Summary
Diese Studie zeigt die Verabreichung eines wiederholten Schädel-Hirn-Traumas an Mäuse und die gleichzeitige Implantation eines kranialen Fensters für die anschließende intravitale Bildgebung eines neuronenexprimierten EGFP mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie.
Abstract
Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie die Expression und Lokalisierung eines interessierenden Proteins in bestimmten Zelltypen des Gehirns eines Tieres bei Exposition gegenüber exogenen Stimuli longitudinal visualisiert werden kann. Hier wird die Verabreichung eines Schädel-Hirn-Traumas (SHT) und die gleichzeitige Implantation eines Schädelfensters für die anschließende longitudinale intravitale Bildgebung bei Mäusen gezeigt. Mäusen wird intrakranial ein Adeno-assoziiertes Virus (AAV) injiziert, das ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein (EGFP) unter einem neuronalen spezifischen Promotor exprimiert. Nach 2 bis 4 Wochen werden die Mäuse einem wiederholten Schädel-Hirn-Trauma mit einem Gewichtsabwurfgerät über der AAV-Injektionsstelle unterzogen. In derselben chirurgischen Sitzung werden den Mäusen ein Kopfpfosten aus Metall und dann ein Schädelfenster aus Glas über der SHT-Aufprallstelle implantiert. Die Expression und zelluläre Lokalisation von EGFP wird mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop in derselben Hirnregion untersucht, die über Monate hinweg traumatisiert wurde.
Introduction
Schädel-Hirn-Traumata (SHT), die durch Sportverletzungen, Fahrzeugkollisionen und militärische Kämpfe entstehen können, sind ein weltweites Gesundheitsproblem. SHT kann zu physiologischen, kognitiven und Verhaltensdefiziten sowie zu lebenslanger Behinderung oder Mortalität führen 1,2. Der Schweregrad des Schädel-Hirn-Traumas kann als leicht, mittelschwer und schwer klassifiziert werden, wobei die überwiegende Mehrheit ein leichtes SHT ist (75 %-90 %)3. Es wird zunehmend anerkannt, dass SHT, insbesondere das wiederholte Auftreten von SHT, die neuronale Degeneration fördern und als Risikofaktoren für verschiedene neurodegenerative Erkrankungen dienen kann, darunter Alzheimer (AD), amyotrophe Lateralsklerose (ALS), frontotemporale Demenz (FTD) und chronische traumatische Enzephalopathie (CTE)4,5,6. Die molekularen Mechanismen, die der SHT-induzierten Neurodegeneration zugrunde liegen, sind jedoch noch unklar und stellen daher ein aktives Forschungsgebiet dar. Um einen Einblick in die Art und Weise zu gewinnen, wie Neuronen auf SHT reagieren und sich davon erholen, wird hierin ein Verfahren zur Überwachung fluoreszenzmarkierter Proteine von Interesse, insbesondere innerhalb von Neuronen, durch longitudinale intravitale Bildgebung bei Mäusen nach einem SHT beschrieben.
Zu diesem Zweck wird in dieser Studie gezeigt, wie ein chirurgisches Verfahren zur Verabreichung eines Schädel-Hirn-SHT kombiniert werden kann, das dem ähnelt, was zuvor berichtet wurde7,8, zusammen mit einem chirurgischen Verfahren zur Implantation eines kranialen Fensters für die nachgeschaltete intravitale Bildgebung, wie von Goldey et al.beschrieben 9. Insbesondere ist es nicht möglich, zuerst ein Schädelfenster zu implantieren und anschließend ein Schädel-Hirn-Trauma in derselben Region durchzuführen, da der Aufprall des Gewichtsverlusts, der das Schädel-Hirn-Trauma auslöst, wahrscheinlich das Fenster beschädigt und der Maus irreparable Schäden zufügt. Daher wurde dieses Protokoll entwickelt, um das SHT zu verabreichen und dann das Schädelfenster direkt über der Aufprallstelle zu implantieren, und das alles innerhalb derselben chirurgischen Sitzung. Ein Vorteil der Kombination von SHT und Schädelfensterimplantation in einer einzigen chirurgischen Sitzung ist die Verringerung der Anzahl der Operationen, mit denen eine Maus operiert wird. Darüber hinaus ermöglicht es die unmittelbare Reaktion (d. h. auf der Zeitskala von Stunden) auf ein SHT, im Gegensatz zur Implantation des Fensters bei einer späteren chirurgischen Sitzung (d. h. die erste Bildgebung beginnt auf einer Zeitskala von Tagen nach dem SHT). Das kraniale Fenster und die intravitale Bildgebungsplattform bieten auch Vorteile gegenüber der Überwachung neuronaler Proteine mit herkömmlichen Methoden wie der Immunfärbung von fixiertem Gewebe. Zum Beispiel werden weniger Mäuse für die intravitale Bildgebung benötigt, da dieselbe Maus zu mehreren Zeitpunkten untersucht werden kann, im Gegensatz zu separaten Kohorten von Mäusen, die für diskrete Zeitpunkte benötigt werden. Darüber hinaus können dieselben Neuronen im Laufe der Zeit überwacht werden, so dass bestimmte biologische oder pathologische Ereignisse innerhalb derselben Zelle verfolgt werden können.
Als Proof of Concept wird hier die neuronenspezifische Expression des verstärkten grün fluoreszierenden Proteins (EGFP) unter dem Synapsin-Promotor demonstriert10. Dieser Ansatz kann auf 1) verschiedene Gehirnzelltypen ausgeweitet werden, indem andere zelltypspezifische Promotoren verwendet werden, wie z. B. Myelin-Basisprotein (MBP)-Promotor für Oligodendrozyten und Gliafibrillen-Säureprotein (GFAP)-Promotor für Astrozyten11, 2) verschiedene Zielproteine von Interesse, indem ihre Gene mit dem EGFP-Gen fusioniert werden, und 3) mehrere Proteine co-exprimieren, die mit verschiedenen Fluorophoren fusioniert sind. Hier wird EGFP verpackt und über das Adeno-assoziierte Virus (AAV) durch eine intrakranielle Injektion exprimiert. Ein Schädel-Hirn-Trauma wird mit einem Gewichtsabfallgerät verabreicht, gefolgt von der Implantation eines Schädelfensters. Die Visualisierung der neuronalen EGFP erfolgt durch das kraniale Fenster, wobei die Zwei-Photonen-Mikroskopie verwendet wird, um die EGFP-Fluoreszenz in vivo zu detektieren. Mit dem Zwei-Photonen-Laser ist es möglich, mit minimaler Photoschädigung tiefer in das kortikale Gewebe einzudringen, was eine wiederholte Längsbildgebung derselben kortikalen Regionen innerhalb einer einzelnen Maus über Tage und bis zu Monate ermöglicht12,13,14,15. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser Ansatz, eine SHT-Operation mit intravitaler Bildgebung zu kombinieren, darauf abzielt, das Verständnis der molekularen Ereignisse zu verbessern, die zur SHT-induzierten Krankheitspathologie beitragen16,17.
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Protocol
Alle tierbezogenen Protokolle wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, der vom Ausschuss des National Research Council (US) veröffentlicht wurde. Die Protokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Massachusetts Chan Medical School (UMMS) genehmigt (Genehmigungsnummer 202100057). Kurz gesagt, wie im Schema der Studie (Abbildung 1) dargestellt, erhält das Tier eine Virusinjektion, ein SHT, eine Fensterimplantation und dann eine intravitale Bildgebung in einer zeitlichen Sequenz.
HINWEIS: Kommerzielle Begriffe wurden entfernt. Bitte beachten Sie die Materialtabelle für die spezifischen verwendeten Geräte.
1. Intrakranielle Injektion von AAV mit einem stereotaktischen Gerät
- AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP
- Verwenden Sie einen Virustiter von 1 x 1013 viralen Genomen pro Milliliter (vg/ml). Syn1 bezieht sich auf Synapsin1, einen neuronalen spezifischen Promotor, der eine eingeschränkte virale Expression in Neuronen ermöglicht. Das Virus kann intern vorbereitet oder ausgelagert werden.
- Vorbereitung auf stereotaktische Injektionsoperationen zur Verabreichung von AAV
- Autoklaven Sie eine normale Schere, einen chirurgischen Messschieber, eine chirurgische Federschere, eine chirurgische Pinzette, eine Moskitozange, Gaze, einen Applikator mit Wattespitze und eine Mikroliterspritze aus Glas.
- Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit 75%igem Ethanol. Erweitern Sie das sterile Einweg-OP-Tuch, um den Operationsbereich auf der stereotaktischen Plattform abzudecken.
