como ejemplo de la utilidad de la técnica, la proteína cinetocoro Ctf19 se agotó del núcleo en diferentes puntos de tiempo durante la meiosis, y el número de masas de cromatina se analizó al final de la meiosis II. En general, este protocolo se puede adaptar para agotar diferentes proteínas nucleares del núcleo mientras se monitorean las divisiones meióticas.

Introduction

La microcopia de fluorescencia time-lapse es una herramienta valiosa para estudiar la dinámica de la segregación cromosómica meiótica en levaduras en ciernes ^1,2. Las células de levadura en ciernes pueden ser inducidas a someterse a meiosis a través de la inanición de nutrientes clave³. Durante la meiosis, las células se someten a una ronda de segregación cromosómica seguida de dos divisiones para crear cuatro productos meióticos que se empaquetan en esporas (Figura 1). Las células individuales se pueden visualizar a lo largo de cada etapa de la meiosis, lo que genera datos espaciales y temporales que pueden pasarse por alto fácilmente mediante imágenes de células fijas. Este protocolo muestra cómo la combinación de microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo con dos métodos previamente establecidos, el sistema NDT80 inducible (NDT80-in) y la técnica de anclaje, se puede utilizar para estudiar la función de proteínas específicas en distintas etapas meióticas.

El sistema NDT80-in es una poderosa herramienta para la sincronización del ciclo celular meiótico que se basa en la expresión inducible del factor de transcripción de meiosis media NDT80 ^4,5. La expresión de NDT80 es necesaria para la salida ^6,7 de la profase I. Con el sistema NDT80-in, NDT80 está bajo el control del promotor GAL1-10 en células que expresan el factor de transcripción Gal4 fusionado a un receptor de estrógeno (Gal4-ER)^4,5. Debido a que Gal4-ER solo ingresa al núcleo cuando se une al β-estradiol, las células NDT80-in se detienen en la profase I en ausencia de β-estradiol, lo que permite la sincronización de las células en la profase I (Figura 1). β-estradiol promueve la translocación del factor de transcripción Gal4-ER en el núcleo, donde se une a GAL1-10 para impulsar la expresión de NDT80, lo que lleva a la entrada sincrónica en las divisiones meióticas. Aunque la microscopía de lapso de tiempo se puede realizar sin sincronización, la ventaja de usar la sincronización es la capacidad de agregar un inhibidor o un medicamento mientras las células se encuentran en una etapa específica de la meiosis.

La técnica de anclaje es un sistema inducible por el cual una proteína puede ser agotada del núcleo con la adición de rapamicina⁸. Esta técnica es ideal para estudiar las proteínas nucleares durante la división celular en levadura en ciernes porque las células de levadura sufren mitosis cerrada y meiosis, en las que la envoltura nuclear no se descompone. Además, esta técnica es muy útil para proteínas que tienen múltiples funciones a lo largo de la meiosis. A diferencia de las deleciones, alelos mutantes o alelos nulos meióticos, la eliminación de una proteína diana del núcleo en una etapa específica no compromete la actividad de la proteína diana en etapas anteriores, lo que permite una interpretación más precisa de los resultados. El sistema de anclaje utiliza el desplazamiento de subunidades ribosómicas entre el núcleo y el citoplasma que ocurre en la maduración ribosómica⁸. Para agotar la proteína diana del núcleo, la proteína diana se marca con el dominio de unión a rapamicina FKBP12 (FRB) en una cepa en la que la subunidad ribosómica Rpl13A se marca con FKBP12. Sin rapamicina, FRB y FKBP12 no interactúan, y la proteína marcada con FRB permanece en el núcleo. Tras la adición de rapamicina, la rapamicina forma un complejo estable con FKBP12 y FRB, y el complejo es expulsado del núcleo debido a la interacción con Rpl13A (Figura 1). Para prevenir la muerte celular tras la adición de rapamicina, las células albergan la mutación tor1-1 del gen TOR1 . Además, estas células contienen fpr1Δ , un alelo nulo de la proteína FKBP12 de S. cerevisiae , que evita que Fpr1 endógeno supere a Rpl13A-FKBP12 para la unión de FRB y rapamicina. Las mutaciones de fondo de anclaje, tor1-1 y fpr1Δ, no afectan a los tiempos meióticos ni a la segregación cromosómica².

