Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bestemmelse av vaksineimmunogenisitet ved bruk av dendrittiske celler fra bovint monocytt

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/64874
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1
1Animal Production and Health Section, Joint Food and Agriculture Organization (FAO)/International Atomic Energy Agency (IAEA) Centre of Nuclear Techniques in Food and Agriculture, International Atomic Energy Agency, 2Teaching and Research Farm Kremesberg, Clinical Unit for Herd Health Management in Ruminants, Department for Farm Animals and Veterinary Public Health, University of Veterinary Medicine, Vienna

Summary

Metodikken beskriver genereringen av bovine monocytt-avledede dendrittiske celler (MoDCs) og deres anvendelse for in vitro-evaluering av antigenkandidater under utvikling av potensielle veterinære vaksiner hos storfe.

Abstract

Dendrittiske celler (DC) er de mest potente antigenpresenterende cellene (APCs) i immunsystemet. De patruljerer organismen på jakt etter patogener og spiller en unik rolle i immunsystemet ved å knytte de medfødte og adaptive immunresponsene. Disse cellene kan fagocytisere og deretter presentere fangede antigener til effektorimmunceller, noe som utløser et mangfoldig utvalg av immunresponser. Denne artikkelen demonstrerer en standardisert metode for in vitro-generering av bovine monocytt-avledede dendrittiske celler (MoDCs) isolert fra mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) og deres anvendelse i evaluering av vaksineimmunogenisitet.

Magnetbasert cellesortering ble brukt for å isolere CD14+-monocytter fra PBMC, og tilskudd av komplett dyrkningsmedium med interleukin (IL)-4 og granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) ble brukt for å indusere differensiering av CD14+-monocytter til naive MoDCer. Genereringen av umodne MoDC-er ble bekreftet ved å påvise ekspresjonen av store histokompatibilitetskompleks II (MHC II), CD86 og CD40 celleoverflatemarkører. En kommersielt tilgjengelig rabiesvaksine ble brukt til å pulsere de umodne MoDCene, som senere ble dyrket sammen med naive lymfocytter.

Flowcytometrianalysen av antigenpulserte MoDCs og lymfocytt-kokultur avslørte stimulering av T-lymfocyttproliferasjon gjennom ekspresjon av Ki-67-, CD25-, CD4- og CD8-markører. Analysen av mRNA-ekspresjonen av IFN-γ og Ki-67, ved bruk av kvantitativ PCR, viste at MoDCs kunne indusere antigenspesifikk priming av lymfocytter i dette in vitro co-kultursystemet. Videre viste IFN-γ sekresjon vurdert med ELISA en signifikant høyere titer (**p < 0,01) i kokulturen av rabiesvaksinepulserte MoDC-lymfocytter enn i ikke-antigenpulsert MoDC-lymfocytt-samkultur. Disse resultatene viser gyldigheten av denne in vitro MoDC-analysen for å måle vaksineimmunogenisitet, noe som betyr at denne analysen kan brukes til å identifisere potensielle vaksinekandidater for storfe før de fortsetter med in vivo-studier , samt i vaksineimmunogenisitetsvurderinger av kommersielle vaksiner.

Introduction

Veterinærvaksinering representerer en viktig del av dyrehold og helse, da det bidrar til å forbedre matsikkerhet og dyrevelferd ved å gi beskyttelse mot sykdommer som påvirker husdyrsektoren globalt1. En effektiv in vitro-metode for å vurdere immunogeniteten til mulige vaksinekandidater vil bidra til å akselerere prosessen med vaksineutvikling og produksjon. Det er derfor nødvendig å utvide feltet immunanalyser med innovative metoder basert på in vitro-studier , da dette vil bidra til å avdekke kompleksiteten i immunprosessene relatert til immunisering og patogeninfeksjon. For tiden brukes in vivo dyreimmuniserings- og utfordringsstudier, som krever periodisk prøvetaking (f.eks. blod og milt), til å måle immunogeniteten til kandidatvaksiner og adjuvanser. Disse analysene er dyre, tidkrevende og har etiske implikasjoner, fordi i de fleste tilfeller utføres dyreavlivning ved slutten av forsøkene.