HINWEIS: Um die Körpertemperatur des Tieres während der Injektionsoperation aufrechtzuerhalten, verwenden Sie ein rückgekoppeltes Heizgerät. - Wiegen und notieren Sie das Körpergewicht der Maus.
- Öffnen Sie das Ventil des Sauerstofftanks und stellen Sie den Sauerstofffluss auf 1,5 l/min ein. Öffnen Sie das Anästhesiegerät und stellen Sie den Isofluran-Wert auf drei ein.
HINWEIS: Das Trägergas kann in diesem Schritt entweder Raumluft oder 100% Sauerstoff sein. - Legen Sie die Maus in die Induktionskammer und lassen Sie sie 5 Minuten lang einwirken, um eine vollständige Anästhesie zu erreichen.
- Sobald die Maus vollständig betäubt ist (d. h. langsame, aber gleichmäßige Atemfrequenzen von etwa einem Zyklus pro 2 s, gepaart mit dem Fehlen eines Schwanzkneifreflexes), nehmen Sie die Maus aus der Induktionskammer und setzen Sie den Mauskopf in den stereotaktischen Rahmen.
- Legen Sie den Nasenkonus des Anästhesieschlauchs über die Schnauze der Maus.
- Halten Sie die Anästhesie mit 1,5 % Isofluran und Trägergas mit einer Flussrate von 1 l/min bis zum Ende der Operation aufrecht. Überprüfen Sie regelmäßig die Atemfrequenz und kneifen Sie während der Operation mindestens alle 15 Minuten in den Schwanz oder die Zehen, um eine angemessene Anästhesie zu beurteilen. Passen Sie die Isoflurankonzentration entsprechend an, um die gewünschte Anästhesietiefe aufrechtzuerhalten.
- Füllen Sie eine Mikroliterspritze (10 μl) mit der Viruslösung. Befestigen Sie dann die Spritze auf der passenden Mikroinjektorpumpe des stereotaktischen Geräts.
- Injektionschirurgie
- Verabreichen Sie Buprenorphin (1 mg/kg, subkutan) mit einer Einweg-Insulinspritze und tragen Sie eine Gleitmittel-Augensalbe auf die Augen der Maus auf.
- Entfernen Sie die Haare von der Kopfhaut auf dem Oberkopf, indem Sie sie mit einer normalen Schere 1 trimmen.
- Reinigen Sie die Kopfhaut mit Gaze und Applikatoren mit Wattespitze. Desinfizieren Sie die Haut zuerst mit 75%igem Ethanol und dann mit Betadin. Wiederholen Sie dies dreimal (d. h. Ethanol gefolgt von Betadin) und lassen Sie die letzte Anwendung von Betadin auf der Haut.
- Überprüfen Sie erneut die Anästhesietiefe, um sicherzustellen, dass die Maus vollständig betäubt ist (d. h. langsame, aber gleichmäßige Atemfrequenzen von etwa einem Zyklus pro 2 s, gepaart mit dem Fehlen eines Schwanzkneifreflexes). Machen Sie einen ~1 cm langen Schnitt mit einer normalen Schere 2 entlang der Mittellinie, um den rechten Scheitelschädel freizulegen, und entfernen Sie das Periost mit einem Applikator mit Wattespitze.
- Markieren Sie zwei Punkte auf dem Schädel mit einem Filzstift an diesen Koordinaten: Punkt A: 2,5 mm hinter dem Bregma und 1 mm lateral der Mittellinie über der rechten Hemisphäre; Punkt B: 2,5 mm hinter dem Bregma und 2 mm lateral der Mittellinie über der rechten Hemisphäre.
- Bohren Sie vorsichtig zwei Löcher durch den Schädel an den markierten Koordinaten mit einem elektrischen Dentalbohrer mit einem feinen EF4-Hartmetallbohrer.
HINWEIS: Achten Sie darauf, das Hirngewebe nicht zu beschädigen. - Passen Sie den stereotaktischen Rahmen so an, dass die Nadelspitze der Mikroliterspritze an dem Schädelloch ausgerichtet ist, das sich 1 mm seitlich der Mittellinie befindet.
- Senken Sie die Spritzennadel ab, um die Gehirnoberfläche zu berühren, und legen Sie diese Position dann als Nullpunkt (für die Z-Achse) fest. Senken Sie die Nadelspitze bis zu einer Tiefe von 0,5 mm in die Hirnrinde und infundierten Sie langsam 1 μl der Viruslösung mit einer Geschwindigkeit von 200 nL/min.
- Warten Sie 5 Minuten, nachdem die Viruslösung vollständig in das Hirngewebe injiziert wurde, bevor Sie die Nadel zurückziehen, um einen Rückfluss der Lösung zu verhindern.
- Ziehen Sie die Spritzennadel langsam zurück. Wiederholen Sie die Injektion an der anderen Stelle. Vernähen Sie den Schnitt mit einem sterilen, nicht resorbierbaren chirurgischen Nahtmaterial (6-0 Gauge).
- Verabreichen Sie Cefazolin [500 mg/kg (333 mg/ml, normalerweise ~45 μl), intramuskulär] und Meloxicam (5 mg/kg, subkutan) nach der Operation, während das Tier noch anästhesiert ist.
- Lösen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen und brechen Sie die Anästhesie ab. Setzen Sie die Maus in einen sauberen Käfig über einer Heizdecke und beobachten Sie das Tier, bis es gehfähig ist (ca. 15 min). Dann in den Heimatkäfig umziehen.
- Buprenorphin (1 mg/kg, subkutan) und Meloxicam (5 mg/kg, subkutan) erneut 8 h, 16 h bzw. 24 h nach der ersten Buprenorphin-Injektion verabreichen.
HINWEIS: 2-4 Wochen nach der Virusinjektion erhält die Maus ein Schädel-Hirn-Trauma und eine Schädelfensterimplantation an der gleichen Stelle wie die AAV-Injektion.
2. Verabreichung einer repetitiven SHT-Induktion
HINWEIS: Die TBI-Parameter wurden gegenüber früheren Berichten7,8 angepasst, in denen die TBI-Auswirkungen einmal geliefert wurden. Das Protokoll wendet hier den gleichen Parameter an, mit der Ausnahme, dass die Gesamtzahl der Auswirkungen auf 10 erhöht wird.
- TBI-Ausrüstung
- Verwenden Sie ein speziell angefertigtes tragbares Gerät für die Verabreichung eines Schädel-Hirn-Traumas (Abbildung 2A) an den Mauskopf auf der rechten Seite, wie in Abbildung 2B dargestellt.
- Vorbereitung vor der Operation
- Autoklaven-Chirurgiegeräte, einschließlich normaler Scheren, eines chirurgischen Messschiebers, chirurgischer Federscheren, chirurgischer Pinzetten, Moskitopinzetten, Kopfpfostenstücke, Gaze und Applikatoren mit Baumwollspitze.
- Wiegen und notieren Sie das Körpergewicht der Maus 2 Stunden vor der Operation. Um Hirnödeme während der Implantation des Schädelfensters zu minimieren, injizieren Sie Dexamethason-Natriumphosphat in einer Dosis von 4,8 mg/kg [2 mg/ml, normalerweise ~70 μl (muss an zwei Stellen injiziert werden)] mit einer Insulinspritze in den Quadrizepsmuskel. Nach der Injektion von Dexamethason, aber vor Beginn der SHT-Operation, bereiten Sie die Glasfenster wie in Schritt 3.1 angegeben für die spätere Verwendung vor.
- Desinfizieren Sie die chirurgische Phase und die SHT-Ausrüstung mit 75 % Ethanol und erweitern Sie das sterile Einweg-OP-Tuch, um die Operationsphase auf der stereotaktischen Plattform abzudecken. Schalten Sie das Heizgerät und den Temperaturwächter ein und stellen Sie die Zieltemperatur auf 37 °C ein.
- Öffnen Sie das Ventil des Sauerstofftanks und stellen Sie den Sauerstofffluss auf 1,5 l/min ein. Öffnen Sie das Anästhesiegerät und stellen Sie den Isofluran-Wert auf drei ein.
HINWEIS: 100% reiner Sauerstoff kann dem Tier helfen, die SHT-Auswirkungen zu überleben. - Legen Sie die Maus in die Induktionskammer und lassen Sie sie 5 Minuten lang einwirken, um eine vollständige Anästhesie zu erreichen.
- Sobald die Maus vollständig betäubt ist (d. h. langsame, aber gleichmäßige Atemfrequenzen von etwa einem Zyklus pro 2 s, gepaart mit dem Fehlen eines Schwanzkneifreflexes), nehmen Sie die Maus aus der Induktionskammer und setzen Sie den Mauskopf in den stereotaktischen Rahmen.
- Legen Sie den Nasenkonus des Anästhesieschlauchs über die Schnauze der Maus.