Para demostrar la utilidad de esta técnica, la proteína cinetocoro Ctf19 se agotó en diferentes puntos de tiempo a lo largo de la meiosis. Ctf19 es un componente del cinetocoro que es prescindible en la mitosis pero necesario para la segregación cromosómica adecuada en la meiosis 9,10,11,12,13. En la meiosis, el cinetocoro se desprende en la profase I, y Ctf19 es importante para el reensamblaje del cinetocoro ^9,14. Para este protocolo, las células con el sistema NDT80-in se sincronizaron, y se utilizó la técnica de anclaje para agotar la proteína diana Ctf19 del núcleo antes y después de la liberación de la profase I, y después de la segregación del cromosoma I de la meiosis (Figura 1). Este protocolo se puede adaptar para agotar otras proteínas de interés en cualquier etapa de la meiosis y la mitosis.

Protocol

1. Preparación de los materiales necesarios Preparar reactivos para el crecimiento y la esporulación de las células de levadura.NOTA: Si las cepas de levadura en ciernes son ade2- y trp1-, complemente todos los medios en los pasos 1.1.1-1.1.3 con una concentración final de 0,01% de adenina y 0,01% de triptófano de 1% de cepas. Si esteriliza los medios en autoclave, agregue estos aminoácidos solo después de que los reactivos hayan sido esterilizados en autoclave y se…

Representative Results

Para controlar la segregación de la cromatina, la proteína histona Htb2 se marcó con mCherry. En la profase I, la cromatina aparece como una sola masa Htb2. Después de que los cromosomas homólogos se segregan en la primera división meiótica, la cromatina aparece como dos masas distintas (Figura 3A). Después de que las cromátidas hermanas se segregan, la cromatina aparece como cuatro masas. Si algunos cromosomas no se adhieren a los microtúbulos fusiformes, se pueden ver masas adici…

Discussion

Este protocolo combina el sistema NDT80-in para sincronizar células, la técnica de anclaje para agotar las proteínas del núcleo y la microscopía de lapso de tiempo de fluorescencia para obtener imágenes de las células de levadura en ciernes durante la meiosis. El sistema NDT80-in es un método para la sincronización del ciclo celular meiótico que utiliza una profase I de detención y liberación ^4,8. Aunque las células individuales var…

Materials

β-estradiol	Millipore Sigma	E8875	Make 1mM stocks in 95% EtOH
0.22 uM Threaded Bottle-top Filter	Millipore Sigma	S2GPT02RE
100% EtOH	Fisher Scientific	22-032-601
10X PBS	Fisher Scientific	BP399500	Dilute 1:10 to use as solvent for ConA
24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5	VWR North American	48393241
25 mm x 75 mm microscope slides	VWR North American	48300-026
Adenine hemisulfate salt	Millipore Sigma	A9126	To supplement SC, SCA, and 1% Kac
Bacto Agar	BD	214030
Concanavialin A	Mllipore Sigma	C2010	Make as 1mg/mL in 1X PBS
CoolSNAP HQ2 CCD camera	Photometrics		Used in Section 4.3
D-glucose	Fisher Scientific	D16-10
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	BD	291920
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Millipore Sigma	D5879
Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope	Nikon		Used in Section 4.4
Fiji	NIH		Download from https://fiji.sc/
GE Personal DeltaVision Microscope	Applied Precision		Used in Section 4.3
L-Tryptophan	Millipore Sigma	T0254	To supplement SC, SCA, and 1% Kac
Modeling Clay	Crayola	2302880000	To secure coverslip in slide holder
NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software	Nikon		Used in Section 4.4
ORCA-Fustion BT Camera	Hamamatsu	C15440-20UP	Used in Section 4.4
Plastic pipette tip holder	Dot Scientific	LTS1000-HR	Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product.
Pottassium Acetate	Fisher Scientific	BP264
Rapamycin	Fisher Scientific	BP29631	Make 1mg/mL stocks in DMSO
Silicone Sealant	Aqueon	100165001	Also known as aquarium glue.
SoftWorx7.0.0  Imaging Software	Applied Precision		Used in Section 4.3
Synthetic Complete Mixture (Kaiser)	Formedium	DSCK2500
Type N immersion oil	Nikon	MXA22166