Détection de lymphocytes T polyfonctionnels chez les enfants vaccinés avec le vaccin contre l’encéphalite japonaise par la technique de cytométrie en flux
Summary
Le présent protocole combine la stimulation ex vivo et la cytométrie en flux pour analyser les profils de lymphocytes T polyfonctionnels (TPF) dans les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) chez les enfants vaccinés contre le virus de l’encéphalite japonaise (JEV). La méthode de détection et la palette de couleurs de cytométrie en flux des TPF spécifiques au JEV ont été testées pour fournir une référence pour des études similaires.
Abstract
L’immunité à médiation par les lymphocytes T joue un rôle important dans le contrôle de l’infection à flavivirus, soit après la vaccination, soit après une infection naturelle. La « qualité » d’un lymphocyte T doit être évaluée par fonction, et une fonction supérieure est associée à une protection immunitaire plus puissante. Les lymphocytes T qui peuvent produire simultanément deux cytokines ou chimiokines ou plus au niveau unicellulaire sont appelés lymphocytes T polyfonctionnels (TPFs), qui médient les réponses immunitaires par divers mécanismes moléculaires pour exprimer les marqueurs de dégranulation (CD107a) et sécréter de l’interféron (IFN)-γ, du facteur de nécrose tumorale (TNF)-α, de l’interleukine (IL)-2 ou de la protéine inflammatoire des macrophages (MIP)-1α. Il existe de plus en plus de preuves que les TPFsont étroitement liés au maintien de la mémoire immunitaire et de la protection à long terme et que leur proportion accrue est un marqueur important de l’immunité protectrice et est important dans le contrôle efficace de l’infection virale et de la réactivation. Cette évaluation s’applique non seulement à des réponses immunitaires spécifiques, mais aussi à l’évaluation des réponses immunitaires réactives croisées. Ici, en prenant le virus de l’encéphalite japonaise (JEV) comme exemple, la méthode de détection et la palette de couleurs de cytométrie en flux des TPFspécifiques du JEV produites par les cellules mononucléaires du sang périphérique d’enfants vaccinés contre l’encéphalite japonaise ont été testées pour fournir une référence pour des études similaires.
Introduction
Le virus de l’encéphalite japonaise (JEV) est un important virus transmis par les moustiques appartenant au genre Flavivirus de la familledes Flaviviridae 1. De nombreux pays d’Asie-Pacifique sont depuis longtemps confrontés à d’énormes défis de santé publique en raison de l’énorme charge de morbidité causée par l’encéphalite japonaise (EJ), mais cela s’est considérablement amélioré avec la disponibilité croissante de divers types de vaccins2. Les réponses immunitaires protectrices adaptatives évoquées par l’infection naturelle ou la vaccination contribuent à la prévention et à la régulation antivirale. L’immunité humorale et l’immunité à médiation cellulaire sont classées comme immunité adaptative, et l’induction de la première a toujours été considérée comme une stratégie clé dans la conception de vaccins, bien qu’avec une compréhension relativement limitée au cours des3 dernières années. Cependant, le rôle de l’immunité médiée par les lymphocytes T dans la limitation de la dissémination des flavivirus et de l’élimination du virus a été de plus en plus ciblé et étudié de manière approfondie4. De plus, l’immunité des lymphocytes T est non seulement indispensable dans les réponses antivirales spécifiques du JEV, mais joue également un rôle de premier plan dans la protection croisée contre l’infection secondaire par des flavivirus hétérologues, ce qui a été démontré dans des études antérieures5. On suppose que cet effet peut contourner les effets potentiels d’amélioration médiés par les anticorps dans l’infection5. Il convient de noter qu’une telle immunité croisée des lymphocytes T est importante, en particulier en l’absence de vaccins et de médicaments antiviraux contre les flavivirus. Bien que de nombreuses études aient été réalisées pour déterminer la contribution des lymphocytes T dans l’infection par le JEV par rapport aux lymphocytes T CD4+ et CD8+ 6,7, les lignées respectives sécrétant des cytokines et leur diversification fonctionnelle restent indéterminées, ce qui signifie que l’élucidation des fonctions exactes des lymphocytes T auxiliaires et tueurs est entravée.