- Halten Sie die Anästhesie mit 1,5 % Isofluran gemischt mit 100 % reinem Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1 l/min bis zum Ende der Operation aufrecht. Überprüfen Sie regelmäßig die Atemfrequenz und kneifen Sie während der Operation mindestens alle 15 Minuten in den Schwanz oder die Zehen, um eine angemessene Anästhesie zu beurteilen. Passen Sie die Isoflurankonzentration entsprechend an, um die gewünschte Anästhesietiefe aufrechtzuerhalten.
- Schädel-Hirn-Trauma
- Verabreichen Sie Buprenorphin (1 mg/kg, subkutan) mit Einweg-Insulinspritzen und tragen Sie Augensalbe auf die Augen der Maus auf.
- Entfernen Sie die Haare vom Oberkopf, indem Sie sie mit der Schere 1 trimmen und dann 1 Minute lang Enthaarungsmittel auftragen.
ACHTUNG: Tragen Sie das Enthaarungsmittel nicht länger als 3 Minuten auf die Kopfhaut auf, da es hautreizend ist. Vermeiden Sie es, Enthaarungsmittel auf die Augen der Maus zu bekommen. - Reinigen Sie die Kopfhaut mit Gaze und Applikatoren mit Wattespitze. Desinfizieren Sie dann die Haut, indem Sie zuerst 75% Ethanol und dann Betadin verwenden. Wiederholen Sie dies dreimal (d. h. Ethanol gefolgt von Betadin) und lassen Sie die letzte Anwendung von Betadin auf der Haut.
- Überprüfen Sie erneut die Anästhesietiefe, um sicherzustellen, dass die Maus vollständig betäubt ist (d. h. langsame, aber gleichmäßige Atemfrequenzen von etwa einem Zyklus pro 2 s, gepaart mit dem Fehlen eines Schwanzkneifreflexes). Spannen Sie die Haut mit einer chirurgischen Zange 3 ab und machen Sie einen 12-15 mm langen Mittellinienschnitt, der etwa 3 mm hinter den Augen beginnt.
- Schneiden Sie die Haut über der linken und rechten Schädelhälfte mit einer Federschere 2 heraus.
- Sobald der Schädel freigelegt ist, entfernen Sie die Knochenhaut, indem Sie sie vorsichtig mit einem sterilen Applikator mit Wattespitze reiben und mit steriler Kochsalzlösung spülen.
- Untersuchen Sie den Zustand des Schädels visuell, um sicherzustellen, dass er intakt ist, mit Ausnahme der beiden kleinen Löcher, die für die vorherige Virusinjektionsoperation gemacht wurden.
- Trocknen Sie den Schädelbereich und markieren Sie die SHT-Einschlagstelle an den folgenden Koordinaten: 2,5 mm hinter dem Bregma und 2 mm lateral von der sagittalen Naht nach rechts (Abbildung 2B).
- Nehmen Sie die Maus schnell aus dem stereotaktischen Rahmen und legen Sie den Kopf auf das Pufferkissen unter dem TBI-Gerät.
- Richten Sie die Impaktorspitze an der markierten Aufprallstelle aus.
- Heben Sie die Metallsäule an, indem Sie die angebundene Nylonschnur bis 15 cm über den Mauskopf ziehen und dann loslassen, so dass das Gewicht frei auf die Schallkopfstange fallen kann, die in Kontakt mit der Schädelspitze an der TBI-Stelle steht. Berühren Sie nicht den Mauskopf, wenn Sie den TBI-Aufprall ausführen.
- Bewegen Sie die Maus auf die Heizdecke und legen Sie sie auf den Rücken, während Sie den Atemstatus überwachen.
- Sobald sich die Maus von einer Rückenlage in eine Bauchlage aufrichtet, legen Sie die Maus für ~5 Minuten in die Isofluran-Induktionskammer mit 3 % Isofluran gemischt mit 100 % reinem Sauerstoff bei einer Flussrate von 1,5 l/min.
- Sobald die Maus vollständig sediert ist (d. h. langsame, aber gleichmäßige Atemfrequenz von etwa einem Zyklus pro 2 s, gepaart mit dem Fehlen eines Schwanzkneifreflexes), wiederholen Sie die Schritte 2.3.9-2.3.14, um insgesamt 10 Stöße zu erzielen.
HINWEIS: In unserer Studie wurde festgestellt, dass zehn SHT-Einwirkungen einen robusten Phänotyp mit geringer Maussterblichkeit induzieren (Daten noch nicht veröffentlicht). Die Parameter können angepasst werden, um einen anderen Schweregrad der Hirnverletzung zu erreichen, indem die Anzahl der Stöße und/oder die Höhe, aus der das Gewicht freigesetzt wird, erhöht oder verringert wird. Alle Parameter unterliegen der Genehmigung durch die örtliche IACUC. - Untersuchen Sie den Schädel unter dem Operationsmikroskop und entfernen Sie die Maus aus der Studie, wenn eine Schädelfraktur aufgetreten ist.
- Befolgen Sie bei einer Scheinoperation die gleichen Verfahren wie oben beschrieben, einschließlich der Platzierung des Tieres unter dem Impaktor, jedoch ohne die SHT-Aufpralle.
- Nachdem sich die Maus nach dem 10. SHT-Aufprall von einer Rückenlage in eine Bauchlage gebracht hat, legen Sie die Maus für ~5 Minuten in die Isofluran-Induktionskammer. Befolgen Sie die Schritte 2.2.6-2.2.8, um den Mauskopf für die unten beschriebene Schädelfensterimplantation auf den stereotaktischen Rahmen zu setzen.
3. Chirurgie der Schädelfensterimplantation
HINWEIS: Die folgenden Schritte zur Implantation des Schädelfensters wurden von Goldey et al.9 übernommen, und ihre Spezifikationen des Kopfpfostens und des Bildgebungsschachts wurden hier angewendet.
- Vorbereitung des Fensters
HINWEIS: Schließen Sie die Fenstervorbereitung in Schritt 2.2.2 ab, bevor Sie mit der SHT-Operation beginnen. Das Fenster besteht aus zwei runden Glasdeckgläsern (eines mit einem Durchmesser von 3 mm und eines mit 5 mm, wie in Abbildung 2C dargestellt), die durch transparenten optischen Klebstoff miteinander verbunden sind, wie unten beschrieben.- Desinfizieren Sie die Deckgläser, indem Sie sie 15 Minuten lang in 75%iges Ethanol tauchen. Nehmen Sie die Glasdeckgläser aus dem Ethanol und lassen Sie sie ~10 Minuten lang auf einer sterilen Oberfläche (z. B. dem Deckel einer sterilen 24-Well-Platte) trocknen.
- Füllen Sie eine Insulinspritze mit transparentem optischem Kleber und vermeiden Sie dabei Blasenbildung. Geben Sie unter Mikroskop 1 (Materialtabelle) bei 0,67-facher Vergrößerung einen kleinen Tropfen (~1 μl) optischen Kleber in die Mitte des 5-mm-Deckglases. Legen Sie dann sofort das 3-mm-Deckglas darauf und zentrieren Sie es mit dem 5-mm-Deckglas.
- Üben Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig Druck aus, um den Kleber gleichmäßig zu verteilen. Entsorgen Sie das Glasfenster, wenn sich um das 3 mm dicke Deckglas eine Blase oder Wand bildet.
- Um den Kleber auszuhärten, legen Sie die Deckgläser für 150 s mit einer Leistung von 20 x 100 μJ/cm2 in eine UV-Box. Vergewissern Sie sich, dass die beiden Deckgläser fest miteinander verbunden sind, indem Sie mit der Pinzette 4 vorsichtig an die Seite des 3-mm-Slips stoßen. Wenn sich das Deckglas bewegt, legen Sie es für weitere 60 s zurück in die UV-Box. Bewahren Sie das Glasfenster für die spätere Verwendung in einer sterilen 24-Well-Platte auf.
- Rauen Sie die Schädeloberfläche.
HINWEIS: Führen Sie von hier aus alle Schritte in Abschnitt 3 unter einem Operationsmikroskop durch. Beginnen Sie mit 10x und stellen Sie die gewünschte Vergrößerung ein.- Bohren Sie vorsichtig und langsam die Oberfläche des Schädels mit einem FG4-Hartmetallbohrer bei niedriger Rotordrehzahl (d. h. Ausgangszahl auf ~1-2 eingestellt), um das verbleibende Periost zu entfernen und eine raue Schädeloberfläche zu schaffen, so dass sich der Zahnzement sicher mit dem Schädel verbindet. Alternativ kann hier auch ein Skalpell anstelle eines Bohrers zum Einsatz kommen.
