Detección de células T polifuncionales en niños vacunados con la vacuna contra la encefalitis japonesa mediante la técnica de citometría de flujo
Summary
El presente protocolo combina la estimulación ex vivo y la citometría de flujo para analizar los perfiles de células T polifuncionales (T PF) en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en niños vacunados contra el virus de la encefalitis japonesa (JEV). El método de detección y el esquema de color de citometría de flujo de los TPF específicos de JEV se probaron para proporcionar una referencia para estudios similares.
Abstract
La inmunidad mediada por células T juega un papel importante en el control de la infección por flavivirus, ya sea después de la vacunación o después de una infección natural. La “calidad” de una célula T debe evaluarse por función, y una mayor función se asocia con una protección inmune más potente. Las células T que pueden producir simultáneamente dos o más citoquinas o quimiocinas a nivel de una sola célula se denominan células T polifuncionales (TPFs), que median las respuestas inmunes a través de una variedad de mecanismos moleculares para expresar marcadores de desgranulación (CD107a) y secretar interferón (IFN)-γ, factor de necrosis tumoral (TNF)-α, interleucina (IL)-2 o proteína inflamatoria de macrófagos (MIP)-1α. Cada vez hay más pruebas de que losPFT están estrechamente relacionados con el mantenimiento de la memoria y la protección inmunitaria a largo plazo y que su mayor proporción es un marcador importante de inmunidad protectora y es importante en el control efectivo de la infección viral y la reactivación. Esta evaluación se aplica no solo a respuestas inmunes específicas, sino también a la evaluación de respuestas inmunes de reacción cruzada. Aquí, tomando el virus de la encefalitis japonesa (JEV) como ejemplo, el método de detección y el esquema de color de citometría de flujo de TPFespecíficos de JEV producidos por células mononucleares de sangre periférica de niños vacunados contra la encefalitis japonesa se probaron para proporcionar una referencia para estudios similares.
Introduction
El virus de la encefalitis japonesa (JEV) es un importante virus transmitido por mosquitos perteneciente al género Flavivirus dentro de la familia Flaviviridae1. Muchos países de Asia y el Pacífico han enfrentado durante mucho tiempo enormes desafíos de salud pública debido a la enorme carga de enfermedad causada por la encefalitis japonesa (EJ), pero esto ha mejorado dramáticamente con la creciente disponibilidad de varios tipos de vacunas2. Las respuestas inmunes protectoras adaptativas evocadas por la infección natural o la vacunación contribuyen a la prevención y la regulación antiviral. La inmunidad humoral y la inmunidad mediada por células se clasifican como inmunidad adaptativa, y la inducción de la primera siempre se ha considerado como una estrategia clave en el diseño de vacunas, aunque con una comprensión relativamente limitada en los últimos3. Sin embargo, el papel de la inmunidad mediada por células T en la limitación de la diseminación del flavivirus y la eliminación del virus se ha centrado cada vez más y se ha estudiado ampliamente4. Además, la inmunidad de las células T no solo es indispensable en las respuestas antivirales específicas del JEV, sino que también desempeña un papel destacado en la protección cruzada contra la infección secundaria con flavivirus heterólogos, lo que se ha demostrado en estudios previos5. Se especula que este efecto puede pasar por alto los posibles efectos de mejora mediados por anticuerpos en la infección5. Cabe destacar que tal inmunidad de células T de reacción cruzada es importante, especialmente en ausencia de vacunas y medicamentos antivirales contra los flavivirus. Aunque se han realizado muchos estudios para determinar la contribución de las células T en la infección por JEV con respecto a las células T CD4+ y CD8+ 6,7, los respectivos linajes secretores de citoquinas y su diversificación funcional permanecen indeterminados, lo que significa que la elucidación de las funciones exactas de las células T auxiliares y asesinas se ve obstaculizada.
