Detectie van polyfunctionele T-cellen bij kinderen die zijn gevaccineerd met japans encefalitisvaccin via de flowcytometrietechniek
Summary
Het huidige protocol combineert ex vivo stimulatie en flowcytometrie om polyfunctionele T-cel (TPF) profielen te analyseren in perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) binnen Japanse encefalitisvirus (JEV) -gevaccineerde kinderen. De detectiemethode en het flowcytometriekleurenschema van JEV-specifieke TPF’s werden getest om een referentie te bieden voor vergelijkbare studies.
Abstract
T-cel-gemedieerde immuniteit speelt een belangrijke rol bij het beheersen van flavivirusinfectie, hetzij na vaccinatie of na natuurlijke infectie. De “kwaliteit” van een T-cel moet worden beoordeeld op functie en een hogere functie wordt geassocieerd met een krachtigere immuunbescherming. T-cellen die tegelijkertijd twee of meer cytokines of chemokines op eencellig niveau kunnen produceren, worden polyfunctionele T-cellen (TPFs) genoemd, die immuunresponsen bemiddelen via een verscheidenheid aan moleculaire mechanismen om degranulatiemarkers (CD107a) tot expressie te brengen en interferon (IFN) -γ, tumornecrosefactor (TNF) -α, interleukine (IL) -2 of macrofaag ontstekingseiwit (MIP) -1α uit te scheiden. Er zijn steeds meer aanwijzingen dat TPF’snauw samenhangen met het behoud van het langetermijnimmuungeheugen en de bescherming en dat hun verhoogde aandeel een belangrijke marker is van beschermende immuniteit en belangrijk is voor de effectieve bestrijding van virale infecties en reactivering. Deze evaluatie is niet alleen van toepassing op specifieke immuunresponsen, maar ook op de beoordeling van kruisreactieve immuunresponsen. Hier, met het Japanse encefalitisvirus (JEV) als voorbeeld, werden de detectiemethode en het flowcytometriekleurenschema van JEV-specifieke TPF’sgeproduceerd door perifere mononucleaire bloedcellen van kinderen die waren gevaccineerd tegen Japanse encefalitis getest om een referentie te bieden voor vergelijkbare studies.
Introduction
Japans encefalitisvirus (JEV) is een belangrijk door muggen overgedragen virus dat behoort tot het geslacht Flavivirus binnen de Flaviviridae-familie1. Veel landen in Azië en de Stille Oceaan worden al lang geconfronteerd met enorme uitdagingen op het gebied van de volksgezondheid als gevolg van de enorme ziektelast veroorzaakt door Japanse encefalitis (JE), maar dit is dramatisch verbeterd met de toenemende beschikbaarheid van verschillende soorten vaccinaties2. Adaptieve beschermende immuunresponsen die worden opgeroepen door natuurlijke infectie of vaccinatie dragen bij aan de preventie en antivirale regulatie. Humorale immuniteit en celgemedieerde immuniteit worden geclassificeerd als adaptieve immuniteit, en de inductie van de eerste is altijd beschouwd als een belangrijke strategie bij het ontwerpen van vaccins, zij het met relatief beperkt begrip in het verleden3. De rol van T-cel-gemedieerde immuniteit bij het beperken van flavivirusverspreiding en virusklaring is echter steeds meer gericht op en uitgebreid bestudeerd4. Bovendien is T-celimmuniteit niet alleen onmisbaar bij JEV-specifieke antivirale reacties, maar speelt het ook een prominente rol bij kruisbescherming tegen secundaire infectie met heterologe flavivirussen, wat in eerdere studies is aangetoond5. Er wordt gespeculeerd dat dit effect potentiële antilichaam-gemedieerde versterkingseffecten bij infectie5 kan omzeilen. Van belang is dat een dergelijke kruisreactieve T-celimmuniteit belangrijk is, vooral bij afwezigheid van vaccins en antivirale geneesmiddelen tegen flavivirussen. Hoewel er veel studies zijn uitgevoerd om de bijdrage van T-cellen aan JEV-infectie te bepalen met betrekking tot CD4+ en CD8+ T-cellen 6,7, blijven de respectieve afstammingslijnen die cytokines afscheiden en hun functionele diversificatie onbepaald, wat betekent dat de opheldering van de exacte functies van helper- en killer T-cellen wordt belemmerd.