- Verwenden Sie Kochsalzlösung, um Knochenstaub von der Schädeloberfläche zu spülen und zu entfernen.
- Trenne die Muskeln.
HINWEIS: Die Muskeltrennung dient dazu, die Oberfläche des freiliegenden Schädelknochens zu vergrößern, der als Kontaktpunkt für den Zahnzement dient, wodurch die strukturelle Integrität des Implantats sichergestellt wird. Bei diesem Schritt der Muskeltrennung werden in der Regel ~3 mm der Schläfenschädelplatte freigelegt.- Etwa 5 mm hinter dem Auge, wo sich die Naht zwischen Parietal- und Schläfenschädel befindet, führen Sie vorsichtig die geschlossenen feinen Spitzen (#5/45 Pinzette) ein, um die seitlichen Muskeln vom Schädel zu trennen, und bewegen Sie die geschlossenen Spitzen vorsichtig in posteriorer Richtung bis zur Lambdoid-Naht.
- Trennen Sie die seitlichen Muskeln auf der Seite, auf der die Implantation des Schädelfensters stattfinden wird.
HINWEIS: Achten Sie darauf, die Muskeln nicht zu nah am Auge zu trennen, um eine Verletzung der Augenarterie zu vermeiden. Andernfalls kann es zu schweren und anhaltenden Blutungen kommen. Trennen Sie die Muskeln nicht vom Hinterhauptbein, da die Maus diese Muskeln benötigt, um ihren Kopf zu heben. - Waschen Sie die Ablagerungen mit Kochsalzlösung von der Operationsstelle ab und trocknen Sie den Bereich mit Gaze. Gelschaum kann auf die Operationsstelle aufgetragen werden, um die Blutung zu stoppen.
- Implantieren Sie den Kopfpfosten.
- Verwenden Sie einen speziell angefertigten Kopfpfosten aus Titan (Abbildung 2D), der in einer früheren Veröffentlichung9 beschrieben ist, um den Mauskopf während der Durchführung der Kraniotomieoperation und für die anschließende Zwei-Photonen-Bildgebung sicher zu fixieren.
- Verwenden Sie einen Filzstift und einen chirurgischen Messschieber, um den Umfang der Kraniotomie auf dem sauberen und trockenen Schädel auf der rechten Seite nachzuzeichnen. Der Mittelpunkt des nachgezeichneten Kreises liegt 2,5 mm hinter dem Bregma und 1,5 mm von der sagittalen Naht auf der rechten Hemisphäre entfernt. Der Durchmesser des nachgezeichneten Kreises beträgt ca. 3,2-3,5 mm und ist damit etwas größer als das 3 mm Glasdeckglas. Stellen Sie sicher, dass der Kraniotomiekreis die Virusinjektionsstellen (die beiden Löcher, die bei der Injektion des Virus entstehen, können als Referenz verwendet werden) und die SHT-Stelle abdecken kann.
- Lockern Sie die Ohrstange und drehen Sie den Kopf so, dass die Kraniotomieebene perfekt horizontal ist, und ziehen Sie dann die Ohrstange wieder fest.
- Verwende das Holzstäbchen eines Applikators mit Baumwollspitze, um zwei kleine Tropfen Sekundenkleber auf die vordere und hintere Kante des Kopfpfostens zu geben.
- Positionieren Sie den Kopfpfosten aus Titan über der Mitte der Kraniotomie und stellen Sie ihn schnell so ein, dass er in der gleichen Ebene liegt, in der das Schädelfenster implantiert wird. Üben Sie leichten Druck aus, bis der Sekundenkleber getrocknet ist. Dies dauert in der Regel ~30 s.
- Bereiten Sie Zahnzement in einer vorgekühlten Keramik-Mischschale vor (mindestens 10 Minuten in einem Gefrierschrank bei -20 °C bleiben): Mischen Sie 300 mg Zementpulver, sechs Tropfen schnelle Basisflüssigkeit und einen Tropfen Katalysator und rühren Sie die Mischung dann um, bis sie gründlich vermischt ist (~15 Mal).
HINWEIS: Der Zement muss pastös sein. Wenn es zu dünn ist, etwas mehr Zementpulver unterrühren. Wenn es zu dickflüssig ist, rühren Sie die schnelle Basisflüssigkeit tropfenweise ein, bis eine pastöse Konsistenz erreicht ist. - Tragen Sie schnell eine großzügige Menge Zahnzementmischung auf den äußeren Umfang des nachgezeichneten Umfangs auf und decken Sie die freiliegende Knochenoberfläche ab. Decken Sie jedoch nicht die Stelle der Kraniotomie ab. Lassen Sie den Zahnzement ~15 Minuten trocknen und aushärten, bevor Sie fortfahren.
- Lösen Sie die Ohrstange und befestigen Sie den Kopfpfosten am Metallrahmen, um sicherzustellen, dass der Kopf für ein präzises Bohren entlang des markierten Kraniotomieumfangs stabil ist. Wenn sich Zement über der Kraniotomiestelle befindet, verwenden Sie den FG4-Hartmetallbohrer, um ihn zu bohren und zu entfernen.
- Kraniotomie
- Verwenden Sie einen chirurgischen Messschieber, um den Durchmesser des markierten Kreises zu überprüfen, wie in Schritt 3.4.2 definiert. Passen Sie das nach Bedarf so an, dass das Schädelfenster genau in die Kraniotomie passt.
- Ätzen und verdünnen Sie mit einem elektrischen Zahnbohrer den Schädel entlang der Außenseite des markierten Kreises, wobei Sie zuerst einen FG4-Hartmetallbohrer verwenden (Geschwindigkeit auf eine Ausgabe von ~9-10 eingestellt). Dadurch entsteht eine "Spur", innerhalb derer der Schädel ausgedünnt wird.
VORSICHT: Um Hitzeschäden zu minimieren und eine gleichmäßige Spur zu erzielen, bewegen Sie den Bohrer weiter. Bohren Sie nicht länger als 2 s an derselben Stelle. - Stoppen Sie regelmäßig das Bohren und spülen Sie den gesamten Bereich mit steriler Kochsalzlösung, um die Erwärmung durch den Bohrer zu reduzieren und den Knochenstaub abzuwaschen.
- Fahren Sie mit der Verdünnung des Schädels mit einem FG1/4-Hartmetallbohrer fort, wie in Schritt 3.5.2 beschrieben, bis der Schädel hauchdünn und durchsichtig ist.
HINWEIS: Wenn Sie den Bohrer mit zwei Händen halten, können Sie den Bohrer leichter kontrollieren und vermeiden, dass der Bohrer in das Gehirn eingeführt wird. - Schließen Sie die Schädelausdünnung mit einem EF4-Hartmetallbohrer ab. Wenn ein Riss zwischen dem Knochenlappen und dem umgebenden Schädelknochen auftritt, kommt es manchmal zu einer Freisetzung von Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (CSF), was darauf hindeutet, dass der Schädel vollständig durchbohrt wurde.
- Fahre fort, den Rest des Schädels entlang der Spur auszudünnen und zu bohren. Vermeiden Sie es, durch die Stelle zu bohren, an der ein offensichtliches Gefäßsystem den Schädel kreuzt, um Blutungen zu verhindern.
- Führen Sie eine feine Pinzettenspitze (Pinzette 1) ~0,5 mm durch die gerissene Stelle und heben Sie den Knochenlappen vorsichtig nach oben, ohne das darunter liegende Gehirn einzudrücken.
- Nachdem der Knochenlappen entfernt wurde, spülen Sie den Kraniotomiebereich mit Kochsalzlösung. Die Hirnoberfläche kann 1-2 mm höher sein als der Rand der Kraniotomie.
- Beginnend mit diesem Schritt sollten Sie das freiliegende Gehirn immer mit Kochsalzlösung bedecken, um das Hirngewebe zu schützen.
- Beim Anheben des Knochenlappens an den ursprünglichen AAV-Injektionsstellen kann es aufgrund der Gewebeadhäsion und des Gefäßwachstums nach der Injektionsoperation zu Blutungen kommen. Wenn dies geschieht, drücken Sie die Stelle mit einem trockenen Applikator mit Baumwollspitze ~2 Minuten lang (oder länger nach Bedarf) vorsichtig an. Gelschaum kann verwendet werden, um die Blutung zu stoppen. Verwenden Sie keine Chemikalien oder Heizzangen, um die Blutung zu stoppen, da dies zu Verletzungen führen kann.
- Verwenden Sie die Pinzette 1, um die sichtbare Arachnoidea vorsichtig zu entfernen.
- Implantat-Glasfenster
- Verwenden Sie die chirurgische Pinzette 2, um das sterile Glasfenster mit dem 3 mm Glasdeckglas nach unten aufzunehmen. Platzieren Sie das Glasfenster über der Kraniotomiestelle und passen Sie es an, um sicherzustellen, dass das Fenster genau an den Rand der Kraniotomie passt. Das 5 mm Glasdeckglas befindet sich auf der Oberseite.