Som et alternativ til in vivo-analyser har mononukleære celler i perifert blod (PBMC) blitt brukt til å evaluere vaksineinduserte immunresponser in vitro2. PBMC er en heterogen populasjon av celler sammensatt av 70%-90% lymfocytter, 10%-20% monocytter og et begrenset antall dendrittiske celler (DCs, 1%-2%)3. PBMCs har antigenpresenterende celler (APCs) som B-celler, monocytter og DCs, som kontinuerlig patruljerer organismen på jakt etter tegn på infeksjon eller vevskader. Lokalt utskilte kjemokiner letter rekruttering og aktivering av APCer til disse stedene ved å binde seg til reseptorer på celleoverflaten. Når det gjelder monocytter, styrer kjemokiner sin skjebne til enten å differensiere i DCs eller makrofager4. Så snart DCs møter og fanger et patogen, migrerer de til sekundære lymfoide organer, hvor de kan presentere de behandlede patogenpeptidantigenene ved å bruke store histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I eller klasse II overflateproteiner til henholdsvis CD8 + T-celler eller CD4 + T-celler, og dermed utløse en immunrespons 5,6.

DCs nøkkelrolle i å orkestrere en beskyttende immunrespons mot ulike patogener gjør dem til et interessant forskningsmål for å forstå intracellulære immunmekanismer, spesielt når man designer vaksiner og hjelpestoffer mot smittsomme stoffer7. Siden fraksjonen av DCs som kan oppnås fra PBMCs er ganske liten (1% -2%), har monocytter i stedet blitt brukt til å generere DCs in vitro8. Disse monocyttavledede DCene (MoDCs) ble opprinnelig utviklet som en mulig behandlingsstrategi i kreftimmunterapi9. Mer nylig har MoDCs blitt brukt til vaksineforskning 10,11,12, og klassiske monocytter er den dominerende subtypen (89%) for MoDC-produksjon 13. Produksjon av MoDCs in vitro har tidligere blitt oppnådd ved tillegg av granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF) gitt i kombinasjon med andre cytokiner som interleukin-4 (IL-4), tumornekrosefaktor α (TNF-α) eller IL-1314,15,16.

Suksessen til en in vitro MoDC-analyse er avhengig av evnen til antigenstimulerte modne MoDCs til å modulere omfanget og typen av immunresponsen som er spesifikk for typen antigen som oppdages17. Typen av patogen anerkjent og presentert av MoDCs bestemmer differensieringen av CD4 + T-hjelperceller (Th) til enten Th1, Th2 eller Th17 effektorceller og er preget av en patogenspesifikk sekretorisk cytokinprofil. En Th1-respons fremkalles mot intracellulære patogener og resulterer i utskillelse av interferon-gamma (IFN-γ) og tumornekrosefaktor beta (TNF-β), som modulerer fagocytisk avhengig beskyttelse. En Th2-respons utløses mot parasittiske organismer og er preget av IL-4, IL-5, IL-10 og IL-13 sekresjon, som initierer fagocytisk-uavhengig humoral beskyttelse. Th17 gir nøytrofilavhengig beskyttelse mot ekstracellulære bakterielle og soppinfeksjoner mediert av sekresjon av IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 og TNF-α 18,19,20,21. Basert på tidligere studier har det blitt bemerket at ikke alle patogener faller innenfor den forventede cytokinprofilen. For eksempel stimulerer dermal MoDCs, som respons på Leishmania parasittisk infeksjon, IFN-γ sekresjon fra CD4 + T-celler og CD8 + T-celler, og induserer dermed en beskyttende proinflammatorisk Th1-respons22.

Det er også vist at i kylling-MoDCs primet med Salmonella lipopolysakkarid (LPS), kan indusere en variabel respons mot Salmonella typhimurium ved å aktivere både Th1- og Th2-responser, mens Salmonella gallinarum induserer en Th2-respons alene, noe som kan forklare den høyere motstanden til sistnevnte mot MoDC-clearance23. Aktivering av MoDCs mot Brucella canis (B. canis) har også blitt rapportert i både hund og humant MoDC, noe som betyr at dette kan representere en zoonotisk infeksjonsmekanisme24. Humane MoDCs primet med B. canis induserer en sterk Th1-respons som gir motstand mot alvorlig infeksjon, mens hundens MoDCs induserer en dominant Th17-respons med redusert Th1-respons, som senere fører til etablering av kronisk infeksjon25. Bovine MoDCs viser en forbedret affinitet for munn- og klovsykevirus (FMDV) konjugert med immunoglobulin G (IgG) sammenlignet med ikke-konjugert FMDV alene, da MoDCs danner et viralt antistoffkompleks som respons på de tidligere10. Samlet viser disse studiene hvordan MoDCs har blitt brukt til å analysere kompleksiteten av immunresponser under patogeninfeksjon. De adaptive immunresponsene kan evalueres ved kvantifisering av spesifikke markører assosiert med lymfocyttproliferasjon. Ki-67, et intracellulært protein som bare påvises i delende celler, regnes som en pålitelig markør for proliferasjonsstudier26, og tilsvarende tilsvarer CD25 uttrykt på overflaten av T-celler i sen aktiveringsfase lymfocyttproliferasjon27,28.

