Обнаружение полифункциональных Т-клеток у детей, вакцинированных вакциной против японского энцефалита, с помощью метода проточной цитометрии

Summary

Настоящий протокол сочетает в себе стимуляцию ex vivo и проточную цитометрию для анализа профилей полифункциональных Т-клеток (_Т-ПФ) в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMCs) у детей, вакцинированных вирусом японского энцефалита (JEV). Метод обнаружения и цветовая схема проточной цитометрии JEV-специфических TPF были протестированы, чтобы обеспечить ссылку для аналогичных исследований.

Abstract

Т-клеточный иммунитет играет важную роль в борьбе с флавивирусной инфекцией, либо после вакцинации, либо после естественной инфекции. «Качество» Т-клетки необходимо оценивать по функции, а более высокая функция связана с более мощной иммунной защитой. Т-клетки, которые могут одновременно продуцировать два или более цитокинов или хемокинов на одноклеточном уровне, называются полифункциональными Т-клетками (T_PF), которые опосредуют иммунные реакции через различные молекулярные механизмы для экспрессии маркеров дегрануляции (CD107a) и секретирования интерферона (IFN)-γ, фактора некроза опухоли (TNF)-α, интерлейкина (IL)-2 или воспалительного белка макрофагов (MIP)-1α. Появляется все больше доказательств того, что T_PFтесно связаны с поддержанием долговременной иммунной памяти и защиты и что их повышенная доля является важным маркером защитного иммунитета и важна для эффективного контроля вирусной инфекции и реактивации. Эта оценка относится не только к специфическим иммунным реакциям, но и к оценке перекрестно-реактивных иммунных реакций. Здесь, взяв в качестве примера вирус японского энцефалита (JEV), был протестирован метод обнаружения и цветовая схема проточной цитометрии JEV-специфических T_PF, продуцируемых мононуклеарными клетками периферической крови детей, вакцинированных против японского энцефалита, чтобы обеспечить ссылку на аналогичные исследования.

Introduction

Вирус японского энцефалита (JEV) является важным переносимым комарами вирусом, принадлежащим к роду Flavivirus в семействе Flaviviridae¹. Многие страны Азиатско-Тихоокеанского региона уже давно сталкиваются с огромными проблемами общественного здравоохранения из-за огромного бремени болезней, вызванных японским энцефалитом (ЯЭ), но это значительно улучшилось с увеличением доступности различных типов прививок². Адаптивные защитные иммунные реакции, вызванные естественной инфекцией или вакцинацией, способствуют профилактике и противовирусной регуляции. Гуморальный иммунитет и клеточно-опосредованный иммунитет классифицируются как адаптивный иммунитет, и индукция первого всегда рассматривалась как ключевая стратегия в разработке вакцин, хотя и с относительно ограниченным пониманием в последние³. Однако роль Опосредованного Т-клетками иммунитета в ограничении распространения флавивируса и клиренса вируса все больше внимания уделяется и широко изучается⁴. Кроме того, Т-клеточный иммунитет не только незаменим в JEV-специфических противовирусных реакциях, но и играет заметную роль в перекрестной защите от вторичной инфекции гетерологичными флавивирусами, что было продемонстрировано в предыдущих исследованиях⁵. Предполагается, что этот эффект может обойти потенциальные эффекты усиления, опосредованные антителами, при инфекции⁵. Следует отметить, что такой перекрестно-реактивный Т-клеточный иммунитет важен, особенно при отсутствии вакцин и противовирусных препаратов против флавивирусов. Хотя было проведено много исследований для определения вклада Т-клеток в инфекцию JEV в отношении CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток ^6,7, соответствующие линии, секретирующие цитокины, и их функциональная диверсификация остаются неопределенными, что означает, что выяснение точных функций хелперных и киллерных Т-клеток затруднено.