- Bereiten Sie den Zahnzement wie folgt vor: Mischen Sie 100 mg Zementpulver, zwei Tropfen schnelle Basisflüssigkeit und einen Tropfen Katalysator. Rühre die Mischung um, bis sie gründlich vermischt ist (~15 Mal). Warten Sie ~6 Minuten, bis der Zement pastös und dickflüssig wird. Wenn der Zement zu dünn ist, kann er in Schritt 3.6.4 in den Raum unter dem Fenster sickern und das Fenster verdecken.
- Während Sie darauf warten, dass der Zement pastös und dickflüssig wird, üben Sie mit einem stereotaktischen Manipulator einen ausreichenden Druck auf das Fenster aus, um zu überprüfen, ob der Schädel das Glasfenster sicher und fest berühren kann. Achten Sie darauf, dass die Zahnzementflüssigkeit in Schritt 3.6.4 nicht in den Raum unter dem Glas gelangt und somit das Fenster verdeckt.
- Verwenden Sie einen verstellbaren Präzisionsapplikatorpinsel, um eine kleine Menge Zement entlang der Fensterkante hinzuzufügen, um das Glasfenster mit dem Schädel zu versiegeln. Warten Sie ~10 Minuten, um den Zement vollständig trocknen zu lassen, und lassen Sie dann den Manipulator über dem Fenster vorsichtig los und entfernen Sie ihn. Ab diesem Schritt dauert es ~4 Stunden, um die 10 SHT-Schläge abzuschließen und den Kopfpfosten und das Schädelfenster zu implantieren.
- Schneiden Sie den Zahnzement mit dem Dentalbohrer mit einem FG4-Hartmetallbohrer ab, wenn das Fenster mit überschüssigem Zement bedeckt ist.
HINWEIS: Übermäßiger Zement um das Fenster herum kann verhindern, dass sich die Zwei-Photonen-Objektivlinsen der Fensteroberfläche nähern.
- Implantation des bildgebenden Brunnens
HINWEIS: Eine Bildgebungsvertiefung (Abbildung 2D) ist ein Gummiring mit einem Außendurchmesser von ~1,6 cm, der zur Oberseite des Kopfpfostens passt und Wasser über dem Schädelfenster für die Zwei-Photonen-Bildgebung hält.- Nachdem die Fensterimplantation abgeschlossen ist, bohren Sie die Zahnzementreste auf der Oberseite des Kopfpfostens weg und reinigen Sie den Bereich mit nasser chirurgischer Gaze. Lassen Sie den Bereich ~3 Minuten trocknen.
- Verwende einen Applikator mit Wattespitze, um eine kleine Menge Sekundenkleber einzutauchen und auf die Oberseite des Kopfpfostens zu kleben. Setze den Gummiring schnell auf den Kopfpfosten. Üben Sie ~2 min lang mittleren Druck auf den Gummiring aus, um einen engen Kontakt mit dem Kopfpfosten zu gewährleisten. Verwenden Sie Sekundenkleber sparsam, da er sonst an der Glasscheibe haften bleiben und die Zwei-Photonen-Abbildung verdecken kann.
- Verabreichung von Analgetika und Antibiotika
- Unmittelbar nach der Implantation des Bildgebungsbrunnens, aber vor dem Absetzen von Isofluran, Cefazolin [500 mg/kg (333 mg/ml, normalerweise ~45 μl), intramuskulär] und Meloxicam (5 mg/kg, subkutan) mit Einweg-Insulinspritzen verabreichen.
- Beenden Sie nach der Verabreichung des Medikaments die Anästhesie, befreien Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen und bringen Sie die Maus in ihren Heimatkäfig zurück, der sich über einer Heizdecke befindet.
- Beobachten Sie die Maus ~15 Minuten lang genau, bis sie gehfähig ist.
HINWEIS: Halten Sie die Mäuse einzeln, da sie bei anderen Mäusen gut in das Gummibild beißen können. Stellen Sie Futter- und Wassergel in der Nähe der Maus im Käfig bereit, damit sie nach Belieben zugänglich ist. - Buprenorphin (1 mg/kg, subkutan) und Meloxicam (5 mg/kg, subkutan) erneut alle 8 h nach der vorherigen Dosis bis 48 h nach der kranialen Fensterimplantationsoperation verabreichen.
4. Intravitale Zwei-Photonen-Bildgebung
- Verwenden Sie das Mikroskop 2 (Materialtabelle), ausgestattet mit einem durchstimmbaren kohärenten Multiphotonenlaser und einem Objektiv mit 20-facher Vergrößerung (NA 1.0; Wasserimmersion), für die intravitale Bildgebung18. Der für das EGFP-Signal verwendete Filter ist "BP 500-550".
- Bereiten Sie die kraniale Fenstermaus für die intravitale Bildgebung vor.
- Beginnend mit dem Operationstag (als Tag 0 bezeichnet) führen Sie eine Zwei-Photonen-Bildgebung zu festgelegten Zeitpunkten nach dem Schädel-Hirn-Trauma durch. Legen Sie die Maus aus dem Schädelfenster in die Anästhesie-Induktionskammer und verabreichen Sie 5 Minuten lang 3 % Isofluran gemischt mit Trägergas mit einer Flussrate von 1,5 l/min.
HINWEIS: Das Trägergas kann entweder Raumluft oder 100% Sauerstoff sein. - Sobald die Maus vollständig betäubt ist (d. h. langsame, aber gleichmäßige Atemfrequenz von etwa einem Zyklus pro 2 s, gepaart mit dem Fehlen eines Schwanz-Kneif-Reflexes), entfernen Sie die Maus aus der Induktionskammer und klemmen Sie den Kopfpfosten schnell an eine Halterung. Lassen Sie den Rumpf der Maus auf einer runden Plastikplatte (19 cm Durchmesser) liegen, die mit der Halterung ausgestattet ist.
HINWEIS: Ein handwarmes Pad wurde unter den Oberkörper der Maus gelegt, um die Wärme während der intravitalen Bildgebung zu unterstützen. - Tragen Sie die Gleitmittel-Augensalbe auf die Augen der Maus auf und legen Sie den Nasenkonus des Anästhesieschlauchs über die Schnauze der Maus. Aufrechterhaltung der Anästhesie durch Verwendung von 1,5 % Isofluran mit Trägergas bei einer Durchflussrate von 1 l/min.
- Überprüfen Sie regelmäßig die Atemfrequenz und kneifen Sie während der Bildgebung mindestens alle 15 Minuten in den Schwanz oder die Zehen, um eine angemessene Anästhesie zu beurteilen. Passen Sie die Isoflurankonzentration entsprechend an, um die gewünschte Anästhesietiefe aufrechtzuerhalten.
- Richten Sie den Mauskopf so aus, dass sich das Schädelfenster direkt unter der Zwei-Photonen-Objektivlinse befindet. Geben Sie etwas Wasser in die Bildmulde oberhalb des Schädelfensters. Senken Sie das Objektiv ab, so dass es in das Wasser eingetaucht ist.
- Beginnend mit dem Operationstag (als Tag 0 bezeichnet) führen Sie eine Zwei-Photonen-Bildgebung zu festgelegten Zeitpunkten nach dem Schädel-Hirn-Trauma durch. Legen Sie die Maus aus dem Schädelfenster in die Anästhesie-Induktionskammer und verabreichen Sie 5 Minuten lang 3 % Isofluran gemischt mit Trägergas mit einer Flussrate von 1,5 l/min.
- Intravitale Bildgebung von Mäusen im intrakraniellen Fenster
- Schalten Sie die Quecksilberlampe des Oszilloskops ein. Betrachten Sie das Gehirn zuerst mit Epifluoreszenz durch das Auge.
HINWEIS: Das Gefäßsystem erscheint schwarz. Wählen Sie einen Bereich aus, in dem das Fenster leer ist. Schalten Sie die Epifluoreszenz aus, stellen Sie die Laserwellenlänge für das EGFP-Signal auf 860 nm ein und passen Sie die Lasereinstellung für ein optimales (d. h. helles, aber nicht gesättigtes) Signal an. - Stellen Sie den Scanmodus auf Frame und den Zeilenschritt auf 1 ein. Legen Sie die Mittelungszahl auf 16, die Bittiefe auf 8 Bit, den Modus auf Linie und die Methode auf Mittelwert fest.