Denne studien demonstrerer en standardisert metode for in vitro-generering av MoDCs fra storfe, etterfulgt av deres anvendelse i en in vitro immunanalyse som brukes til å teste immunogeniteten til vaksiner. En kommersielt tilgjengelig rabiesvaksine (RV) ble brukt til å validere effekten av denne analysen. T-lymfocyttaktivering og proliferasjon ble målt ved flowcytometri, sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) og enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) gjennom analyse av veletablerte celleaktiveringsmarkører som Ki-67 og CD25 og sekresjonen av IFN-γ 28,29,30,31. Ingen dyre- eller menneskeeksperimentelle forsøk utføres under MoDC-analysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Blodinnsamling utføres av en sertifisert veterinærtjeneste i samsvar med de etiske retningslinjene fra det østerrikske byrået for helse og mattrygghet (AGES) og i samsvar med de aksepterte dyrevelferdsstandardene32. Studien fikk etisk godkjenning fra det østerrikske landbruksdepartementet. Det eksperimentelle designet for MoDCs generasjon og dens påfølgende anvendelse er illustrert i figur 1.

1. Produksjon av naive MoDC-er

MERK: Hele blodprøver ble oppnådd fra en enkelt patogenfri kalv ved jugulær venepunktering med hepariniserte vacutainers (åtte 9 ml blodrør ble brukt til denne studien). Transporter blodet i en isboks. Oppbevar prøvene ved 2-4 °C for senere bruk, eller behandle dem umiddelbart. Hold blodet roterende for å unngå blodpropp. Steriliser vacutainers med 70% etanol. Alle følgende eksperimenter ble utført med en biologisk prøve og seks tekniske replikater.

