Summary
הפרוטוקול הנוכחי משלב גירוי ex vivo וציטומטריה של זרימה כדי לנתח פרופילים של תאי T פוליפונקציונליים (T PF) בתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) בתוך ילדים שחוסנו בנגיף דלקת המוח היפנית (JEV). שיטת הזיהוי וסכמת הצבעים של ציטומטריה של TPFs ספציפיים ל- JEV נבדקו כדי לספק סימוכין למחקרים דומים.
Abstract
חסינות בתיווך תאי T ממלאת תפקיד חשוב בשליטה על זיהום בנגיף הפלבי, לאחר חיסון או לאחר הדבקה טבעית. יש להעריך את "איכותו" של תא T לפי תפקוד, ותפקוד גבוה יותר נקשר להגנה חזקה יותר על מערכת החיסון. תאי T שיכולים לייצר בו-זמנית שני ציטוקינים או כימוקינים או כימוקינים ברמת התא הבודד נקראים תאי T רב-תפקודיים (TPFs), אשר מתווכים תגובות חיסוניות באמצעות מגוון מנגנונים מולקולריים כדי לבטא סמני פירוק (CD107a) ולהפריש אינטרפרון (IFN)-γ, גורם נמק גידולי (TNF)-α, אינטרלוקין (IL)-2, או חלבון דלקתי מקרופאגים (MIP)-1α. ישנן עדויות הולכות וגוברות לכך ש- TPFs קשורים קשר הדוק לשמירה על זיכרון חיסוני לטווח ארוך והגנה וכי שיעורם המוגבר הוא סמן חשוב של חסינות מגן והוא חשוב בשליטה יעילה של זיהום ויראלי והפעלה מחדש. הערכה זו חלה לא רק על תגובות חיסוניות ספציפיות, אלא גם על הערכת תגובות חיסוניות צולבות. כאן, אם ניקח את נגיף דלקת המוח היפנית (JEV) כדוגמה, נבדקה שיטת הזיהוי וסכמת הצבעים הציטומטריה של TPFספציפי ל- JEV המיוצר על ידי תאי דם חד-גרעיניים היקפיים של ילדים שחוסנו נגד דלקת המוח היפנית כדי לספק התייחסות למחקרים דומים.
Introduction
נגיף דלקת המוח היפנית (JEV) הוא נגיף חשוב המועבר על ידי יתושים השייך לסוג Flavivirus בתוך משפחת Flaviviridae1. מדינות רבות באסיה-פסיפיק מתמודדות זה זמן רב עם אתגרים עצומים בבריאות הציבור בשל נטל התחלואה העצום הנגרם על ידי דלקת המוח היפנית (JE), אך זה השתפר באופן דרמטי עם הזמינות הגוברת של סוגים שונים של חיסונים2. תגובות חיסוניות הגנתיות נרכשות המעוררות על ידי זיהום טבעי או חיסון תורמות למניעה ולוויסות אנטי-ויראלי. חסינות הומורלית וחסינות תאית מסווגות כחסינות מסתגלת, והאינדוקציה של הראשונה תמיד נחשבה לאסטרטגיה מרכזית בתכנון חיסונים, אם כי עם הבנה מוגבלת יחסית ב-3 האחרונים. עם זאת, התפקיד של חסינות בתיווך תאי T בהגבלת הפצת נגיף הפלבי וסילוק הנגיף התמקד יותר ויותר ונחקר בהרחבה4. יתר על כן, חסינות תאי T היא לא רק הכרחית בתגובות אנטי-ויראליות ספציפיות ל-JEV, אלא גם ממלאת תפקיד בולט בהגנה צולבת מפני זיהום משני בנגיפי פלבי הטרולוגיים, שהוכח במחקרים קודמים5. משערים כי השפעה זו עשויה לעקוף השפעות שיפור פוטנציאליות בתיווך נוגדנים בזיהום5. יש לציין כי חסינות תאי T צולבת כזו חשובה, במיוחד בהיעדר חיסונים ותרופות אנטי-ויראליות נגד נגיפי פלבי. למרות שמחקרים רבים בוצעו כדי לקבוע את התרומה של תאי T בזיהום JEV ביחס לתאי CD4+ ו- CD8+ T6,7, השושלות המתאימות המפרישות ציטוקינים והגיוון התפקודי שלהם נותרו בלתי מוגדרות, כלומר הבהרת הפונקציות המדויקות של תאי T מסייעים והורגים מתעכבת.
