الكشف عن الخلايا التائية متعددة الوظائف لدى الأطفال الذين تم تطعيمهم بلقاح التهاب الدماغ الياباني عبر تقنية قياس التدفق الخلوي
Summary
يجمع البروتوكول الحالي بين التحفيز خارج الجسم الحي وقياس التدفق الخلوي لتحليل ملامح الخلايا التائية متعددة الوظائف (TPF) في خلايا الدم الطرفية أحادية النواة (PBMCs) داخل الأطفال الملقحين بفيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV). تم اختبار طريقة الكشف ونظام ألوان قياس التدفق الخلوي ل TPFs الخاصة ب JEV لتوفير مرجع لدراسات مماثلة.
Abstract
تلعب المناعة الخلوية التائية دورا مهما في السيطرة على عدوى الفيروس المصفر ، إما بعد التطعيم أو بعد العدوى الطبيعية. يجب تقييم “جودة” الخلية التائية حسب الوظيفة ، وترتبط الوظيفة الأعلى بحماية مناعية أكثر قوة. تسمى الخلايا التائية التي يمكنها إنتاج اثنين أو أكثر من السيتوكينات أو الكيموكينات في وقت واحد على مستوى الخلية الواحدة بالخلايا التائية متعددة الوظائف (T PF s) ، والتي تتوسط الاستجابات المناعية من خلال مجموعة متنوعة من الآليات الجزيئية للتعبير عن علامات التحلل (CD107a) وإفراز الإنترفيرون (IFN) -γ ، أو عامل نخر الورم (TNF) -α ، أو الإنترلوكين (IL) -2 ، أو بروتين التهاب البلاعم (MIP) -1α. هناك أدلة متزايدة على أن TPFs ترتبط ارتباطا وثيقا بالحفاظ على الذاكرة المناعية طويلة المدى والحماية وأن نسبتها المتزايدة هي علامة مهمة على المناعة الوقائية وهي مهمة في السيطرة الفعالة على العدوى الفيروسية وإعادة التنشيط. لا ينطبق هذا التقييم على استجابات مناعية محددة فحسب ، بل ينطبق أيضا على تقييم الاستجابات المناعية التفاعلية المتقاطعة. هنا ، مع أخذ فيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV) كمثال ، تم اختبار طريقة الكشف ونظام ألوان قياس التدفق الخلوي ل TPFالخاص ب JEV الذي تنتجه خلايا الدم الطرفية أحادية النواة للأطفال الذين تم تطعيمهم ضد التهاب الدماغ الياباني لتوفير مرجع لدراسات مماثلة.
Introduction
فيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV) هو فيروس مهم ينقله البعوض ينتمي إلى جنس Flavivirus ضمن عائلة Flaviviridae1. لطالما واجهت العديد من دول آسيا والمحيط الهادئ تحديات هائلة في مجال الصحة العامة بسبب عبء المرض الهائل الناجم عن التهاب الدماغ الياباني (JE) ، ولكن هذا تحسن بشكل كبير مع زيادة توافر أنواع مختلفة من اللقاحات2. تساهم الاستجابات المناعية الوقائية التكيفية التي تثيرها العدوى الطبيعية أو التطعيم في الوقاية والتنظيم المضاد للفيروسات. تصنف المناعة الخلطية والمناعة الخلوية على أنها مناعة تكيفية ، وكان تحريض الأول يعتبر دائما استراتيجية رئيسية في تصميم اللقاح ، وإن كان ذلك بفهم محدود نسبيا في الماضي3. ومع ذلك ، فإن دور المناعة التائية بوساطة الخلايا التائية في الحد من انتشار الفيروس المصفر وإزالة الفيروسات قد تم التركيز عليه بشكل متزايد ودراسته على نطاق واسع4. علاوة على ذلك ، لا لا غنى عن مناعة الخلايا التائية في الاستجابات المضادة للفيروسات الخاصة ب JEV فحسب ، بل تلعب أيضا دورا بارزا في الحماية المتصالبة من العدوى الثانوية بالفيروسات المصفرة غير المتجانسة ، والتي تم إثباتها في الدراسات السابقة5. من المتوقع أن هذا التأثير قد يتجاوز تأثيرات التعزيز المحتملة بوساطة الأجسام المضادة في العدوى5. تجدر الإشارة إلى أن مناعة الخلايا التائية المتصالبة هذه مهمة ، خاصة في حالة عدم وجود لقاحات وأدوية مضادة للفيروسات ضد الفيروسات المصفرة. على الرغم من إجراء العديد من الدراسات لتحديد مساهمة الخلايا التائية في عدوى JEV فيما يتعلق بالخلايا التائيةCD4 + و CD8 + 6,7 ، إلا أن السلالات المعنية التي تفرز السيتوكينات وتنوعها الوظيفي لا تزال غير محددة ، مما يعني أن توضيح الوظائف الدقيقة للخلايا التائية المساعدة والقاتلة يعوق.