De schaal van hun antivirale afweer bepaalt de kwaliteit van T-celresponsen. CD4+ of CD8+ T-cellen die compatibel twee of meer functies kunnen verlenen, waaronder cytokinesecretie en degranulatie, worden gekarakteriseerd als polyfunctionele T-cellen (TPFs) bij specifieke stimulatie op eencellig niveau8. CD4 + T-cellen die enkele of meerdere cytokines produceren, kunnen verschillende effecten en immuungeheugens hebben. IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-cellen hebben bijvoorbeeld meer kans om een effectieve beschermende respons op lange termijn te vormen dan IL-2+ CD4+ T-cellen9, die kunnen worden gebruikt als een belangrijke parameter bij het evalueren van het vaccinatie-effect. De frequentie van IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-cellen is verhoogd bij patiënten met langdurige niet-progressie van verworven immuundeficiëntiesyndroom (AIDS), terwijl CD4+ T-cellen bij patiënten met AIDS-progressie meer geneigd zijn om alleen IFN-γ te produceren vanwege het bevorderende effect van IL-2 op T-celproliferatie10. Bovendien bleek een subset van IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ langdurig in vivo te overleven en synergetisch de dodingsfunctiete bevorderen 11. Hoewel CD8+ T-cellen meer kans hebben om cytotoxische activiteit te vertonen, zijn sommige CD4+ T-cellen ook uitgerust met cytotoxische activiteit als een indirect gedetecteerde expressie van oppervlakte-CD107a-moleculen12. Bovendien drukken bepaalde T-celsubsets de chemokine MIP-1α uit, die vaak wordt uitgescheiden door monocyten om deel te nemen aan T-cel-gemedieerde neutrofiele rekrutering13. Op dezelfde manier kunnen CD8 + TPF’sook worden gebruikt om de veelzijdigheid van de bovenstaande markers te karakteriseren. Studies hebben aangetoond dat de prime-boost-strategie effectief een langdurige periode van TPF-beschermende effecten kan induceren13, wat de bescherming die door vaccinatie wordt opgewekt, kan verbeteren. Een centraal kenmerk bij het onderzoeken van het immuunsysteem is het vermogen van geheugen-T-cellen om sterkere, snellere en effectievere reacties op secundaire virale uitdagingen mogelijk te maken dan naïeve T-cellen. Effectorgeheugen T-cellen (TEM) en T-cellen met centraal geheugen (TCM) zijn belangrijke T-celsubsets die vaak worden gedifferentieerd door de samengestelde expressie van CD27/CD45RO of CCR7/CD45RA14. TCM (CD27+ CD45RO+ of CCR7+ CD45RA–) heeft de neiging om te lokaliseren in secundaire lymfoïde weefsels, terwijl TEM (CD27– CD45RO+ of CCR7– CD45RA–) lokaliseert in lymfoïde en perifere weefsels15,16. TEM biedt onmiddellijke maar niet aanhoudende verdediging, terwijl TCM de respons ondersteunt door zich te vermenigvuldigen in de secundaire lymfoïde organen en nieuwe effectoren te genereren17. Aangezien geheugencellen specifieke en efficiënte terugroepreacties op virussen kunnen bemiddelen, rijzen er dus vragen over de bijdrage van deze subset van polyfuncties.
Met de ontwikkeling van flowcytometrietechnologie is het gebruikelijk geworden om tegelijkertijd markers van meer dan 10 clusters, fenotypen en differentiatieantigenen te detecteren, wat gunstig is om de functionele immunologische kenmerken op individuele T-cellen overvloediger te annoteren om misinterpretatie en moeilijkheden bij het begrijpen van T-celfenotypen te verminderen. Deze studie gebruikte ex vivo stimulatie en flowcytometrie om TPF-profielen in perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) bij JEV-gevaccineerde kinderen te analyseren. Door deze aanpak toe te passen, zal het begrip van korte- en langetermijn JEV-specifieke en zelfs cross-reactieve T-celimmuniteit geïnduceerd door vaccinatie worden uitgebreid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol vertegenwoordigt een haalbare op flowcytometrie gebaseerde detectiemethode voor TPF-profielen in de PBMC’s van kinderen die zijn gevaccineerd met het JEV-vaccin SA14-14-2. Deze studie gebruikte de veneuze bloed PBMC’s van zowel gevaccineerde als niet-gevaccineerde kinderen als onderzoeksmateriaal. Met de stimulatie van PBMC’s met het JEV-antigeen kunnen die versterkte antigeenspecifieke TPF’sworden gekenmerkt door multicolor flowcytometrie-antilichaamkleuring. In vergelijking met de con…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.W. werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82002130), beijing natural science foundation of China (7222059). ZD.X. werd ondersteund door het CAMS Innovatiefonds voor Medische Wetenschappen (2019-I2M-5-026).
Materials
| anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
| anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
| APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
| BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
| BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
| BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
| BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
| BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
| Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
| FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
| Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |
References
- Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity. Pathogens. 11 (3), 317 (2022).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).
- Wang, R., et al. Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children. Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).
- Wang, R., et al. Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).
- Wang, R., et al. T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).
- Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).
- Jain, N., et al. CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).
- Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines. NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).
- Weaver, J. M., et al. Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza. PloS One. 8 (-), 57275 (2013).
- Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection. Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).
- Gui, L., et al. IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells. Cytokine. 84, 37-46 (2016).
- Terahara, K., et al. Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection. Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).
- Tanyi, J. L., et al. Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer. NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).
- Ammirati, E., et al. Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models. Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).
- Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery – A follow-up study. Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).
- Zhang, Y., et al. Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion. Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).
- Shin, H., Iwasaki, A. Tissue-resident memory T cells. Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).
- Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents. Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).
- Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system. Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Zheng, X., et al. Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).
- Zheng, X., et al. Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China. Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19. Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).
- Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins. Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).