קנה המידה של ההגנות האנטי-ויראליות שלהם קובע את איכות התגובות של תאי T. תאי CD4+ או CD8+ T שיכולים להעניק באופן תואם שתי פונקציות או יותר, כולל הפרשת ציטוקינים ודה-גרנולציה, מאופיינים כתאי T רב-תכליתיים (TPFs) על גירוי ספציפי ברמת התא הבודד8. לתאי CD4+ T המייצרים ציטוקינים בודדים או מרובים עשויות להיות השפעות שונות וזיכרונות חיסוניים. לדוגמה, תאי IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T נוטים יותר ליצור תגובת הגנה יעילה לטווח ארוך מאשר תאי IL-2+ CD4+ T9, שיכולים לשמש כפרמטר חשוב בהערכת אפקט החיסון. התדירות של IL-2+ IFN-γ+ CD4+ תאי T מוגברת בחולים עם אי-התקדמות ארוכת טווח של תסמונת מחסור חיסוני נרכש (איידס), בעוד שתאי CD4+ T בחולים עם התקדמות איידס נוטים יותר לייצר IFN-γ בלבד בשל ההשפעה המקדמת של IL-2 על התפשטות תאי T10. יתר על כן, תת-קבוצה של IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ הוכחה כשורדה לטווח ארוך in vivo ומקדמת בסינרגיה את פונקציית ההרג11. למרות שתאי CD8+ T נוטים יותר להפגין פעילות ציטוטוקסית, חלק מתאי CD4+ T מצוידים גם בפעילות ציטוטוקסית כביטוי שזוהה בעקיפין של מולקולות CD107a על פני השטח12. בנוסף, תת-קבוצות מסוימות של תאי T מבטאות את הכימוקין MIP-1α, שלעתים קרובות מופרש על ידי מונוציטים כדי להשתתף בגיוס נויטרופילים בתיווך תאי T13. באופן דומה, CD8+ TPFs יכול לשמש גם כדי לאפיין את הרבגוניות של הסמנים לעיל. מחקרים הראו כי אסטרטגיית הדחיפה הראשונית יכולה לגרום ביעילות לתקופה ממושכת של השפעות מגןT PF 13, אשר יכול לשפר את ההגנה שמעורר החיסון. מאפיין מרכזי בבחינת מערכת החיסון הוא היכולת של תאי זיכרון מסוג T לאפשר תגובות חזקות, מהירות ויעילות יותר לאתגרים נגיפיים משניים מאשר תאי T נאיביים. תאי T של זיכרון אפקטים (TEM) ותאי זיכרון T מרכזיים (TCM) הם תת-קבוצות חשובות של תאי T שלעתים קרובות מתמיינות על ידי הביטוי המורכב של CD27/CD45RO או CCR7/CD45RA14. TCM (CD27+ CD45RO+ או CCR7+ CD45RA-) נוטה להתמקם ברקמות לימפה משניות, בעוד ש- TEM (CD27- CD45RO+ או CCR7- CD45RA-) מתמקם ברקמות לימפואידיות והיקפיות15,16. TEM מספק הגנה מיידית אך לא מתמשכת, ואילו TCM מקיים את התגובה על ידי שגשוג באיברי הלימפה המשניים ויצירת אפקטים חדשים17. לפיכך, בהתחשב בכך שתאי זיכרון יכולים לתווך תגובות היזכרות ספציפיות ויעילות לווירוסים, מתעוררות שאלות לגבי תרומתה של תת-קבוצה זו של פוליפונקציות.
עם התפתחות טכנולוגיית ציטומטריה של זרימה, זה הפך נפוץ לזהות בו זמנית סמנים של יותר מ -10 אשכולות, פנוטיפים ואנטיגנים התמיינות, אשר מועיל לבאר בשפע רב יותר את התכונות החיסוניות הפונקציונליות על תאי T בודדים כדי להפחית פרשנות שגויה וקשיים בהבנה של פנוטיפים של תאי T. מחקר זה השתמש בגירוי ex vivo ובציטומטריית זרימה כדי לנתח פרופיליT PF בתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) בקרב ילדים שחוסנו ב-JEV. ביישום גישה זו, תורחב ההבנה של חסינות תאי T ספציפיים ל-JEV לטווח קצר וארוך ואף צולבת הנגרמת על ידי חיסון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אישור אתי למחקר הנוכחי התקבל על ידי ועדת האתיקה של בית החולים לילדים בבייג'ינג, האוניברסיטה הרפואית קפיטל (מספר אישור: 2020-k-85). מתנדבים גויסו מבית החולים לילדים בבייג'ינג, האוניברסיטה הרפואית קפיטל. דגימות דם ורידי היקפי התקבלו מילדים בריאים לכאורה (בני שנתיים) שקיבלו בעבר חיסון ראשוני ומוגבר עם חיסון JE SA14-14-2 מוחלש במשך פחות מחצי שנה (ילדים מחוסנים ב-JE, n = 5) וילדים לא מחוסנים (6 חודשים, n = 5). הסכמה מדעת של נבדקים אנושיים ויתרה מכיוון שרק שאריות הדגימות, לאחר שנבדקו קלינית, שימשו במחקר זה. כדי להגן על פרטיות המתנדבים, כל הנתונים עברו אנונימיזציה מלאה וביטול זיהוי.
1. בידוד של PBMCs מדם ורידי היקפי
- איסוף דגימות דם ורידי היקפי (2 מ"ל) מילדים מחוסני JE ולא מחוסנים בצינורות נוגדי קרישהEDTA-K 2 (ראו טבלת חומרים) בטכניקת הדיקור הוורידי הסטנדרטית18.
- יש להוסיף 2 מ"ל של תמיסת מלח עם אגירת פוספטים (1x PBS) כדי לדלל את הדם ההיקפי.