يحدد حجم دفاعاتهم المضادة للفيروسات جودة استجابات الخلايا التائية. تتميز الخلايا التائية CD4 + أو CD8 + التي يمكن أن تمنح وظيفتين أو أكثر ، بما في ذلك إفراز السيتوكين وإزالة التحلل ، بأنها خلايا تائية متعددة الوظائف (TPFs) عند تحفيز محدد على مستوى الخلية الواحدة8. قد يكون للخلايا التائية CD4 + التي تنتج سيتوكينات مفردة أو متعددة تأثيرات مختلفة وذكريات مناعية. على سبيل المثال ، من المرجح أن تشكل الخلايا التائية IL-2 + IFN-γ + CD4 + استجابة وقائية فعالة طويلة الأجل من الخلايا التائيةIL-2 + CD4 + 9 ، والتي يمكن استخدامها كمعلمة مهمة في تقييم تأثير التطعيم. يزداد تواتر الخلايا التائية IL-2 + IFN-γ + CD4 + في المرضى الذين يعانون من عدم تطور متلازمة نقص المناعة المكتسب (الإيدز) على المدى الطويل ، في حين أن الخلايا التائية CD4 + في المرضى الذين يعانون من تطور الإيدز أكثر ميلا لإنتاج IFN-γ وحدها بسبب التأثير المعزز ل IL-2 على تكاثر الخلايا التائية10. علاوة على ذلك ، تبين أن مجموعة فرعية من IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ تعيش على المدى الطويل في الجسم الحي وتعزز بشكل تآزري وظيفة القتل11. على الرغم من أن الخلايا التائية CD8 + من المرجح أن تظهر نشاطا ساما للخلايا ، إلا أن بعض الخلايا التائية CD4 + مجهزة أيضا بنشاط سام للخلايا كتعبير مكتشف بشكل غير مباشر عن جزيئات CD107a السطحية12. بالإضافة إلى ذلك ، تعبر مجموعات فرعية معينة من الخلايا التائية عن chemokine MIP-1α ، والذي غالبا ما تفرزه الخلايا الوحيدة للمشاركة في تجنيد العدلات بوساطة الخلايا التائية13. وبالمثل ، يمكن أيضا استخدام CD8 + TPFs لتوصيف تعدد استخدامات العلامات المذكورة أعلاه. أظهرت الدراسات أن استراتيجية التعزيز الأولي يمكن أن تحفز بشكل فعال فترة طويلة من التأثيرات الوقائية TPF 13 ، والتي يمكن أن تعزز الحماية التي يسببها التطعيم. تتمثل إحدى السمات المركزية في فحص الجهاز المناعي في قدرة خلايا الذاكرة التائية على تسهيل استجابات أقوى وأسرع وأكثر فعالية للتحديات الفيروسية الثانوية من الخلايا التائية الساذجة. تعد الخلايا التائية للذاكرة المستجيبة (TEM) وخلايا الذاكرة التائية المركزية (TCM) مجموعات فرعية مهمة من الخلايا التائية التي غالبا ما يتم تمييزها عن طريق التعبير المركب CD27 / CD45RO أو CCR7 / CD45RA14. يميل TCM (CD27 + CD45RO + أو CCR7 + CD45RA-) إلى التوطين في الأنسجة اللمفاوية الثانوية ، بينما TEM (CD27- CD45RO + أو CCR7- CD45RA–) يتمركز في الأنسجة اللمفاوية والمحيطية15,16. يوفر TEM دفاعا فوريا ولكن غير مستدام ، بينما يحافظ TCM على الاستجابة عن طريق التكاثر في الأعضاء اللمفاوية الثانوية وتوليد مستجيبات جديدة17. وبالتالي ، بالنظر إلى أن خلايا الذاكرة يمكن أن تتوسط في استجابات استدعاء محددة وفعالة للفيروسات ، تثار أسئلة حول مساهمة هذه المجموعة الفرعية من الوظائف المتعددة.
مع تطور تقنية قياس التدفق الخلوي ، أصبح من الشائع اكتشاف علامات أكثر من 10 مجموعات وأنماط ظاهرية ومستضدات تمايز في وقت واحد ، وهو أمر مفيد لشرح السمات المناعية الوظيفية على الخلايا التائية الفردية بشكل أكثر وفرة لتقليل سوء التفسير والصعوبات في فهم الأنماط الظاهرية للخلايا التائية. استخدمت هذه الدراسة التحفيز خارج الجسم الحي وقياس التدفق الخلوي لتحليل ملامح TPF في خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) داخل الأطفال الذين تم تطعيمهم ب JEV. بتطبيق هذا النهج ، سيتم توسيع فهم مناعة الخلايا التائية قصيرة وطويلة الأجل الخاصة ب JEV وحتى المتصالبة التفاعلية التي يسببها التطعيم.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمثل هذا البروتوكول طريقة كشف مجدية قائمة على قياس التدفق الخلوي لملفات تعريف TPF في PBMCs للأطفال الذين تم تطعيمهم بلقاح JEV SA14-14-2. استخدمت هذه الدراسة PBMCs الدم الوريدي لكل من الأطفال الملقحين وغير الملقحين كمواد بحثية. مع تحفيز PBMCs مع مستضد JEV ، يمكن تمييز تلك TPF sالمضخمة الخاصة بالم?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم RW من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82002130) ، مؤسسة بكين للعلوم الطبيعية في الصين (7222059). تم دعم ZD.X. من قبل صندوق الابتكار CAMS للعلوم الطبية (2019-I2M-5-026).
Materials
| anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
| anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
| APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
| BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
| BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
| BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
| BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
| BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
| Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
| FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
| Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |
References
- Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity. Pathogens. 11 (3), 317 (2022).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).
- Wang, R., et al. Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children. Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).
- Wang, R., et al. Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).
- Wang, R., et al. T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).
- Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).
- Jain, N., et al. CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).
- Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines. NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).
- Weaver, J. M., et al. Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza. PloS One. 8 (-), 57275 (2013).
- Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection. Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).
- Gui, L., et al. IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells. Cytokine. 84, 37-46 (2016).
- Terahara, K., et al. Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection. Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).
- Tanyi, J. L., et al. Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer. NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).
- Ammirati, E., et al. Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models. Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).
- Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery – A follow-up study. Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).
- Zhang, Y., et al. Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion. Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).
- Shin, H., Iwasaki, A. Tissue-resident memory T cells. Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).
- Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents. Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).
- Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system. Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Zheng, X., et al. Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).
- Zheng, X., et al. Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China. Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19. Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).
- Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins. Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).
