유세포 분석 기술을 통한 일본 뇌염 백신 접종을받은 어린이의 다기능 T 세포 검출
Summary
본 프로토콜은 생체 외 자극과 유세포 분석을 결합하여 일본 뇌염 바이러스 (JEV) 예방 접종을받은 어린이 내의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 다기능성 T 세포 (TPF) 프로파일을 분석합니다. JEV 특이적 TPF의 검출 방법 및 유세포분석 색 구성표를 테스트하여 유사한 연구에 대한 참조를 제공했습니다.
Abstract
T 세포 매개 면역은 백신 접종 후 또는 자연 감염 후 플라 비 바이러스 감염을 조절하는 데 중요한 역할을합니다. T 세포의 “품질”은 기능에 의해 평가되어야 하며, 더 높은 기능은 더 강력한 면역 보호와 관련이 있습니다. 단일 세포 수준에서 2개 이상의 사이토카인 또는 케모카인을 동시에 생산할 수 있는 T 세포를 다기능성 T 세포(TPFs)라고 하며, 이는 탈과립 마커(CD107a)를 발현하고 인터페론(IFN)-γ, 종양 괴사 인자(TNF)-α, 인터루킨(IL)-2 또는 대식세포 염증 단백질(MIP)-1α를 분비하는 다양한 분자 메커니즘을 통해 면역 반응을 매개합니다. TPF가 장기 면역 기억 및 보호의 유지와 밀접한 관련이 있으며, 이들의 증가 된 비율이 보호 면역의 중요한 마커이며 바이러스 감염 및 재 활성화의 효과적인 제어에 중요하다는 증거가 증가하고 있습니다. 이 평가는 특정 면역 반응뿐만 아니라 교차 반응 면역 반응의 평가에도 적용됩니다. 여기서, 일본뇌염 바이러스(JEV)를 예로 들면, 일본뇌염 백신접종을 받은 소아의 말초혈액단핵세포에서 생성되는 JEV 특이적TFs의 검출방법 및 유세포분석 색도를 시험하여 유사한 연구에 대한 참고자료를 제공하였다.
Introduction
일본 뇌염 바이러스 (JEV)는 Flaviviridae 가족1 내의 Flavivirus 속에 속하는 중요한 모기 매개 바이러스입니다. 많은 아시아 태평양 국가들은 일본뇌염(JE)으로 인한 막대한 질병 부담으로 인해 오랫동안 엄청난 공중 보건 문제에 직면해 왔지만 다양한 유형의 예방 접종의 가용성이 증가함에 따라 극적으로 개선되었습니다2. 자연 감염 또는 백신 접종에 의해 유발되는 적응 형 보호 면역 반응은 예방 및 항 바이러스 조절에 기여합니다. 체액 성 면역과 세포 매개 면역은 적응 면역으로 분류되며, 전자의 유도는 과거3에서 상대적으로 제한된 이해에도 불구하고 항상 백신 설계의 핵심 전략으로 간주되어 왔습니다. 그러나, 플라비바이러스 전파 및 바이러스 제거를 제한하는 T 세포 매개 면역의 역할은 점점 더 집중되고광범위하게 연구되고 있다4. 또한, T 세포 면역은 JEV 특이적 항바이러스 반응에 필수적일 뿐만 아니라이전 연구에서 입증된 이종 플라비바이러스의 2차 감염으로부터 교차 보호에 중요한 역할을 합니다5. 이 효과는 감염5에서 잠재적인 항체 매개 향상 효과를 우회할 수 있다고 추측됩니다. 참고로, 이러한 교차 반응성 T 세포 면역은 특히 플라비바이러스에 대한 백신 및 항바이러스 약물의 부재 하에서 중요하다. CD4+ 및 CD8+ T 세포6,7에 대한 JEV 감염에서 T 세포의 기여도를 결정하기 위해 많은 연구가 수행되었지만, 사이토카인을 분비하는 각각의 계통과 그 기능적 다양화는 아직 결정되지 않아 도우미 및 킬러 T 세포의 정확한 기능에 대한 해명이 방해를 받습니다.