הערה: התהליך מטופל בהקדם האפשרי כדי לשמור על שרידות מרבית. - הוסף 4 מ"ל של מדיום שיפוע הצפיפות (ראה טבלת חומרים) לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, והעבר באיטיות את הדם המדולל לשכבה העליונה של מדיום ההפרדה.
הערה: אין לערבב את הדם עם מדיום ההפרדה או להרוס את משטח המגע שנוצר על ידי שני הנוזלים; אחרת, אפקט ההפרדה לא יושג. - צנטריפוגה ב 800 × גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שימו לב לשכבות המשמעותיות לאחר הצנטריפוגה.
- העבירו את ה-PBMCs (השכבה האמצעית) לצינור צנטריפוגות נוסף של 15 מ"ל, ושטפו את ה-PBMCs ב-10 מ"ל של מדיום RPMI-1640 המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS, ראו טבלת חומרים).
- צנטריפוגה ב 800 × גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant עם פיפטה בזהירות.
- השהה את ה- PBMCs עם 1 מ"ל של מדיום RPMI-1640 המכיל 10% FBS וספור את התאים באמצעות מונה אוטומטי מבוסס טריפן כחול (ראה טבלת חומרים).
2. גירוי של PBMCs על ידי חלקיקי JEV מומתים כדי לגרום לביטוי ציטוקינים
- הגדר שתי תת-קבוצות של קבוצות הגירוי והביקורת של JEV בדגימות המחוסנות ב-JE ובדגימות הלא מחוסנות, בהתאמה.
- התאם את מספר ה- PBMCs ל- 2 × 10 6 תאים למ"ל עם מדיום RPMI-1640 המכיל 10% FBS, וזרע את ה- PBMCs בלוחות של 24 בארות (2 × 106 תאים / 1 מ"ל בינוני לכל באר); לחסן שלוש בארות לכל קבוצה.
- לעורר את ה-PBMCs של קבוצת הגירוי JEV עם חלקיקי JEV מומתים מרוכזים5 (2 × 105 PFU) במשך 16 שעות ב-37 מעלות צלזיוס בנוכחות נוגדנים חד-שבטיים CD28 (1 מיקרוגרם/מ"ל, 1:1,000) ו-CD49d (1 מיקרוגרם/מ"ל), GolgiPlug (1 מיקרוגרם/מ"ל, 1:1,000) ומוננסין (1 מיקרוגרם/מ"ל, 1:1,000). לצביעת משטחים, יש להשתמש ב-BV605-anti-CD107a (1 מיקרוגרם/מ"ל, 1:1,000) (ראו טבלת חומרים).
הערה: ה- JEV הושבת על ידי קרינת UV כפי שתואר קודםלכן 19. - לעורר את ה-PBMCs של קבוצת הביקורת ללא חלקיקי נגיף מרוכזים במשך 16 שעות ב-37 מעלות צלזיוס בנוכחות נוגדנים חד-שבטיים CD28 (1 מיקרוגרם/מ"ל, 1:1,000) ו-CD49d (1 מיקרוגרם/מ"ל, 1:1,000), GolgiPlug (1 מיקרוגרם/מ"ל, 1:1,000) ומונסין (1 מיקרוגרם/מ"ל, 1:1,000). הכתימו את המשטח ב-BV605-anti-CD107a (1 מיקרוגרם/מ"ל, 1:1,000).
3. מכתים תוך-תאיים Ex vivo
- לאסוף את מתלה התא מכל קבוצה בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל, צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר את supernatant עם פיפטה.
- החזירו את התאים ל-1 מ"ל של PBS אחד, הוסיפו צבע הניתן לתיקון (1 μL/mL, 1:1,000, ראו טבלת חומרים) לתלויית התא, ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. צנטריפוגה ב 500 × גרם (בטמפרטורת החדר) במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
- השהה את התאים ב-1 מ"ל של PBS אחד. צנטריפוגה ב-500 × גרם (בטמפרטורת החדר) למשך 5 דקות. השליכו בזהירות את הסופר-נטנט.
- ביצוע צביעת סמן פני התא.
- השהה את התאים ב- 100 μL של 1x PBS, והוסף 2 μL מכל נוגדן סמני פני שטח (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27 ו- BV480-anti-CD45RO, גורם דילול: 1:50, ראה טבלת חומרים) לתרחיף התא בכל צינור.
הערה: פרוטוקול צביעת נוגדנים פלואורסצנטיים בצבע מוצג בטבלה 1. - דגירה של הצינורות (שלב 3.4.1) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, והגנה עליהם מפני אור. צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
הערה: ניתן להחליף את הנוגדן של BUV737-anti-CD27 ו- BV480-anti-CD45RO ב- BUV737-anti-CCR7 ו- BV480-anti-CD45RA כביאור של תאי הזיכרון T.
- השהה את התאים ב- 100 μL של 1x PBS, והוסף 2 μL מכל נוגדן סמני פני שטח (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27 ו- BV480-anti-CD45RO, גורם דילול: 1:50, ראה טבלת חומרים) לתרחיף התא בכל צינור.