  1. Sentrifugering av tetthetsgradient for å isolere PBMC fra det hepariniserte blodet
    1. Bland blodet godt ved å invertere det 10x.
    2. Bruk en 10 ml pipette, overfør 20 ml heparinisert blod til et sterilt 50 ml rør, og fortynn det med 10 ml fosfatbufret saltvann (PBS).
    3. Pipette 15 ml lymfocyttisolasjonsmedium til et sterilt 50 ml rør.
      MERK: La det lymfocyttisolerende mediet oppnå romtemperatur før pipettering.
    4. Vipp 50 ml slangen som inneholder lymfocyttisolasjonsmediet til en 45° posisjon. Pek spissen av en 25 ml pipette vinkelrett, og legg forsiktig 30 ml blod-PBS forsiktig på toppen av lymfocyttisolasjonsmediet, uten å blande de to. Veldig sakte, bring 50 ml røret tilbake til vertikal stilling.
    5. Sentrifuge ved 800 × g i 35 minutter ved 20 °C med maksimal akselerasjon og uten bremsing (retardasjonsfunksjonen er slått av).
    6. Bruk en Pasteur-pipette til å samle PBMC-laget (det tynne hvite laget rett etter det første plasmalaget) og overfør det til et nytt 50 ml rør.
      MERK: Sentrifugering av tetthetsgradient separerer fullblod i forskjellige lag. Som et resultat setter erytrocytene seg i bunnen som en pellet, de mononukleære cellene (PBMC) settes ved grensesnittlaget, og plasmaet danner topplaget. Granulocytter finnes mellom pelleten og PBMC-laget.
    7. Vask de høstede PBMC-ene 2x ved å tilsette PBS opp til et volum på 40 ml og blande grundig ved å pipettere opp og ned. Deretter sentrifuger ved 500 × g ved 4 °C i 7 minutter med maksimal akselerasjon og maksimal retardasjon.
    8. Kast supernatanten ved dekantering, resuspender pelleten i 15 ml 1x ammoniumklorid-kalium (ACK) buffer, og inkuber ved romtemperatur i 10-15 minutter.
      MERK: Må ikke ruge i mer enn 15 minutter. Kommersielt tilgjengelig ACK-buffer brukes til å sikre lysering av de gjenværende røde blodcellene (RBC) som er tilstede i PBMC-fraksjonen.
    9. Tilsett PBS opp til et volum på 40 ml, og sentrifuge deretter ved 500 × g og 4 °C i 7 minutter med maksimal akselerasjon og retardasjon.
    10. Forkast supernatanten ved å dekantere, og gjenta trinn 1.1.9.
    11. Kast supernatanten og bland pelleten i 10 ml komplett dyrkningsmedium (ved romtemperatur).
      MERK: Det komplette kulturmediet består av RPMI 1640 cellekulturmedium supplert med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin.
  2. Magnetisk separasjon av CD14+/− -cellene fra PBMC-populasjonen ved bruk av CD14-konjugerte magnetkuler
    1. Telle cellene med en ren hemocytometer celleteller ved hjelp av 10 μL cellesuspensjon blandet med 10 μL trypanblå (0,4%) løsning.
      MERK: Trypan blå fargestoff er et giftig kjemisk og potensielt kreftfremkallende stoff. Det bør håndteres mens du bruker personlig verneutstyr (PPE) for å unngå kontakt, og avfall skal kastes i en lufttett spesialisert giftig avfallsbeholder. Døde celler vil se blå ut, mens levende celler vil se klare ut under mikroskopet.
    2. Sentrifuge i 7 min ved 500 × g.
    3. Kast supernatanten ved hjelp av en pipette, og resuspender pelleten i fluorescensaktivert cellesorteringsbuffer (FACS) ved å bruke et volum på 40 μL for hver 1 × 107 celler. Bland grundig med en pipette.
      MERK: FACS-buffer består av 2 % FBS og 2 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) oppløst i PBS.
    4. Tilsett 5 μL CD14-mikroperlebuffer per 1 × 107 celler, og bland grundig med en pipette.
    5. Inkuber i 30 minutter ved 4-8 °C for positivt utvalg av bovine CD14+ monocytter33. Vortex hvert 15. minutt i inkubasjonsperioden.
    6. Valgfritt trinn (for flowcytometrianalyse): Tilsett 10 μL CD14-FITC (fluoresceinisotiocyanat) farget antistoff med påfølgende inkubasjon i 15 minutter ved 4-8 °C. Se flowcytometrianalysen i trinn 5 for detaljer.
    7. Tilsett 1 ml FACS-buffer og sentrifuge i 7 minutter ved 500 × g.
    8. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 500 mikrol FACS-buffer per 1 × 108 celler.
    9. Sett den immunomagnetiske celleseparasjonskolonnen inn i separatoren (magnetisk kolonneholder), og plasser et 15 ml oppsamlingsrør under kolonneutløpet for å samle gjennomstrømningen.
    10. Vask kolonnen med 1 ml avgasset FACS-buffer. Etter skylling, bytt ut det brukte 15 ml røret med et nytt.
    11. La cellesuspensjonen (fra trinn 1.2.8) passere gjennom kolonnen ved å pipettere 1 × 108 celler i 500 mikroliter buffer om gangen.
      MERK: Vær oppmerksom på at du ikke genererer luftbobler mens du blander cellene før du slipper dem gjennom kolonnen.
    12. Skyll kolonnen 3x med 3 ml avgasset FACS-buffer hver gang.
    13. Samle gjennomstrømningen, og merk denne første eluerte fraksjonen som CD14-cellefraksjonen (PBMC minus CD14+ monocytter); Dette kalles også naiv lymfocyttfraksjon.
      MERK: CD14-cellene opprettholdes i komplett kulturmedium til antigenpulserende MoDCs produseres.
    14. Fjern kolonnen fra skilletegnet.
    15. Plasser et nytt sterilt 15 ml rør under kolonnen for oppsamling av avløpsvannet.
    16. Pipett 5 ml FACS-buffer inn i kolonnen, og skyv den umiddelbart gjennom med et stempel.
    17. Samle gjennomstrømningen, og merk denne andre eluerte fraksjonen som CD14 + cellefraksjonen; Dette kalles også den naive monocytfraksjonen.
    18. Tilsett komplett dyrkningsmedium til de høstede CD14+ -monocyttene for å oppnå 1 × 106 celler/ml.
      MERK: Tell de levende cellene i den eluerte CD14+ -cellefraksjonen for å estimere volumet av komplett kulturmedium som kreves for å oppnå ønsket celleantall.
    19. Ta en steril 24-brønns plate, og tilsett 1 ml av cellesuspensjonen (1 × 106 celler / ml) til hver brønn.
  3. Differensiering av CD14+ -naive monocytter til naive MoDC ved tilsetning av 3% w/v cytokincocktail (GM-CSF + IL-4) med totalt 5 dagers inkubasjon
    1. Suppler hver brønn som inneholder CD14+ monocytter med 40 μL (3 % w/v) av cytokincocktailen som følger med i settet.
    2. Inkuber platen i en fuktet inkubator med 5% CO2 og ved 37 ° C i 48 timer.
    3. På dag 2 overfører halvparten av brønnens innhold (500 μL) ved hjelp av en pipette til individuelle 1,5 ml rør, og sentrifuge ved 500 × g ved 4 °C i 7 minutter.
    4. Kast supernatanten, og resuspender pelleten i 500 μL friskt komplett dyrkningsmedium.
    5. Overfør 500 mikrol av denne cellesuspensjonen fra trinn 1.3.4 tilbake til hver angitte brønn slik at det endelige volumet er 1 ml.
    6. Berik hver brønn med 20 μL cytokincocktail.
    7. Inkuber kulturen i 72 timer i en fuktet inkubator med 5% CO2 og ved 37 ° C.
    8. Etter inkubasjonen på dag 5, fjern platen fra inkubatoren.
      MERK: Hver brønn vil inneholde 1 ml av en cellesuspensjon av naive MoDCer. Antall MoDCs vil være en prosentandel (~ 20%) av de opprinnelige monocyttene belagt (1 × 106 / ml).