- Verwenden Sie das Gefäßmuster als "Referenzkarte", um dieselbe Hirnregion für die anschließende Längsschnittbildgebung abzubilden. Abbildung der oberflächlichen Ebene (Schicht I, weniger als 100 μm von der meningealen Oberfläche entfernt) für drei Ebenen, in denen das kortikale Gefäßsystem dominiert, durch einen Z-Stapel-Modus mit einem Zwischenebenenintervall von 10 μm, wie in Abbildung 3A dargestellt.
- Bilden Sie sechs Ebenen in der Tiefe (Schicht IV und V, ~400 μm tiefer als die oberflächliche Ebene) über einen Z-Stapel-Modus ab, wie in Abbildung 3A dargestellt, mit einem Zwischenebenenintervall von 10 μm und einer Scangeschwindigkeit von 8.
- Nach Beendigung der Bildgebung (~20 Minuten pro Maus) brechen Sie die Anästhesie ab, lösen Sie die Maus aus den Rahmen und bringen Sie sie in ihren Heimkäfig zurück, der sich über einer Heizdecke befindet. Überwachen Sie die Maus nacheinander, bis sie gehfähig ist, was normalerweise ~7 Minuten dauert.
- Längsaufnahme der Maus am Tag 0, 1 Woche und 4 Monate nach der SHT-Operation.
- Schalten Sie die Quecksilberlampe des Oszilloskops ein. Betrachten Sie das Gehirn zuerst mit Epifluoreszenz durch das Auge.
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Representative Results
Als Proof of Concept für dieses Protokoll wurden Viruspartikel, die AAV-Syn1-EGFP exprimieren, im Alter von 3 Monaten in die Hirnrinde von männlichen TDP-43 Q331K/Q331K-Mäusen (C57BL/6J-Hintergrund)19 injiziert. Es wird darauf hingewiesen, dass auch Wildtyp-C57BL/6J-Tiere verwendet werden können, diese Studie wurde jedoch an TDP-43Q331K/Q331K-Mäusen durchgeführt, da sich das Labor auf die Erforschung neurodegenerativer Erkrankungen konzentriert. Eine SHT-Operation wurde 4 Wochen nach der AAV-Injektion durchgeführt. In der gleichen chirurgischen Umgebung wurden der Kopfpfosten und das Schädelfenster implantiert. Die Maus wurde mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop am Tag 0, 1 Woche und 4 Monate nach der SHT-Operation seriell aufgenommen (Abbildung 1). Im Allgemeinen dauerte die Injektionsoperation ~30 Minuten und die SHT-Operation ~1 Stunde pro Maus. Während der SHT-Operation brauchten die Mäuse im Allgemeinen eine längere Zeitspanne, um sich nach nachfolgenden Stößen von einer Rückenlage in eine Bauchlage aufzurichten, verglichen mit den ersten Stößen. Zum Beispiel könnte eine Maus nach dem ersten Aufprall 2 Minuten gebraucht haben, um ihre Position zu korrigieren, aber nach dem 10. Aufprall 10 Minuten, um ihre Position zu korrigieren. Bei der Implantation des Schädelfensters waren in der Regel ~3 h erforderlich, um alle Schritte durchzuführen, dauerte aber länger als nötig, wenn anhaltende Blutungen auftraten. Bei der Zwei-Photonen-Bildgebung wurden in der Regel 20 Minuten pro Maus benötigt, um alle Bilder aufzunehmen. In der aktuellen Studie mit drei Mäusen mit der Expression von EGFP zeigten die Tiere weder Hinweise auf eine Schädelfraktur, noch starben sie während der Operation oder bis zu 4 Monate nach der Operation. Sowohl die Morbiditäts- als auch die Schädelfrakturrate lagen bei 0%. Dies steht im Einklang mit der relativ niedrigen Mortalitätsrate (<10 %) in einem ähnlichen Modell zur Induktion eines Schädel-Hirn-Traumas, jedoch ohne Schädelfensterimplantat 7,8.
Eine Vorrichtung zum Gewichtsabfall (Abbildung 2A), über die bereits berichtet wurde7,8, wurde verwendet, um SHT-Stöße auf den Mauskopf auf der rechten Seite abzugeben, wie in Abbildung 2B dargestellt. Ein transparentes Kunststoffrohr (Nr. 5 in Abbildung 2A; 60 cm Länge und 1,4 cm Innendurchmesser) wurde sicher und vertikal an eine Metallhalterung geklemmt, und eine Kunststoff-Impaktorsäule (Nr. 7 in Abbildung 2A; 10 cm lang und 1,3 cm im Durchmesser, mit einer flachen runden Spitze von 2 mm Durchmesser) wurde in das vertikale Rohr eingesetzt. Ein 50 g schweres Metallgewicht (Nr. 6 in Abbildung 2A) wurde über dem Impaktor platziert und mit einer Nylonschnur (Nr. 4 in Abbildung 2A) verbunden. Ein Pufferkissen (Nr. 8 in Abbildung 2A; 9 cm x 9 cm x 1 cm [Länge x Breite x Tiefe], aus Polyethylenschaum und Baumwollgaze) wurde unter den Mauskopf gelegt, um die Aufprallenergie zu puffern und zu absorbieren.
Das Schädelfenster bestand aus zwei gläsernen Deckgläsern, die mit optischem Klebstoff verbunden waren (Abbildung 2C), und das Deckglas aus Glas mit einem Durchmesser von 3 mm war die Seite, die die Gehirnoberfläche berührte. Die Zwei-Photonen-Bildgebung wurde in zwei verschiedenen Tiefen (Abbildung 3A) von der Gehirnoberfläche aus durchgeführt: 1) auf einer oberflächlichen Ebene, auf der das kortikale Gefäßsystem reichlich vorhanden war und einen relativ großen Lumendurchmesser aufwies, der schwarz erschien, aber mit spärlichen EGFP-positiven Zellkörpern; und 2) eine tiefere Ebene, in der das Gefäßsystem spärlich war und einen kleinen Lumendurchmesser aufwies, mit vielen EGFP-positiven Zellen.
~4 h (Tag 0) nach der Operation wurde eine Zwei-Photonen-Bildgebung in drei Ebenen durchgeführt, mit einem Intervall von 10 μm auf oberflächlicher Ebene (Schicht I, weniger als 100 μm von der meningealen Oberfläche) zuerst, wo das Gefäßsystem schwarz erschien (gekennzeichnet durch die gestrichelten roten Linien in Abbildung 3B), und wurde als Referenzkarte für die nächste Bildgebungssitzung verwendet, um die ursprüngliche Bildgebungsregion zu lokalisieren. Auf dieser oberflächlichen Ebene waren das kortikale Gefäßsystem und die neuronalen Prozesse die vorherrschenden Strukturen, die beobachtet werden konnten, während die EGFP-positiven Zellkörper spärlich waren. Nach der Bildgebung innerhalb der oberflächlichen Ebene wurde der Fokus um ~400 μm, tiefer als die oberflächliche Ebene, nach unten in den Kortex (Schicht IV und V) angepasst, um die EGFP-positiven neuronalen Zellkörper abzubilden. Die Bilder wurden innerhalb von sechs Ebenen mit einem Intervall von 10 μm aufgenommen. Die Expression des EGFP-Proteins war diffus im gesamten Zellkörper verteilt, wie in Abbildung 3C dargestellt. Gelegentlich traten einige EGFP-Punkte außerhalb der Zellkörper auf, die EGFP-Einschlüsse darstellen könnten, die sich im Laufe der Zeit innerhalb von Axonen oder Dendriten gebildet haben. Dieses Protokoll führt zu einer AAV-SYN1-EGFP-Expression von ~2-3 mm um die Injektionsstelle herum, die durch histologische Analyse von postmortalem Gewebe definiert werden kann.
1 Woche und 4 Monate nach dem SHT wurde das Gefäßmuster, das zum Zeitpunkt des Tages 0 beobachtet wurde, als Referenz verwendet, um dieselbe Bildgebungsregion zu lokalisieren (Abbildung 3D, F). Das Gefäßmuster in Abbildung 3D,F ähnelt dem in Abbildung 3B. Das bildgebende Verfahren für die Zeit von 1 Woche und 4 Monaten nach dem SHT war das gleiche wie das oben beschriebene für den Zeitpunkt von Tag 0, und die EGFP-Expression wurde wie zuvor im gesamten Zellkörper nachgewiesen (Abbildung 3E, G). Die Fluoreszenzintensität an Tag 0 und 4 Monaten war sowohl auf der oberflächlichen als auch auf der tieferen Ebene ähnlich. Die Fluoreszenzintensität nach 1 Woche war jedoch sowohl auf der oberflächlichen als auch auf der tiefen Ebene niedriger als an Tag 0 und 4 Monaten, was auf die translationale Repression zurückzuführen sein könnte, die für andere SHT-Modelle berichtet wurde20. Bemerkenswert ist, dass die Qualität der Bilder nach 4 Monaten im Vergleich zum Zeitpunkt von Tag 0 zeigt, dass das kraniale Fenster klar und integer geblieben ist und dass die virale Expression 4 Monate nach der Operation immer noch robust ist, um eine effektive intravitale Bildgebung zu ermöglichen. Da EGFP als relativ diffuses Protein exprimiert wird, können die Fluoreszenzsignale besser aufgelöst und diskret sein, wenn EGFP mit einem Protein von Interesse fusioniert wird.