- השהה את התאים ב-1 מ"ל של PBS אחד. צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו בזהירות את הסופר-נטנט.
- בצע קיבוע ושבירת ממברנה.
- החזירו את התאים עם תמיסה מקובעת שוברת ממברנה בנפח 500 מיקרוגרם (ראו טבלת חומרים) וקבעו את התאים למשך 20 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
- השהה את התאים ב-1 מ"ל של PBS אחד. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 500 × גרם בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant בזהירות.
- ביצוע צביעת ציטוקינים תוך-תאיים.
- יש להשעות את התאים ב-100 μL של 1x PBS, ולהוסיף 2 μL מכל נוגדן ציטוקינים (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 ו-APC-anti-MIP-1α, גורם דילול: 1:50, ראה טבלת חומרים) לתרחיף התא בכל צינור.
הערה: הנפחים והמידע על נוגדנים מצומדים לפלואורופור מוצגים בטבלה 1. - לדגור על הצינורות (שלב 3.8.1) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
- יש להשעות את התאים ב-100 μL של 1x PBS, ולהוסיף 2 μL מכל נוגדן ציטוקינים (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 ו-APC-anti-MIP-1α, גורם דילול: 1:50, ראה טבלת חומרים) לתרחיף התא בכל צינור.
- השהה את התאים ב-1 מ"ל של PBS אחד. צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר את supernatant בזהירות. הוסף 500 μL של 1x PBS כדי להשעות את התאים.
4. הגדרת ציטומטריה של זרימה
- בודד את דגימת ה- PBMC לבדה בהתאם להליכים המתוארים בשלב 1 כדגימת הבקרה. חלק את מתלה התא ל -12 חלקים שווים בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל (100 μL / צינור) כפי שצוין להלן.
- הגדר מוכתם לא מוכתם, APC-Cy7-חי/מת מוכתם, BV650-anti-CD3 מוכתם יחיד, BUV395-anti-CD4 מוכתם יחיד, BV421-anti-CD8 מוכתם יחיד, BUV737-anti-CD27 מוכתם יחיד, BV480-anti-CD45RO מוכתם, BV605-anti-CD107a, FITC-anti-IFN-γ מוכתם, PE-anti-TNF-α מוכתם יחיד, BV785-anti-IL-2 מוכתם יחיד, ו- APC-anti-MIP-1α מוכתם יחיד.
- הוסף את סמני פני השטח של התא ואת מכתים הציטוקינים התוך-תאיים כמתואר בשלב 3. עבור כל דגימת צביעה בודדת, הוסיפו רק אחד מהפלואורופורים משלב ההכתמה. הוסף 500 μL של 1x PBS כדי להשעות את התאים ואת המערבולת במהירות נמוכה.
- באמצעות דגימה לא מוכתמת, התאם את הפיזור הקדמי (FSC), פיזור הצד (SSC) ומתחי צבע פלואורסצנטיים שונים.
הערה: עבור המחקר הנוכחי, נקבעו המתחים הבאים. FSC: 440 V, SSC: 233 V, BV650: 575 V, APC-Cy7: 449 V, BUV395: 500 V, BV421: 402 V, BUV737: 585 V, BV480: 444 V, BV605: 457 V, FITC: 475 V, PE: 469 V, APC: 623 V, ו- BV785: 725 V. - באמצעות דגימות צביעה בודדת, התאימו את פיצוי הציטומטריה של הזרימה כדי לחסל את אותות הזיהום בין הפלואורופורים השונים.
הערה: פרמטרי הפיצוי מוצגים בטבלה 2.
5. אסטרטגיית גטינג וניתוח נתונים
הערה: במחקר הנוכחי, לצורך ניתוח זה, תאי הזיכרון המרכזיים T (TCM של תאי CD8+ או CD4+ T כ-CD27+ CD45RO+ או CCR7+ CD45RA- ותאי הזיכרון המשפיעים (TEM) של תאי CD8+ או CD4+ T כ-CD27- CD45RO+ או CCR7- CD45RA - הוגדרו בהתאמה16.
- ציירו שער מצולע דרך חלקת הנקודה של אזור FSC (FSC-A)/SSC-area (SSC-A) כדי לבחור את אוכלוסיית הלימפוציטים השלמה תוך אי-הכללת הפסולת (איור 1A).
- צייר שער מלבני דרך מתווה הנקודה FSC-A/FSC-WIDTH (FSC-W) כדי לבחור את התאים הבודדים (איור 1B).
- ציירו שער מלבני דרך תרשים הנקודה החי/מת/SSC-A כדי לבחור את התאים החיים (איור 1C).
- ציירו שער מלבני דרך מתווה הנקודה CD3/SSC-A כדי לזהות את תאי ה-T של CD3+ (איור 1D).
- ציירו שער מרובע דרך מתווה הנקודה CD4/CD8 כדי לזהות את תאי ה-CD4+ או ה-CD8+ T (איור 1E).
- ציירו שער מרובע דרך מתווה הנקודה CD45RO/CD27 כדי לחלק את תאי ה-CD4+ או ה-CD8+ T ל-T CM (CD27+ CD45RO+) ול-TEM (CD27- CD45RO+) (איור 1F-I).
