Påvisning af polyfunktionelle T-celler hos børn vaccineret med japansk encephalitisvaccine via flowcytometriteknikken

Summary

Den nuværende protokol kombinerer ex vivo-stimulering og flowcytometri til analyse af polyfunktionelle T-celleprofiler (T_PF) i mononukleære celler (PBMC’er) i perifert blod mononukleære celler (PBMC’er) hos japanske encephalitisvirus (JEV)-vaccinerede børn. Detektionsmetoden og flowcytometrifarveskemaet for JEV-specifikke TPF’er blev testet for at give en reference til lignende undersøgelser.

Abstract

T-cellemedieret immunitet spiller en vigtig rolle i bekæmpelsen af flavivirusinfektion, enten efter vaccination eller efter naturlig infektion. “Kvaliteten” af en T-celle skal vurderes efter funktion, og højere funktion er forbundet med mere kraftfuld immunbeskyttelse. T-celler, der samtidig kan producere to eller flere cytokiner eller kemokiner på enkeltcelleniveau, kaldes polyfunktionelle T-celler (T_PF’er), som medierer immunresponser gennem en række molekylære mekanismer til at udtrykke degranulationsmarkører (CD107a) og udskille interferon (IFN)-γ, tumornekrosefaktor (TNF)-α, interleukin (IL)-2 eller makrofaginflammatorisk protein (MIP)-1α. Der er stigende tegn på, at T_PFer tæt forbundet med opretholdelsen af langvarig immunhukommelse og beskyttelse, og at deres øgede andel er en vigtig markør for beskyttende immunitet og er vigtig for effektiv kontrol af virusinfektion og reaktivering. Denne evaluering gælder ikke kun for specifikke immunresponser, men også for vurderingen af krydsreaktive immunresponser. Her, idet man tog den japanske encephalitisvirus (JEV) som et eksempel, blev detektionsmetoden og flowcytometrifarveskemaet for JEV-specifikke T_PF’erproduceret af mononukleære celler i perifert blod af børn vaccineret mod japansk encephalitis testet for at give en reference til lignende undersøgelser.

Introduction

Japansk encephalitisvirus (JEV) er en vigtig myggebåren virus, der tilhører slægten Flavivirus inden for Flaviviridae-familien ¹. Mange lande i Asien og Stillehavsområdet har længe stået over for enorme folkesundhedsudfordringer på grund af den enorme sygdomsbyrde forårsaget af japansk encephalitis (JE), men dette er forbedret dramatisk med den stigende tilgængelighed af forskellige typer vaccinationer². Adaptive beskyttende immunresponser fremkaldt af naturlig infektion eller vaccination bidrager til forebyggelse og antiviral regulering. Humoral immunitet og cellemedieret immunitet klassificeres som adaptiv immunitet, og induktion af førstnævnte har altid været betragtet som en nøglestrategi inden for vaccinedesign, omend med relativt begrænset forståelse i de sidste³. T-cellemedieret immunitets rolle med hensyn til at begrænse flavivirusspredning og virusclearance er imidlertid i stigende grad blevet fokuseret på og grundigt undersøgt⁴. Desuden er T-celleimmunitet ikke kun uundværlig i JEV-specifikke antivirale reaktioner, men spiller også en fremtrædende rolle i krydsbeskyttelse mod sekundær infektion med heterologe flavivirus, hvilket er blevet påvist i tidligere undersøgelser⁵. Det spekuleres i, at denne effekt kan omgå potentielle antistofmedierede forbedringseffekter i infektion⁵. Bemærk, at en sådan krydsreaktiv T-celleimmunitet er vigtig, især i mangel af vacciner og antivirale lægemidler mod flavivirus. Selvom mange undersøgelser er blevet udført for at bestemme T-cellernes bidrag i JEV-infektion med hensyn til CD4 ⁺ og CD8 ⁺ T-celler^6,7, forbliver de respektive afstamninger, der udskiller cytokiner og deres funktionelle diversificering, ubestemte, hvilket betyder^, at belysningen af de nøjagtige funktioner af hjælper- og dræber-T-celler hindres.