항 바이러스 방어의 규모는 T 세포 반응의 질을 결정합니다. 사이토카인 분비 및 탈과립을 포함하는, 둘 이상의 기능을 양립가능하게 부여할 수 있는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포는 단일-세포 수준8에서 특이적 자극시 다기능성 T 세포(TPFs)로서 특성화된다. 단일 또는 다중 사이토카인을 생성하는 CD4+ T 세포는 다양한 효과와 면역 기억을 가질 수 있습니다. 예를 들어, IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T 세포는 백신접종 효과를 평가하는데 중요한 파라미터로서 사용될 수 있는 IL-2+ CD4+ T 세포9보다 장기간 효과적인 보호 반응을 형성할 가능성이 더 높다. IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T 세포의 빈도는 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS)의 장기간 비진행 환자에서 증가하는 반면, AIDS 진행 환자의 CD4+ T 세포는 T 세포 증식에 대한 IL-2의 촉진 효과로 인해 IFN-γ 단독으로 생성하는 경향이 더 큽니다10. 또한, IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+의 서브세트는 생체내에서 장기간 생존하고 상승적으로 살상 기능을 촉진하는 것으로 나타났다11. CD8+ T 세포가 세포독성 활성을 나타낼 가능성이 더 높지만, 일부 CD4+ T 세포는 또한 표면 CD107a 분자(12)의 간접적으로 검출된 발현으로서 세포독성 활성을 갖는다. 또한, 특정 T 세포 하위세트는 케모카인 MIP-1α를 발현하며, 이는 종종 T 세포-매개 호중구 모집에 참여하기 위해 단핵구에 의해 분비된다13. 유사하게, CD8+ TPFs는 또한 상기 마커의 다기능성을 특성화하는데 사용될 수 있다. 연구에 따르면 프라임 부스트 전략은 장기간 TPF 보호 효과13를 효과적으로 유도 할 수 있으며, 이는 백신 접종에 의해 유도 된 보호를 향상시킬 수 있습니다. 면역 체계를 검사하는 핵심 기능은 순진한 T 세포보다 2차 바이러스 문제에 대해 더 강력하고 빠르며 효과적인 반응을 촉진하는 기억 T 세포의 능력입니다. 이펙터 기억 T 세포 (TEM) 및 중앙 기억 T 세포 (TCM)는 CD27/CD45RO 또는 CCR7/CD45RA14의 복합 발현에 의해 종종 분화되는 중요한 T 세포 하위세트이다. TCM (CD27+ CD45RO+ 또는 CCR7+ CD45RA-)은 2차 림프성 조직에 국한되는 경향이 있는 반면, TM (CD27-CD45RO+ 또는 CCR7-CD45RA–)은 림프성 및 말초 조직에 국한된다15,16. TEM은 즉각적이지만 지속적이지 않은 방어를 제공하는 반면,TCM은 2차 림프성 기관에서 증식하고 새로운 이펙터(17)를 생성함으로써 반응을 지속한다. 따라서, 기억 세포가 바이러스에 대한 구체적이고 효율적인 회상 반응을 매개할 수 있다는 것을 감안할 때, 이러한 다기능의 서브세트의 기여에 대한 질문이 제기된다.
유세포 분석 기술의 발달로 10 개 이상의 클러스터, 표현형 및 분화 항원의 마커를 동시에 검출하는 것이 보편화되었으며, 이는 개별 T 세포의 기능적 면역 학적 특징을보다 풍부하게 주석으로 달아 T 세포 표현형에 대한 오해와 이해의 어려움을 줄이는 데 도움이됩니다. 이 연구는 생체 외 자극 및 유세포 분석을 사용하여 JEV 백신 접종 어린이 내의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 TPF 프로파일을 분석했습니다. 이 접근법을 적용하면 백신 접종에 의해 유도 된 단기 및 장기 JEV 특이 적 및 심지어 교차 반응성 T 세포 면역에 대한 이해가 확대 될 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 JEV 백신 SA14-14-2로 백신을 접종한 어린이의 PBMC에서 TPF 프로파일에 대한 실현 가능한 유세포분석 기반 검출 방법을 나타냅니다. 이 연구는 예방 접종을받은 어린이와 예방 접종을받지 않은 어린이의 정맥혈 PBMC를 연구 자료로 사용했습니다. JEV 항원을 갖는 PBMCs의 자극과 함께, 이들 증폭된 항원-특이적 TPFs는 다색 유동 세포분석 항체 염색에 의해 특성화될 수 있다. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.W.는 중국 국립 자연 과학 재단 (82002130), 중국 베이징 자연 과학 재단 (7222059)의 지원을 받았습니다. ZD.X.는 CAMS 의료 과학 혁신 기금 (2019-I2M-5-026)의 지원을 받았습니다.
Materials
| anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
| anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
| APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
| BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
| BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
| BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
| BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
| BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
| Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
| FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
| Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |
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