- צייר את השערים של CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 ו- MIP-1α מתאי TCM או TEM של תאי CD8+ או CD4+ T כדי לקבוע את התדירות של דפוסי תגובה שונים, בהתאמה.
- העמיסו את הדגימות על הציטומטריה ברצף. השתמש בשער עצירה20 כדי לרכוש 1 × 106 לימפוציטים.
הערה: המשתמש הבודד יכול לאסוף יותר מ- 1 × 106 תאים. מספר זה היווה פשרה בין הזמן שנדרש לבין איסוף של מספיק תאים כדי לספק תוצאות משמעותיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מראה את אסטרטגיית ה-gating המשמשת לחלוקת תאי ה-TCM או ה-TEM של תאי CD8+ או CD4+ T מקבוצת גירוי JEV מייצגת של ילדים מחוסני JE. עלילת הנקודה FSC-A/SSC-A משמשת לזיהוי לימפוציטים, ועלילת הנקודה FSC-A/FSC-W משמשת לזיהוי תאים בודדים. תאים בני קיימא נבחרים על עלילת הנקודה החיה/מתה/SSC-A. תרשים הנקודה CD3/SSC-A משמש לזיהוי תאי ה-T של CD3+. תרשים הנקודה CD4/CD8 משמש לזיהוי התאים CD3+ CD4+ ו- CD3+ CD8+ T, בהתאמה. תאי TCM (CD27+ CD45RO+) ו-TEM (CD27- CD45RO+) של תאי CD8+ או CD4+ T נבחרים בנפרד בתרשים הנקודה CD45RO/CD27. תאים עם הפנוטיפ של CD107a+, IL-2+, TNF-α+, IFN-γ+ ו-MIP-1α+ מ-CD8+ T CM (איור 1F), CD8+ T EM (איור 1G), CD4+ TCM (איור 1H) ו-CD4+ TEM (איור 1I) נבחרים בנפרד על-ידי ציור השער המלבני המתאים.
האפיון הרב-תפקודי של תגובות תאי CD4+ ו-CD8+ T מרכזיים ואפקטיביים (כולל דה-גרנולציה, ציטוקינים וכמוקינים) ל-JEV בילדים מחוסני JE ולא מחוסנים מוצג בטבלה 3. תוצאות אלה מצביעות על כך שרמות גבוהות יותר של CD107a, IFN-γ, TNF-α ו- IL-2 זוהו בתאי CD8+ TCM של הילדים המחוסנים לאחר גירוי JEV בהשוואה לאלה של ילדים לא מחוסנים. רמת MIP-1α לא הייתה שונה בין שתי הקבוצות. מאמינים כי לתאיT EM יש השפעה אנטי-ויראלית ישירות על רסטימולציה עם JEV. רמות גבוהות יותר של CD107a ו-IFN-γ זוהו בתאיCD8+ T EM של הקבוצה המחוסנת תחת גירוי JEV בהשוואה לקבוצה הלא מחוסנת. עם זאת, TNF-α, IL-2 ו-MIP-1α לא היו גבוהים באופן משמעותי בתאים חיוביים אלה.
האנטיגן JEV גרם בהצלחה לרמות גבוהות יותר של CD107a, IFN-γ, TNF-α ו-MIP-1α בתאיCD4+ T CM של הקבוצה המחוסנת בהשוואה לקבוצה הלא מחוסנת. עם זאת, חלקם של תאי IL-2+ לא היה שונה בין שתי הקבוצות תחת גירוי JEV. שיעור קבוצות המשנה CD107a+, IFN-γ+ ו-TNF-α+ של תאי CD4+ T EM בקבוצה המחוסנת היה גבוה יותר בנוכחות JEV מאשר בקבוצה הלא מחוסנת.