L’échelle de leurs défenses antivirales détermine la qualité des réponses des lymphocytes T. Les lymphocytes T CD4+ ou CD8+ qui peuvent conférer de façon compatible deux fonctions ou plus, y compris la sécrétion et la dégranulation de cytokines, sont caractérisés comme des lymphocytes T polyfonctionnels (TPF) lors d’une stimulation spécifique au niveau unicellulaire8. Les lymphocytes T CD4+ qui produisent une ou plusieurs cytokines peuvent avoir divers effets et mémoires immunitaires. Par exemple, les lymphocytes T CD4+ IL-2+ IFN-γ+ sont plus susceptibles de former une réponse protectrice efficace à long terme que les lymphocytes T CD4+ IL-2+ 9, qui peuvent être utilisés comme paramètre important dans l’évaluation de l’effet vaccinal. La fréquence des lymphocytes T CD4+ IL-2+ IFN-γ+ est augmentée chez les patients présentant une non-progression à long terme du syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA), tandis que les lymphocytes T CD4+ chez les patients atteints de progression du sida sont plus enclins à produire de l’IFN-γ seul en raison de l’effet favorisant l’IL-2 sur la prolifération des lymphocytes T10. En outre, il a été démontré qu’un sous-ensemble d’IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ survivait à long terme in vivo et favorisait de manière synergique la fonction de destruction11. Bien que les lymphocytes T CD8+ soient plus susceptibles de présenter une activité cytotoxique, certains lymphocytes T CD4+ sont également équipés d’une activité cytotoxique en tant qu’expression indirectement détectée de molécules CD107ade surface 12. De plus, certains sous-ensembles de lymphocytes T expriment la chimiokine MIP-1α, qui est souvent sécrétée par les monocytes pour participer au recrutement des neutrophiles médiés par les lymphocytes T13. De même, les CD8+ TPFs peuvent également être utilisés pour caractériser la polyvalence des marqueurs ci-dessus. Des études ont montré que la stratégie prime-boost peut induire efficacement une période prolongée d’effets protecteurs du TPF 13, ce qui peut renforcer la protection obtenue par la vaccination. Une caractéristique centrale de l’examen du système immunitaire est la capacité des lymphocytes T mémoire à faciliter des réponses plus fortes, plus rapides et plus efficaces aux défis viraux secondaires que les lymphocytes T naïfs. Les lymphocytes T à mémoire effectrice (TEM) et les lymphocytes T à mémoire centrale (TCM) sont des sous-ensembles importants de lymphocytes T qui sont souvent différenciés par l’expression composite de CD27/CD45RO ou CCR7/CD45RA14. TCM (CD27+ CD45RO+ ou CCR7+ CD45RA-) a tendance à se localiser dans les tissus lymphoïdes secondaires, tandis que TEM (CD27- CD45RO+ ou CCR7- CD45RA–) se localise dans les tissus lymphoïdes et périphériques15,16. La TEM assure une défense immédiate mais non soutenue, tandis que la TCM soutient la réponse en proliférant dans les organes lymphoïdes secondaires et en générant de nouveaux effecteurs17. Ainsi, étant donné que les cellules mémoire peuvent intervenir des réponses de rappel spécifiques et efficaces aux virus, des questions se posent quant à la contribution de ce sous-ensemble de polyfonctions.
Avec le développement de la technologie de cytométrie en flux, il est devenu courant de détecter simultanément les marqueurs de plus de 10 grappes, phénotypes et antigènes de différenciation, ce qui est bénéfique pour annoter plus abondamment les caractéristiques immunologiques fonctionnelles sur les cellules T individuelles afin de réduire les erreurs d’interprétation et les difficultés de compréhension des phénotypes des cellules T. Cette étude a utilisé la stimulation ex vivo et la cytométrie de flux pour analyser les profils de TPF dans les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) chez les enfants vaccinés par le JEV. En appliquant cette approche, la compréhension de l’immunité à court et à long terme des lymphocytes T spécifiques au JEV et même à réactivité croisée induite par la vaccination sera élargie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole représente une méthode de détection réalisable basée sur la cytométrie en flux pour les profils TPF dans les PBMC des enfants vaccinés avec le vaccin JEV SA14-14-2. Cette étude a utilisé les PBMC sanguins veineux d’enfants vaccinés et non vaccinés comme matériel de recherche. Avec la stimulation des PBMC avec l’antigène JEV, ces TPFamplifiés spécifiques de l’antigène peuvent être caractérisés par une coloration multicolore des anticorps de cytométrie en flux. P…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.W. a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82002130), la Fondation des sciences naturelles de Beijing de Chine (7222059). ZD.X. a été soutenu par le Fonds d’innovation CAMS pour les sciences médicales (2019-I2M-5-026).
Materials
| anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
| anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
| APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
| BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
| BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
| BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
| BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
| BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
| Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
| FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
| Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |
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