Omfanget af deres antivirale forsvar bestemmer kvaliteten af T-celleresponser. CD4 ⁺ eller CD8 ⁺ T-celler, der kompatibelt kan give to eller flere funktioner, herunder cytokinsekretion og degranulering, karakteriseres som polyfunktionelle T-celler (T_PF’er) ved specifik stimulering på enkeltcelleniveau⁸. CD4 ⁺ T-celler, der producerer enkelte eller flere cytokiner, kan have forskellige virkninger og immunhukommelser. For eksempel er IL-2+ IFN-γ⁺ CD4+ T-celler mere tilbøjelige til at danne et langsigtet effektivt beskyttelsesrespons end IL-2⁺ CD4⁺ T-celler⁹, som kan bruges som en vigtig parameter til evaluering af vaccinationseffekten. Hyppigheden af IL-2⁺ IFN-γ⁺ CD4+ T-celler øges hos patienter med langvarig ikke-progression af erhvervet immundefektsyndrom (AIDS), mens CD4⁺ T-celler hos patienter med AIDS-progression er mere tilbøjelige til at producere IFN-γ alene på grund af den fremmende virkning af IL-2 på T-celleproliferation¹⁰. Desuden viste det sig, at en delmængde af ^IL-2+ IFN-γ+ TNF-α⁺ overlevede langsigtet in vivo og synergistisk fremmede drabsfunktionen¹¹. Selvom CD8 + T-celler er mere tilbøjelige til at udvise cytotoksisk aktivitet, er nogle CD4 ⁺ T-celler også udstyret med cytotoksisk aktivitet som et indirekte detekteret udtryk for overflade CD107a molekyler¹². Derudover udtrykker visse T-celleundergrupper kemokin-MIP-1α, som ofte udskilles af monocytter for at deltage i T-cellemedieret neutrofil rekruttering¹³. På samme måde kan ^CD8+ T_PFs også bruges til at karakterisere alsidigheden af ovenstående markører. Undersøgelser har vist, at prime-boost-strategien effektivt kan fremkalde en længere periode med T_{PF-beskyttende} virkninger¹³, hvilket kan forbedre beskyttelsen fremkaldt af vaccination. Et centralt træk ved at undersøge immunsystemet er hukommelses-T-cellernes evne til at lette stærkere, hurtigere og mere effektive reaktioner på sekundære virale udfordringer end naive T-celler. Effektorhukommelses-T-celler (T_EM) og centrale hukommelses-T-celler (T_CM) er vigtige T-celleundergrupper, der ofte differentieres ved den sammensatte ekspression af CD27 / CD45RO eller CCR7 / CD45RA¹⁴. T_CM (CD27+ CD45RO+ eller CCR7⁺ CD45RA^–) har tendens til at lokalisere i sekundært lymfoidt væv, mens T_EM (CD27- CD45RO⁺ eller CCR7– CD45RA^–) lokaliserer i lymfoid og perifert væv ^15,16. T_EM giver øjeblikkeligt, men ikke vedvarende forsvar, mens T_CM opretholder responsen ved at proliferere i de sekundære lymfoide organer og generere nye effektorer¹⁷. I betragtning af at hukommelsesceller kan formidle specifikke og effektive tilbagekaldelsesresponser på vira, opstår der spørgsmål om bidraget fra denne delmængde af polyfunktioner.

Med udviklingen af flowcytometriteknologi er det blevet almindeligt samtidig at detektere markører for mere end 10 klynger, fænotyper og differentieringsantigener, hvilket er gavnligt for mere rigeligt at kommentere de funktionelle immunologiske træk på individuelle T-celler for at reducere fejlfortolkning og vanskeligheder med at forstå T-cellefænotyper. Denne undersøgelse brugte ex vivo-stimulering og flowcytometri til at analysere T_PF-profiler i mononukleære celler (PBMC’er i perifert blod) hos JEV-vaccinerede børn. Ved anvendelse af denne tilgang vil forståelsen af kort- og langsigtet JEV-specifik og endda krydsreaktiv T-celleimmunitet induceret af vaccination blive udvidet.