איור 1: המחשה של אסטרטגיית ה-gating לזיהוי ה-TCM אוה-T EM של תאי CD8+ או CD4+ T ותת-הקבוצות שלהם. (A) לימפוציטים זוהו באמצעות תרשים הנקודה FSC-A/SSC-A. (B) תאים בודדים זוהו באמצעות עלילת הנקודה FSC-A/FSC-W. (C) תאים חיים זוהו באמצעות עלילת הנקודה החיה/מתה/SSC-A. (D) תאי CD3+ T זוהו באמצעות תרשים הנקודה CD3/SSC-A. (E) CD3+ CD4+ T ו-CD3+ CD8+ תאי T זוהו באמצעות עלילת הנקודה CD4/CD8. (F) CD8+ TCM עם הפנוטיפ של CD107a+, IL-2+, TNF-α+, IFN-γ+, ו-MIP-1α+חולקו בנפרד. (G) CD8+ TEM עם חמשת הפנוטיפים חולקו בנפרד. (H) CD4+ TCM עם חמשת הפנוטיפים חולקו בנפרד. (I) CD4+ TEM עם חמשת הפנוטיפים חולקו בנפרד. המספרים בכל לוח מייצגים את אחוז התאים בשערים. קידוד הצבעים מייצג את תדירות המופע של התאים, כאשר אדום הוא התדר הגבוה ביותר וכחול הוא הנמוך ביותר. קיצורים: SSC-A = אזור פיזור צדדי; FSC-A = אזור פיזור קדימה; FSC-W = רוחב פיזור קדימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| מטרת נוגדנים | פלואורופור מצומד | המינון | שיבוט | איזוטיפ | קו לייזר עירור | אקס-מקס (ננומטר) | אם-מקס (ננומטר) |
| תקליטור3 | רי"ב 650 | 2 מיקרון | SK7 | עכבר IgG1, κ | ויולט | 407 | 650 |
| תקליטור4 | BUV395 | 2 מיקרון | SK3 | עכבר IgG1, κ | UV | 348 | 39 |
| תקליטור8 | BV421 | 2 מיקרון | SK1 | עכבר IgG1, κ | ויולט | 407 | 421 |
| CD27 | BUV737 | 2 מיקרון | L128 | עכבר IgG1, κ | UV | 350 | 737 |
| CD45RO | רי"ב 480 | 2 מיקרון | UCHL1 | עכבר IgG2a, κ | ויולט | 436 | 478 |
| CCR7 | BUV737 | 2 מיקרון | 3D12 | עכברוש IgG2a, κ | UV | 350 | 737 |
| CD45RA | רי"ב 480 | 2 מיקרון | HI100 | עכבר IgG2b, κ | ויולט | 436 | 478 |
| CD107a | BV605 | 2 מיקרון | H4A3 | עכבר IgG1, κ | ויולט | 407 | 602 |
| IL-2 | רי"ב 785 | 2 מיקרון | MQ1-17H12 | עכברוש IgG2a, κ | ויולט | 407 | 786 |
| IFN-γ | FITC | 2 מיקרון | 4. ב3 | עכבר IgG1, κ | כחול | 494 | 520 |
| TNF-α | PE | 2 מיקרון | MAb11 | עכבר IgG1, κ | צהוב-ירוק | 496, 564 | 578 |
| MIP-1α | נגמ"ש | 2 מיקרון | 11א3 | עכבר IgG2a, κ | אדום | 650 | 660 |
| זומבי ניר | APC-Cy7 | 1 מיקרון | - | - | אדום | 650 | 779 |
טבלה 1: פרוטוקול צביעת נוגדנים פלואורסצנטיים בצבע לניתוחים ציטומטריים של זרימה. קיצורים: BV = סגול מבריק; BUV = אולטרה סגול מבריק; FITC = פלואורסצין איזותיוציאנט; PE = פיקואריתרין; APC = אלופיקוציאנין.
| התייחסות לפיצוי של ציטומטריה של זרימה (%) | ||||||||||||
| FITC | נגמ"ש | APC-Cy7 | BV421 | רי"ב 480 | BV605 | רי"ב 560 | רי"ב 785 | BUV395 | BUV737 | PE | ||
| FITC | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| נגמ"ש | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| APC-Cy7 | 0 | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 65 | 0 | 44 | 0 | |
| BV421 | 0 | 0.6 | 0 | 100 | 10.5 | 3 | 15 | 3 | 0.4 | 0 | 0 | |
| רי"ב 480 | 3 | 0 | 0 | 46 | 100 | 19 | 0 | 6.1 | 0 | 0 | 0 | |
| BV605 | 0 | 0 | 0 | 3.6 | 0 | 100 | 94 | 10 | 0 | 9 | 14 | |
| רי"ב 560 | 0 | 5.5001 | 0 | 2 | 1 | 7.1 | 100 | 9 | 0 | 10 | 0 | |
| רי"ב 785 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 | 30 | 0 | |
| BUV395 | 0 | 0 | 0 | 1.7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 | 0 | |
| BUV737 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3.7001 | 3 | 100 | 0 | |
| PE | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | |
טבלה 2: הפרמטרים של פיצוי עבור ניתוחים ציטומטריים של זרימה. קיצורים: BV = סגול מבריק; BUV = אולטרה סגול מבריק; FITC = פלואורסצין איזותיוציאנט; PE = פיקואריתרין; APC = אלופיקוציאנין.