Abbildung 1: Der Zeitplan für dieses intravitale Bildgebungsprotokoll . Das Protokoll wird mit einer Virusinjektion eingeleitet. SHT und Schädelfensterchirurgie werden innerhalb derselben Operationssitzung 2-4 Wochen nach der Virusinjektion durchgeführt. Die intravitale Bildgebung wird am Tag 0, 1 Woche, 4 Monate nach dem SHT durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Diagramme für das SHT-Gerät, die SHT-Aufprallstelle und die Fenstervorbereitung . (A) Ausrüstung für das TBI-Gerät zur Gewichtsabnahme. 1: Sockel, 2: Halterung, 3: verstellbare Klemme, 4: Nylonschnur, 5: Gewichtsabwurftunnel, 6: Gewichtssäule aus Metall (50 g), 7: Impaktor, 8: Pufferkissen. (B) Eine schematische Darstellung der Virusinjektions- und SHT-Einschlagstelle mit den Koordinaten 2,5 mm hinter dem Bregma und 2 mm lateral von der sagittalen Naht nach rechts. (C) Ein Schema für die Vorbereitung des Glasfensters. Zwei Deckgläser aus Glas mit einem Durchmesser von 3 mm und 5 mm werden mit optischem Kleber kombiniert. (D) Bilder des Kopfpfostens aus Metall und des Abbildungsschachts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Abbildungsebenen und der Bilddaten . (A) Mehrere Ebenen werden auf einer oberflächlichen Ebene, auf der sich das Gefäßsystem befindet, und auf einer tiefen Ebene abgebildet. Die Bilder sind wie folgt aufgebaut: drei Ebenen auf der oberflächlichen Ebene, wo das kortikale Gefäßsystem und die neuronalen Fortsätze die vorherrschenden EGFP-positiven Strukturen sind, und sechs Ebenen auf der tiefen Ebene, wo überwiegend EGFP-positive Zellkörper beobachtet werden, mit einem Abstand von 10 μm zwischen den benachbarten Ebenen. Jede Ebene hat eine Größe von 425,10 μm x 425,10 μm. (B) Repräsentatives Bild eines Flugzeugs in der oberflächlichen Ebene zum Zeitpunkt des Tages 0. Die gestrichelten roten Linien zeigen den Gefäßumriss an, der als Referenz verwendet werden kann, um den ursprünglichen Bildgebungsort für nachfolgende Zeitpunkte zu lokalisieren. (C) Repräsentatives Bild eines Flugzeugs in der Tiefe zum Zeitpunkt des Tages 0 kurz nach dem Schädel-Hirn-Trauma. (D) Repräsentatives Bild eines Flugzeugs in der oberflächlichen Ebene zum Zeitpunkt von 1 Woche. Die gestrichelten roten Linien kennzeichnen das Gefäßsystem, ähnlich dem Umriss an Tag 0 in Abbildung 3B, was bestätigt, dass die Zwei-Photonen-Bildgebung an einem ähnlichen Ort an Tag 0 und 1 Woche nach dem SHT durchgeführt wurde. (E) Repräsentatives Bild in der Tiefenebene zum Zeitpunkt von 1 Woche nach dem SHT. (F) Wie B und D, 4 Monate nach dem SHT. (G) Wie C und E, 4 Monate nach dem SHT. Maßstab: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In dieser Studie wurden AAV-Injektion, SHT-Verabreichung und ein Headpost mit kranialer Fensterimplantation für die longitudinale Bildgebungsanalyse von EGFP-markierten Neuronen innerhalb des Hirnkortex der Maus (Schichten IV und V) kombiniert, um die Auswirkungen von SHT auf kortikale Neuronen zu beobachten. Diese Studie stellt fest, dass die hier gewählte SHT-Stelle, oberhalb des Hippocampus, eine relativ flache und breite Oberfläche für die Implantation des Schädelfensters bietet. Umgekehrt ist der Schädel vor dieser Stelle relativ schmal, und daher ist es schwierig sicherzustellen, dass der Kopfpfosten effektiv die Oberfläche des Schädels berührt. Obwohl in dieser Studie nur das TDP-43 Q331K/Q331K-Mausmodell verwendet wurde, sollte dieses Protokoll in Anbetracht der Forschung des Labors, die sich auf ALS und FTD19 konzentriert, auf die meisten anderen Mausstämme anwendbar sein. Neben der Markierung von Neuronen, wie hier beschrieben, können verschiedene Strategien verwendet werden, um andere Zelltypen für die intravitale Bildgebung zu markieren. Ein Ansatz besteht darin, die genetisch kodierten fluoreszierenden Proteine zellspezifisch zu exprimieren, indem das Cre-Lox-Rekombinationssystem in genetisch veränderten Mäusenverwendet wird 21. Ein weiterer Ansatz besteht darin, bestimmte virale Serotypen für die zellspezifische Transduktion genetisch kodierter fluoreszierender Proteine einzusetzen. Die ortsspezifische Verabreichung kann erreicht werden, indem die intrakranielle Injektion an der gewünschten Stelle im Gehirn durchgeführt wird. Die Effizienz und Leichtigkeit, mit der man zellspezifische Proteine über virale Transduktion für die intravitale Bildgebung exprimieren kann, ist ein Vorteil gegenüber der Erstellung transgener Mausmodelle.
Für die Operationsprotokolle gibt es mehrere kritische Schritte, die sorgfältig durchgeführt werden müssen. Beim Bohren von Löchern in den Schädel für die Virusinjektion zu Beginn des Protokolls muss man vorsichtig sein, um das Gewebe unter dem Schädel nicht zu beschädigen. Wenn beim Bohren des Schädels eine Gewebeschädigung auftritt, kommt es zu Entzündungen, Gewebeadhäsionen und Angiogenese um die Verletzungsstelle herum, wodurch das Risiko von Blutungen während der Kraniotomie für die Implantation des Schädelfensters erhöht wird. Für die Verabreichung des SHT mit dem Weight-Drop-Gerät wurde in der vorliegenden Studie ein Kissen unter den Mauskopf gelegt, um die SHT-Aufprallkraft zu puffern und dadurch die Wahrscheinlichkeit einer Schädelfraktur zu verringern. Es wurden keine offensichtlichen Kopfbewegungen in Rotationsrichtungen und Beschleunigungen beobachtet, was die Annahme unterstützt, dass dieses SHT-Modell eine relativ geringe Wahrscheinlichkeit einer axonalen Diffusionsverletzung hat. Interessanterweise verwendeten Foda et al. ein ähnliches Gewichtsabfallgerät, um eine Schädel-SHT-Verletzung bei Ratten zu konstruieren, und ein größeres, weiches Schaumstoffkissen (12 cm dick) wurde unter den Rattenkopf gelegt, so dass er sich leicht als Reaktion auf die TBI-Aufprallkraft in Rotationsrichtung mit Beschleunigung bewegen konnte, was zu einer axonalen Diffusionsverletzungführte 22. Einer der Vorteile des röhrenführenden TBI-Modells besteht darin, dass die Schwere des Traumas moduliert werden kann, indem die Höhe des Gewichtsabfalls geändert wird (d. h. eine höhere Höhe für eine größere Kraft) und/oder die Anzahl der Male wiederholt wird, mit denen der Aufprall ausgeführt wird. Zum Beispiel verwendeten Flierl et al. ein ähnliches Gerät zur Gewichtsabnahme wie in der vorliegenden Studie, um ein Schädel-Hirn-Trauma bei Mäusen zu induzieren; Das Gewicht des Metalls betrug 333 g, was bei einem Sturz aus einer Höhe von 2 cm zu einem leichten Schädel-Hirn-Trauma und bei einem Sturz aus einer Höhe von 3 cm zu einem schweren Schädel-Hirn-Trauma führte23. Die Kraniotomie vor der Fensterimplantation muss ebenfalls sorgfältig durchgeführt werden, um eine Schädigung des Hirngewebes unter dem Schädel zu vermeiden. Das regelmäßige Bewegen des Bohrers in eine andere Region des Schädels hilft, ein Überbohren an derselben Stelle zu vermeiden, was zu übermäßiger Erwärmung, Gewebeschäden und Blutungen führen kann. Darüber hinaus kann auch eine häufige Bewässerung mit Kochsalzlösung die Bohrstelle kühlen. Bei der Implantation des Glasfensters ist es wichtig, die Glasebene so auszurichten, dass sie parallel zur Schädeloberflächenebene verläuft. Ein eng anliegendes Fenster im Schädel verhindert das Austreten der Zahnzementflüssigkeit in den Raum zwischen dem Fenster und dem Gehirn.