Protocol

Etisk godkendelse af denne undersøgelse blev opnået af den etiske komité for Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University (godkendelsesnummer: 2020-k-85). Frivillige blev rekrutteret fra Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University. Perifere venøse blodprøver blev taget fra tilsyneladende raske børn (2 år), der tidligere havde modtaget en prime og boostet vaccination med levende svækket JE SA14-14-2-vaccine i mindre end et halvt år (JE-vaccinerede børn, n = 5) og uvaccinerede børn (6 mån…

Representative Results

Figur 1 viser den gating-strategi, der bruges til at opdele TCM- eller TEM for CD8+ eller CD4+ T-celler fra en repræsentativ JEV-stimuleringsgruppe af JE-vaccinerede børn. FSC-A/SSC-A dot-plottet bruges til at identificere lymfocytter, og FSC-A/FSC-W dot plottet bruges til at identificere enkeltceller. Levedygtige celler vælges på levende / død / SSC-A prikplot. CD3/SSC-A-punktplottet bruges til at identificere CD3+ T-cellerne. Plot…

Discussion

Denne protokol repræsenterer en gennemførlig flowcytometribaseret detektionsmetode for T_PF-profiler i PBMC’erne hos børn, der er vaccineret med JEV-vaccinen SA14-14-2. Denne undersøgelse brugte venøst blod PBMC’er fra både vaccinerede og uvaccinerede børn som forskningsmaterialer. Med stimulering af PBMC’er med JEV-antigenet kan de forstærkede antigenspecifikke T_PF’erkarakteriseres ved flerfarvet flowcytometriantistoffarvning. Sammenlignet med den konventionelle enzymbundne immunospot-assaym…

Materials

anti-human CD28	Biolegend	302934	Antibody
anti-human CD49d	Biolegend	304339	Antibody
APC anti-human MIP-1α	BD	551533	Fluorescent antibody
Automated cell counter	BIO RAD	TC20	Cell count
BD FACSymphony A5	BD	A5	flow Cytometry
BUV395 anti-human CD4	BD	563550	Fluorescent antibody
BUV737 anti-human CCR7	BD	741786	Fluorescent antibody
BUV737 anti-human CD27	BD	612829	Fluorescent antibody
BV421 anti-human CD8	Biolegend	344748	Fluorescent antibody
BV480 anti-human CD45RA	BD	566114	Fluorescent antibody
BV480 anti-human CD45RO	BD	566143	Fluorescent antibody
BV605 anti-human CD107a	Biolegend	328634	Fluorescent antibody
BV650 anti-human CD3	BD	563999	Fluorescent antibody
BV785 anti-human IL-2	Biolegend	500348	Fluorescent antibody
Centrifuge Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL centrifuge tube
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD	554714	Cell fixation and permeabilization
Density gradient medium	Dakewe	DKW-KLSH-0100	Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium
FITC anti-human IFN-γ	Biolegend	502506	Fluorescent antibody
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000-044	Fetal Bovine Serum
Gibco RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	22400089	cell culture medium
High-speed centrifuge	Sigma	3K15	Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
High-speed centrifuge	Eppendorf	5424R	Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Microcentrifuge tubes	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL microcentrifuge tube
PE anti-human TNF-α	Biolegend	502909	Fluorescent antibody
Phosphate Buffered Saline (PBS)	BI	02-024-1ACS	PBS
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug)	BD	555029	blocks intracellular protein transport processes
Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)	BD	554724	blocks intracellular protein transport processes
Round-bottom test tube	BD Falcon	352235	5 mL test tube
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit	Beyotime	C0011	Trypan Blue Staining
Zombie NIR Fixable Viability Dye	Biolegend	423106	Dead cell stain