| קבוצה של TPF | אפיון רב תכליתי (%) | |||||||
| גירוי | CD107a | IFN-γ | TNF-α | IL-2 | MIP-1α | |||
| CD8+ תאי T | טס"מ | מחוסנים | ג'ייב | 1.50±0.48 | 1.60±0.69 | 0.66±0.32 | 0.54±0.27 | 0.16±0.11 |
| Ctrl | 0.51±0.38 | 0.31±0.13 | 0.28±0.13 | 0.37±0.20 | 0.02±0.05 | |||
| לא מחוסנים | ג'ייב | 0.38±0.19 | 0.20±0.03 | 0.19±0.09 | 0.16±0.04 | 0.19±0.09 | ||
| Ctrl | 0.50±0.28 | 0.27±0.09 | 0.19±0.05 | 0.23±0.14 | 0.08±0.11 | |||
| ערך P* | - | 0.00 | 0.00 | 0.02 | 0.01 | 0.70 | ||
| טיאם | מחוסנים | ג'ייב | 1.47±0.58 | 1.21±0.22 | 0.49±0.36 | 0.33±0.31 | 0.24±0.17 | |
| Ctrl | 0.82±0.48 | 0.39±0.15 | 0.16±0.18 | 0.23±0.256 | 0.09±0.21 | |||
| לא מחוסנים | ג'ייב | 0.41±0.25 | 0.14±0.09 | 0.15±0.11 | 0.20±0.07 | 0.15±0.13 | ||
| Ctrl | 0.34±0.13 | 0.21±0.15 | 0.17±0.10 | 0.19±0.19 | 0.01±0.02 | |||
| ערך P* | - | 0.01 | 0.00 | 0.08 | 0.13 | 0.36 | ||
| תאי T של CD4+ | טס"מ | מחוסנים | ג'ייב | 1.55±0.43 | 1.16±0.24 | 0.57±0.25 | 0.29±0.18 | 0.19±0.07 |
| Ctrl | 0.44±0.27 | 0.26±0.20 | 0.15±0.06 | 0.12±0.06 | 0.04±0.07 | |||
| לא מחוסנים | ג'ייב | 0.28±0.08 | 0.21±0.08 | 0.17±0.03 | 0.21±0.16 | 0.10±0.03 | ||
| Ctrl | 0.31±0.13 | 0.26±0.06 | 0.14±0.04 | 0.25±0.13 | 0.04±0.04 | |||
| ערך P* | - | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.47 | 0.04 | ||
| טיאם | מחוסנים | ג'ייב | 1.54±0.58 | 1.33±0.15 | 0.89±0.25 | 0.37±0.22 | 0.21±0.05 | |
| Ctrl | 0.46±0.49 | 0.35±0.30 | 0.13±0.08 | 0.14±0.09 | 0.05±0.11 | |||
| לא מחוסנים | ג'ייב | 0.27±0.09 | 0.23±0.10 | 0.30±0.15 | 0.23±0.03 | 0.14±0.06 | ||
| Ctrl | 0.35±0.21 | 0.24±0.14 | 0.19±0.20 | 0.25±0.08 | 0.05±0.07 | |||
| ערך P* | - | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.19 | 0.08 | ||
| * מבחן U של מאן-וויטני, PBMCs מאדם מחוסן מגורה על ידי JEV לעומת. PBMCs מאדם לא מחוסן שעורר על ידי JEV הודגמו רק. | ||||||||
טבלה 3: אפיון רב-תכליתי של תגובות תאי TCM ו-TEM של CD4+ או CD8+ T ל-JEV. מחוסנים, n = 5; לא מחוסנים, n = 5. התוצאות מבוטאות כממוצע ± SD. P < 0.05 הצביע על הבדל משמעותי. * PBMCs מאנשים מחוסנים המגורה על ידי JEV לעומת PBMCs מאנשים לא מחוסנים המגורה על ידי JEV בלבד מוצגים. קיצורים: TPFs = תאי T רב-תכליתיים; IFN-γ = אינטרפרון-γ; TNF-α = גורם נמק גידולי-α; IL-2 = אינטרלוקין-2; MIP-1α = מקרופאג חלבון דלקתי-1α; TCM = תאי זיכרון מרכזיים T; TEM = תאי זיכרון T משפיעים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מייצג שיטת זיהוי אפשרית מבוססת ציטומטריה של זרימה עבור פרופיליT PF ב- PBMCs של ילדים שחוסנו בחיסון JEV SA14-14-2. מחקר זה השתמש ב-PBMCs בדם ורידי של ילדים מחוסנים ולא מחוסנים כאחד כחומרי מחקר. עם הגירוי של PBMCs עם אנטיגן JEV, אלה אנטיגן מוגבר ספציפי TPFs יכול להיות מאופיין על ידי כתמים ציטומטריה זרימה צבעונית. בהשוואה לשיטת הבדיקה הקונבנציונלית של ציטומטריה הקשורה לאנזימים, היתרון הבולט של ציטומטריית זרימה הוא הצגת התכונות הפונקציונליות של PBMCs ברמת התא הבודד בצורה מגוונת ככל האפשר, תוך הפחתת מספר ה- PBMCs הנדרשים לאיתור, המתאים במיוחד לילדים.
היסטוריית חיסונים ברורה, חיוניות התא הנשמרת, האימונוגניות של תאי ה-T של הממריץ ואסטרטגיות התאמת צבעים תואמות הם שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. סין שילבה את החיסון של JEV SA14-14-2 בתוכנית החיסונים המורחבת הלאומית מאז 2008 וכללה את היסטוריית החיסונים בניהול מאוחד, שהפך לזמין לנגישות היסטוריית החיסונים3. ה-PBMCs שנבדקו בפרוטוקול זה הוחזקו באופן ניסיוני על קרח כדי לשמור על כדאיות מקסימלית של התא. השימוש בגירויים ספציפיים הוכח בעבר באופן נרחב כיעיל 4,5,21,22. אסטרטגיית התאמת הצבעים היא האילוץ העיקרי בשיטה זו, והשימושיות של אסטרטגיה זו הוצגה בעידון רציף לפני הבדיקה והתאמת פרמטרים של מכשירים. בנוסף, פרוטוקול זה סיפק שתי אפשרויות לביאור תאי הזיכרון T. באמצעות התצורה לעיל ואופטימיזציה של הפרמטרים הניסוייים, זה עשוי להיות בר השגה למדוד חסינות ספציפית ואפילו תגובתית צולבת על ידי הערכת קנה המידה והתדירות של תגובותT PF לחיסון על ידי ציטומטריה זרימה. עם זאת, חמשת האינדיקטורים המייצגים לאפיון TPFs הם מגבלה של מחקר זה; ניתן להרחיב את המולקולות הפונקציונליות הנפוצות כיום (CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 ו- MIP-1α) כדי לזהות את הספקטרום על מנת לאפיין באופן מלא יותר את הרבגוניות של TPFs בהתבסס על הפרוטוקול המוצג.