Wenn das Fenster am Tag 0 nach der SHT-Operation verschwommen ist, aber fluoreszierende Signale erkannt werden, kann der Zahnzement in den Raum zwischen dem Fenster und dem Gehirn eingedrungen sein und dadurch eine Zementschicht gebildet haben, die die Gehirnoberfläche bedeckt und die Fluoreszenzemission verdunkelt. In dieser Situation kann man das Fenster und den Zahnzement mit der in Protokollschritt 3.5 beschriebenen Bohrmethode entfernen und dann ein neues Glasfenster an der ursprünglichen Stelle implantieren, wie von Goldey et al.9 ausführlich beschrieben. Wenn das Fenster zu einem späteren Zeitpunkt während des Längsbildgebungsprozesses verschwommen wird, kann man versuchen, potenzielle Ablagerungen zu entfernen, indem man das Fenster vorsichtig mit einem Applikator mit Wattespitze reibt. Wenn das Problem dadurch nicht behoben wird, kann es am Nachwachsen des Knochens und der Hirnhäute unter dem Glasfenster liegen. In diesem Fall kann man das Fenster entfernen und bohren, um den nachgewachsenen Knochen zu entfernen und/oder die Hirnhäute auseinanderzupfen und zu entfernen, gefolgt von der Implantation eines neuen Glasfensters an der ursprünglichen Stelle, wie von Goldey et al.9 beschrieben. Wie die Ergebnisse zeigen, ist die EGFP-Expression und Fluoreszenz über einen Zeitraum von ~4 Monaten nach dem SHT robust. Es ist mit einer Abnahme des Fluoreszenzsignals innerhalb der ersten Woche nach dem SHT zu rechnen, was wahrscheinlich auf eine SHT-induzierte translationale Repression zurückzuführen ist, die zu einer vorübergehenden Verringerung der globalen Proteinsynthese führt20.
Um eine hohe Bildgebungsqualität aufrechtzuerhalten und eine Bildgebung in mehreren Ebenen zu erreichen, wurden die Mäuse unter Isofluran-Anästhesie gesetzt, um die Bewegung einzuschränken. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Anästhesie die Studienergebnisse beeinflussen kann. Zum Beispiel wurde berichtet, dass Mäuse unter Isofluran-Anästhesie eine andere Mikrogliaaktivität als Reaktion auf Lichtschäden im Vergleich zu wachen Mäusen aufweisen24. Bei der Zwei-Photonen-Bildgebung sind die Scangeschwindigkeit und die Anzahl der Scans für die Signalmittelung (eingestellt als "Zahl", unter "Mittelwertbildung") die Hauptfaktoren, die die Bildauflösung bestimmen können. Um die Auflösung zu optimieren, kann man die Scangeschwindigkeit verringern und die Mittelungszahl erhöhen, aber eine langsamere Geschwindigkeit und eine höhere Mittelungszahl erhöhen die Bildgebungszeit für ein bestimmtes Sichtfeld und können zu einer Ausbleichung des Fotos führen. Die vorliegende Studie zielt darauf ab, chronische Langzeit-Bildgebung am selben Tier an der gleichen Gehirnstelle durchzuführen. Um ein mögliches Ausbleichen des Fotos zu vermeiden und gleichzeitig eine ausreichende Auflösung zu erreichen, wurde die Zwei-Photonen-Bildgebung mit einer Scangeschwindigkeit von 8 und einer Mittelungszahl von 16 durchgeführt.
Ein alternativer Ansatz zur Durchführung einer Kraniotomie und Implantation eines Glasfensters besteht darin, den Schädel so weit auszudünnen, dass er für die Live-Bildgebung transparent und "hauchdünn" ist25,26,27. Das dünne Schädelfenster kann die Unversehrtheit des Schädels erhalten und so die durch den chirurgischen Eingriff hervorgerufene Entzündung vermeiden. Daher kann der Thin-Skull-Window-Ansatz für die Live-Bildgebung mit entzündungsrelevanten Markern und/oder über einen relativ kürzeren Zeitraum (d. h. ~14 Tage nach der Operation, wie berichtet25) bevorzugt werden. Für die Langzeitbildgebung (d. h. 4 Monate, wie hier beschrieben) chronischer neurodegenerativer Prozesse wird neben der Beurteilung der akuten Auswirkungen eines SHT auf dasselbe Tier empfohlen, ein Glasfenster zu verwenden, das durch eine Kraniotomiemethode implantiert wird.
Wie in der Einleitung erwähnt, gibt es mehrere bemerkenswerte Vorteile der intravitalen Bildgebung für die Untersuchung verschiedener biologischer und pathologischer Ereignisse im Gehirn von Säugetieren. Es gibt jedoch auch einige Einschränkungen dieses Protokolls. Zum Beispiel beschreibt die Contrecoup-Hirnverletzung die Gehirnprellung oder das Hämatom, das von der Kraftkontaktstelle28, 29, 30 entfernt ist, normalerweise entgegengesetzt zu ihr. In der vorliegenden Studie wurden die SHT-Auswirkungen auf den Parietallappen übertragen; Eine Contrecoup-Schädigung wäre ventral zu erwarten und für die intravitale Bildgebung unzugänglich. Eine histologische Analyse könnte als ergänzender Ansatz verwendet werden, um Phänotypen von Interesse außerhalb der vom Schädelfenster abgedeckten Einschlagstelle weiter zu untersuchen. Darüber hinaus kann auch eine exogene Überexpression bestimmter Proteine Toxizität oder Pathologie hervorrufen. In der vorliegenden Studie wurden gelegentlich EGFP-Puncta beobachtet, die eine Anhäufung aufgrund einer Proteinüberexpression darstellen können. Daher wird empfohlen, ein Negativkontrollprotein (z. B. EGFP oder RFP allein) in das Studiendesign aufzunehmen, um diese Möglichkeit zu adressieren, insbesondere wenn das interessierende Protein zur Bildung von punktförmigen Strukturen neigt. Die Anzahl der Proteine, die man gleichzeitig untersuchen kann, ist durch die Laser und die Fähigkeiten des Zwei-Photonen-Systems begrenzt. Es kann möglich sein, mehr als einen Fluorophor (z. B. EGFP, RFP usw.) durch Zwei-Photonen-Mikroskopie abzubilden, obwohl die Multiplexing-Fähigkeiten mit herkömmlichen Weitfeld- und konfokalen Mikroskopen oft die Analyse von mehr Proteinen innerhalb einer einzigen Gewebeprobe ermöglichen. Schließlich ist es wichtig, eine Scheinkontrolle einzubeziehen, die die gleichen Verfahren wie das SHT-Tier erhält, mit Ausnahme der Auswirkungen des Gewichtsverlusts. Die Schädelfensterimplantation ist ein invasiver Eingriff und kann einige lokale Veränderungen verursachen, wie z. B. Entzündungen und veränderten Hirndruck, die den SHT-Prozess beeinträchtigen können. Eine Scheinkontrolle hilft dem Experimentator, Phänotypen zu beurteilen, die auf den Aufprall im Vergleich zu den chirurgischen Eingriffen zurückzuführen sind.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll eine Methode zur longitudinalen Abbildung von Proteinen speziell in den Neuronen der Hirnrinde von Mäusen als Reaktion auf SHT vorstellt. Dieses Protokoll kann modifiziert werden, um die Expression und Lokalisation verschiedener zellspezifischer Proteine als Reaktion auf SHT zu analysieren. Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen Ansatz für die Untersuchung der unmittelbaren und langfristigen Folgen von SHT im Gehirn von Säugetieren zu liefern.
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Disclosures
Es werden keine Interessenkonflikte deklariert.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Miguel Sena-Esteves von der University of Massachusetts Chan Medical School für das Geschenk des AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP-Virus und Debra Cameron von der University of Massachusetts Chan Medical School für das Zeichnen der Mausschädelskizze. Wir danken auch aktuellen und ehemaligen Mitgliedern der Labore Bosco, Schäfer und Henninger für ihre Vorschläge und Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom Verteidigungsministerium (W81XWH202071/PRARP) für DAB, DS und NH finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
| BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
| Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
| Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
| Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
| Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
| Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
| Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
| Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
| Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
| Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
| Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
| Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
| Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
| Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
| Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
| Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
| Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
| Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
| Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
| Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
| Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
| Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
| Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
| Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
| Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
| surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
| Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
| Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
| Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |
References
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