La escala de sus defensas antivirales determina la calidad de las respuestas de las células T. Las células T CD4+ o CD8+ que pueden conferir de manera compatible dos o más funciones, incluida la secreción de citoquinas y la desgranulación, se caracterizan como células Tpolifuncionales (T PF) tras la estimulación específica a nivel de una sola célula8. Las células T CD4+ que producen citoquinas únicas o múltiples pueden tener varios efectos y memorias inmunitarias. Por ejemplo, las células T IL-2+ IFN-γ+ CD4+ tienen más probabilidades de formar una respuesta protectora efectiva a largo plazoque las células T IL-2+ CD4+ 9, que pueden usarse como un parámetro importante para evaluar el efecto de la vacunación. La frecuencia de IL-2+ IFN-γ+ linfocitos T CD4+ aumenta en pacientes con no progresión a largo plazo del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), mientras que los linfocitos T CD4+ en pacientes con progresión del SIDA son más propensos a producir IFN-γ solo debido al efecto promotor de IL-2 sobre la proliferación de linfocitos T10. Además, se demostró que un subconjunto de IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ sobrevive a largo plazo in vivo y promueve sinérgicamente la función de matar11. Aunque las células T CD8+ tienen más probabilidades de exhibir actividad citotóxica, algunas células T CD4+ también están equipadas con actividad citotóxica como expresión detectada indirectamente de moléculas CD107a de superficie12. Además, ciertos subconjuntos de células T expresan la quimiocina MIP-1α, que a menudo es secretada por monocitos para participar en el reclutamiento de neutrófilos mediado por células T13. Del mismo modo, CD8 + TPFs también se puede utilizar para caracterizar la versatilidad de los marcadores anteriores. Los estudios han demostrado que la estrategia prime-boost puede inducir eficazmente un período prolongado de efectos protectores de TPF 13, lo que puede mejorar la protección provocada por la vacunación. Una característica central en el examen del sistema inmune es la capacidad de las células T de memoria para facilitar respuestas más fuertes, más rápidas y más efectivas a los desafíos virales secundarios que las células T ingenuas. Las células T de memoria efectora (TEM) y las células T de memoria central (TCM) son subconjuntos importantes de células T que a menudo se diferencian por la expresión compuesta de CD27/CD45RO o CCR7/CD45RA14. LaCM T (CD27+ CD45RO+ o CCR7+ CD45RA-) tiende a localizarse en tejidos linfoides secundarios, mientras que laEM T (CD27- CD45RO+ o CCR7– CD45RA–) se localiza en tejidos linfoides y periféricos 15,16. LaEM T proporciona una defensa inmediata pero no sostenida, mientras quela CM T sostiene la respuesta proliferando en los órganos linfoides secundarios y generando nuevos efectores17. Por lo tanto, dado que las células de memoria pueden mediar respuestas de recuerdo específicas y eficientes a los virus, surgen preguntas sobre la contribución de este subconjunto de polifunciones.
Con el desarrollo de la tecnología de citometría de flujo, se ha vuelto común detectar simultáneamente marcadores de más de 10 grupos, fenotipos y antígenos de diferenciación, lo que es beneficioso para anotar más abundantemente las características inmunológicas funcionales en las células T individuales para reducir la mala interpretación y las dificultades en la comprensión de los fenotipos de células T. Este estudio utilizó estimulación ex vivo y citometría de flujo para analizar los perfiles de TPF en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en niños vacunados con JEV. Aplicando este enfoque, se ampliará la comprensión de la inmunidad de células T específica de JEV e incluso de reacción cruzada a corto y largo plazo inducida por la vacunación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo representa un método de detección factible basado en citometría de flujo para perfiles deT PF en las PBMC de niños vacunados con la vacuna JEV SA14-14-2. Este estudio utilizó las PBMC de sangre venosa de niños vacunados y no vacunados como materiales de investigación. Con la estimulación de PBMC con el antígeno JEV, esos antígenosT PFespecíficos amplificados pueden caracterizarse por tinción de anticuerpos de citometría de flujo multicolor. En comparación con el método …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.W. fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82002130), la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing de China (7222059). ZD.X. fue apoyado por el Fondo de Innovación CAMS para Ciencias Médicas (2019-I2M-5-026).
Materials
| anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
| anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
| APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
| BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
| BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
| BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
| BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
| BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
| Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
| FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
| Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |
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