זיהום JEV נחשב למחלה הניתנת למניעה על ידי חיסון, שבה תגובות תאי T של זיכרון מעורר חיסון עשויות להיות קריטיות בשמירה על הגנה חיסונית ארוכת טווח, במיוחד כאשר תגובות הנוגדנים דועכות עם הזמן4. כמרכיב המגן הטוטיפוטנטי העיקרי בתאי זיכרון T, יש להציע את TPFs כפריט בדיקה שגרתי להערכת יעילות החיסון, ולהפך, להנחות את התכנון והפיתוח של חיסוני תאי T ממוקדים. למעשה, התפקיד של חסינות תאי T בבקרת זיהום flavivirus הופך יותר ויותר מוערך, וזה יכול אפילו לעקוף את התפקיד של נוגדנים לטוב או לרע5. ההבהרה של פרופילT PF ללא ספק תצמצם עוד יותר את הרפרטואר של אפיטופים אנטיגניים, אשר חייב להפחית את עלות החיסונים על ידי שיפור המיקוד. ההשפעות הסינרגטיות של תאי CD4+ ו-CD8+ T משלימות זו את זו וללא ספק בולטות יותר ב-TPFs. לפיכך, מוצע כי מחקרים על TPFs יתמקדו ב- (1) הבדלי פרופיל בין TPFs לטווח ארוך וקצר; (2) זיהוי אפיטופיםT PF המוגבלים על ידי HLA; ו-(3) חקירה ומחקר של תת-אוכלוסיות רב-תכליתיות יותר.
זיהוי תאיT PF בבקרה החיסונית של זיהום נגיפי דווח על23,24,25. עם זאת, התיאור של אסטרטגיית הזיהוי המלאה והתהליך של TPFs לא היה מאורגן היטב. יתר על כן, ערכת הצבעים של שיטה זו חלה על מודלים מרובים של ציטומטר זרימה. הסמנים עשויים גם להיות מותאמים כדי לזהות תת-קבוצות פונקציונליות אחרות המבוססות על התאמת צבע זו.
מחקר זה סיפק אסטרטגיית זיהוי T PF על ידי שילוב של גירוי ספציפי ex vivo וציטומטריה של זרימה כדי לנתח פרופילים של תת-קבוצותT PF ב- PBMCs של מקבלי חיסון JEV. ה-PBMCs המבודדים היו מגורה תחילה עם האנטיגן JEV ולאחר מכן הוכתמו בנוגדנים המתאימים המסומנים בפלואורסצנטיות, וזיכרון CD4+ ו-CD8+ ספציפי ל-JEV TPFs התאפיינו בציטומטריית זרימה. בהתבסס על תוצאה זו, ניתן לחשב עוד יותר את תדריT PF של פונקציות כפולות, משולשות, מרובעות וחמישיות כדי לתאר את TPFs בפירוט רב יותר ובאופן מקיף יותר. נפחי דם ורידיים שגרתיים (2 מ"ל) בילדים הוכחו כמספיקים למחקריT PF. לכן, שיטות הזיהוי של TPFs ספציפיות לנגיף צפויות לשמש לבחינת מדדים של חסינות מסתגלת בתיווך תאי T הקשורים לחיסון או לזיהום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
R.W. נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82002130), קרן בייג'ינג למדעי הטבע של סין (7222059). ZD.X. נתמך על ידי קרן החדשנות CAMS למדעי הרפואה (2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
| anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
| APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
| BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
| BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
| BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
| BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
| BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
| Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
| FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
| Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |
References
- Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity. Pathogens. 11 (3), 317 (2022).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).
- Wang, R., et al. Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children. Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).
- Wang, R., et al. Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).
- Wang, R., et al. T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).
- Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).
- Jain, N., et al. CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).
- Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines. NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).
- Weaver, J. M., et al. Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza. PloS One. 8 (-), 57275 (2013).
- Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection. Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).
- Gui, L., et al. IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells. Cytokine. 84, 37-46 (2016).
- Terahara, K., et al. Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection. Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).
- Tanyi, J. L., et al. Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer. NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).
- Ammirati, E., et al. Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models. Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).
- Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study. Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).
- Zhang, Y., et al. Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion. Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).
- Shin, H., Iwasaki, A.
- Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents. Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).
- Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system. Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Zheng, X., et al. Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).
- Zheng, X., et al. Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China. Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19. Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).
- Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins. Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).