Масштаб их противовирусной защиты определяет качество реакций Т-клеток. CD4⁺ или CD8⁺ Т-клетки, которые могут сочетать две или более функции, включая секрецию цитокинов и дегрануляцию, характеризуются как полифункциональные Т-клетки (T_PFs) при специфической стимуляции на одноклеточном уровне⁸. CD4 ⁺ Т-клетки, которые производят один или несколько цитокинов, могут иметь различные эффекты и иммунные воспоминания. Например, IL-2⁺ IFN-γ ⁺ CD4 ⁺ Т-клетки с большей вероятностью образуют долгосрочный эффективный защитный ответ, чем IL-2 ⁺ CD4 ⁺ Т-клетки⁹, которые могут быть использованы в качестве важного параметра при оценке эффекта вакцинации. Частота IL-2⁺ IFN-γ ⁺ CD4 ⁺ Т-клеток увеличивается у пациентов с длительным непрогрессированием синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), в то время как CD4 ⁺ Т-клетки у пациентов с прогрессированием СПИДа более склонны к производству IFN-γ в одиночку из-за стимулирующего эффекта IL-2 на пролиферацию Т-клеток¹⁰. Кроме того, было показано, что подмножество IL-2⁺ IFN-γ⁺ TNF-α⁺ выживает в течение длительного времени in vivo и синергетически способствует функции уничтожения¹¹. Хотя CD8^{+ Т-клетки} с большей вероятностью проявляют цитотоксическую активность, некоторые CD4⁺ Т-клетки также оснащены цитотоксической активностью в качестве косвенно обнаруженной экспрессии поверхностных молекул CD107a¹². Кроме того, некоторые подмножества Т-клеток экспрессируют хемокин MIP-1α, который часто секретируется моноцитами для участия в Опосредованной Т-клетками рекрутации нейтрофилов¹³. Аналогичным образом, CD8 ⁺ T_PFs также может быть использован для характеристики универсальности вышеуказанных маркеров. Исследования показали, что стратегия прайм-буст может эффективно вызывать длительный период защитных эффектов T_PF ¹³, которые могут усилить защиту, вызванную вакцинацией. Центральной особенностью при изучении иммунной системы является способность Т-клеток памяти способствовать более сильным, быстрым и эффективным ответам на вторичные вирусные проблемы, чем наивные Т-клетки. Эффекторные Т-клетки памяти (_Т-ЭМ) и Т-клетки центральной памяти (_Т-СМ) являются важными подмножествами Т-клеток, которые часто дифференцируются составной экспрессией CD27/CD45RO или CCR7/CD45RA¹⁴. T_CM (CD27⁺ CD45RO⁺ или CCR7⁺ CD45RA^–) имеет тенденцию локализоваться во вторичных лимфоидных тканях, в то время как T_EM (CD27^– CD45RO⁺ или CCR7^– CD45RA^–) локализуется в лимфоидных и периферических тканях^15,16. T_EM обеспечивает немедленную, но не устойчивую защиту, тогда как T_CM поддерживает ответ, размножаясь во вторичных лимфоидных органах и генерируя новые эффекторы¹⁷. Таким образом, учитывая, что клетки памяти могут опосредуть специфические и эффективные реакции на вирусы, возникают вопросы о вкладе этого подмножества полифункций.

С развитием технологии проточной цитометрии стало обычным делом одновременно обнаруживать маркеры более 10 кластеров, фенотипов и дифференцированных антигенов, что полезно для более обильного аннотирования функциональных иммунологических особенностей на отдельных Т-клетках, чтобы уменьшить неправильную интерпретацию и трудности в понимании фенотипов Т-клеток. В этом исследовании использовались стимуляция ex vivo и проточная цитометрия для анализа профилей T_PF в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMCs) у детей, вакцинированных JEV. Применяя этот подход, будет расширено понимание краткосрочного и долгосрочного JEV-специфического и даже перекрестно-реактивного Т-клеточного иммунитета, вызванного вакцинацией.

Protocol

Этическое одобрение для настоящего исследования было получено Комитетом по этике Пекинской детской больницы Столичного медицинского университета (номер одобрения: 2020-k-85). Добровольцы были набраны из Пекинской детской больницы Столичного медицинского университета. Образцы периферич…

Representative Results

На рисунке 1 показана стратегия гатинга, используемая для деления TCM или TEM CD8+ или CD4+ Т-клеток от репрезентативной группы стимуляции JEV детей, вакцинированных JE. Точечный график FSC-A/SSC-A используется для идентификации лимфоцитов, а точечный график FSC-…

Discussion

Этот протокол представляет собой осуществимый метод обнаружения на основе проточной цитометрии для профилей T_PF в PBMCs детей, вакцинированных вакциной JEV SA14-14-2. В этом исследовании в качестве исследовательских материалов использовались ПБМК венозной крови как вакцинированных, так…

Materials

anti-human CD28	Biolegend	302934	Antibody
anti-human CD49d	Biolegend	304339	Antibody
APC anti-human MIP-1α	BD	551533	Fluorescent antibody
Automated cell counter	BIO RAD	TC20	Cell count
BD FACSymphony A5	BD	A5	flow Cytometry
BUV395 anti-human CD4	BD	563550	Fluorescent antibody
BUV737 anti-human CCR7	BD	741786	Fluorescent antibody
BUV737 anti-human CD27	BD	612829	Fluorescent antibody
BV421 anti-human CD8	Biolegend	344748	Fluorescent antibody
BV480 anti-human CD45RA	BD	566114	Fluorescent antibody
BV480 anti-human CD45RO	BD	566143	Fluorescent antibody
BV605 anti-human CD107a	Biolegend	328634	Fluorescent antibody
BV650 anti-human CD3	BD	563999	Fluorescent antibody
BV785 anti-human IL-2	Biolegend	500348	Fluorescent antibody
Centrifuge Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL centrifuge tube
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD	554714	Cell fixation and permeabilization
Density gradient medium	Dakewe	DKW-KLSH-0100	Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium
FITC anti-human IFN-γ	Biolegend	502506	Fluorescent antibody
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000-044	Fetal Bovine Serum
Gibco RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	22400089	cell culture medium
High-speed centrifuge	Sigma	3K15	Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
High-speed centrifuge	Eppendorf	5424R	Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Microcentrifuge tubes	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL microcentrifuge tube
PE anti-human TNF-α	Biolegend	502909	Fluorescent antibody
Phosphate Buffered Saline (PBS)	BI	02-024-1ACS	PBS
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug)	BD	555029	blocks intracellular protein transport processes
Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)	BD	554724	blocks intracellular protein transport processes
Round-bottom test tube	BD Falcon	352235	5 mL test tube
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit	Beyotime	C0011	Trypan Blue Staining
Zombie NIR Fixable Viability Dye	Biolegend	423106	Dead cell stain