2. MoDC endocytisk aktivitetsanalyse

MERK: Antigenopptaksanalysen eller endocytisk aktivitetsanalyse måler naive MoDCs evne til å internalisere fremmedlegemer. Utfør analysen ved hjelp av naive MoDCs dyrket med 3% w / v cytokincocktail og med 5 dagers inkubasjon, som tidligere beskrevet34.

  1. Høst den naive MoDC-cellesuspensjonen fra 24-brønnsplaten, og overfør den til et 15 ml rør; Samle også eventuelle restceller ved å skylle brønnene med PBS.
  2. Sentrifuge i 500 × g i 7 min. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml kulturmedium tilsatt 1 % FBS.
  3. Tell levende MoDC-celler for å estimere volumet av medium som kreves for å oppnå ønsket celletall (2 × 105 celler / ml).
  4. Dyrk de naive MoDCene i 100 μL komplett kulturmedium i en 24-brønnsplate med en endelig cellekonsentrasjon på 2 × 105 celler/ml.
  5. Suppler hver brønn med 1 mg / ml FITC-konjugert dextran (fluorescerende sonde brukt som endocytose tracer).
    MERK: FITC-dextran fungerer som en fluorescerende sonde og brukes som en endocytose tracer.
  6. Dekk til platen og rug i mørket ved 5 % CO2 og 37 °C i 60 minutter.
    MERK: For bakgrunnskontrollen, inkuber de ekstra MoDC-cellene (2 × 105 celler / ml) med 1 mg / ml FITC-dextran på is, da denne typen inkubasjon forhindrer at sporstoffmolekylet (FITC-dextran) kommer inn i cellene.
  7. Etter inkubering, overfør umiddelbart 24-brønnplaten på is for å stoppe endocytosen av FITC-dextran.
  8. Vask cellene med iskald FACS-buffer.
  9. Høst, sentrifuge og resuspendere pelleten i 500 μL FACS-buffer.
  10. Analysere fluorescensintensiteten til FITC-dextran i cellene ved hjelp av flowcytometri. Se flowcytometrianalysen i trinn 5.2 for detaljer.

3. Generering av antigenpulserende MoDCs

MERK: En kommersielt tilgjengelig og klinisk godkjent vaksine mot rabiesvirus (RV) kan indusere differensiering av naive MoDCs i modne antigenpresenterende MoDCs. Bruk 0.1% (~ 1 μL) av en enkelt RV-vaksinasjonsdose for å generere antigenpulserende MoDCs. Videre er det foretrukket å produsere RV-pulsede MoDC-er i samme kulturplate som brukes (i trinn 1.3.8) for å generere naive MoDC-er, fordi overføring av de naive MoDC-ene til en ny 24-brønnsplate vil påvirke dem negativt.

  1. Fra trinn 1.3.8) Tilsett 1 μL/ml bobilsuspensjon til 1 ml naiv MoDC-kultur i 24-brønnsplaten, og inkuber i 48 timer ved 5 % CO2 og 37 °C.
    MERK: Naive MoDCs dyrket uten RV-stimulering brukes som bakgrunnskontroll (og som uspesifikk stimulering for samkultur med lymfocytter i de neste trinnene).
  2. Etter inkubering, på dag 7, hold 24-brønnsplaten som inneholder antigenpulserende MoDCs på is i 10 minutter.
  3. Tilsett 1 ml iskald PBS per brønn. Bland hver brønn grundig ved pipettering, og overfør suspensjonen til et 15 ml rør.
  4. Vask brønnene med 2 ml iskald PBS for å samle opp restcellene som er igjen i hver brønn.
  5. Overfør innholdet til deres respektive rør, og sentrifuge cellesuspensjonen ved 500 × g i 7 minutter.
  6. Kast supernatanten, resuspender cellepelleten (antigenpulserende MoDCs) i komplett kulturmedium, og juster volumet til en endelig cellekonsentrasjon på 1 × 105 celler/ml.
    MERK: Tell levende celler for å estimere volumet av medium som kreves for å oppnå ønsket celleantall. Bruk RV-pulserte MoDCs fra dag 7 for MoDC-lymfocytt co-kultur system.

4. MoDC-lymfocytt co-kultur

MERK: Det in vitro MoDC-lymfocytt-kokultursystemet bestemmer MoDCs evne til å prime antigenspesifikke lymfocytter. De forskjellige behandlingsgruppene av celler etter 16 dager med samkultur inkluderer spesifikk, ikke-spesifikk og kontroll. Den spesifikke gruppen er definert som lymfocytter dyrket sammen med RV-pulserte MoDCs; den ikke-spesifikke gruppen er definert som lymfocytter dyrket samtidig med ikke-antigenpulserende MoDCs; og kontrollgruppen er definert som lymfocytter dyrket uten MoDC.

  1. Legg komplett kulturmedium til den eluerte naive lymfocyttfraksjonen (CD14-celler) for å oppnå en cellekonsentrasjon på 2 × 106 celler/ml.
    MERK: Telle levende celler i CD14-cellekulturen som har blitt opprettholdt i komplett kulturmedium i en 24-brønnsplate siden samlingen for å estimere volumet av medium som kreves for å oppnå ønsket celletall.
  2. På dag 7, ta en steril 24-brønns plate, og frø brønnene med 1 ml naiv lymfocyttcellesuspensjon (2 × 106 celle / ml) pluss 1 ml antigenpulsert eller ikke-antigenpulsert MoDC-suspensjon (1 × 105 celle / ml).
    MERK: Det totale volumet i hver brønn vil være 2 ml med et forhold på 1:20 MoDCs til lymfocytter per brønn.
  3. Inkuber platen i 48 timer ved 37 °C og 5 % CO2.
  4. Kulturberikelse og restimulering med antigenpulserende MoDCs
    1. Etter inkubasjon av antigenpulsert MoDC-lymfocytt samkultur, på dag 9, supplere hver brønn med 20 ng / ml rekombinant IL-2, og fortsette å inkubere i ytterligere 120 timer (5 dagers inkubasjon).
    2. På dag 14, overfør 1 ml av kokulturen til et sterilt 1,5 ml rør og sentrifuge ved 500 × g i 7 minutter.
    3. Kast supernatanten og resuspender cellepelleten med 1 ml antigenpulserende eller ikke-pulserende MoDCs (1 × 105 celle/ml). Bland forsiktig ved pipettering, og overfør cellesuspensjonene tilbake til de angitte brønnene.
      MERK: På dette trinnet er det totale volumet i hver brønn 2 ml.
    4. Fortsett med inkubasjon ved 5 % CO2 og 37 °C i 48 timer. Etter inkubasjon på dag 16 er kokulturen klar for analyse ved hjelp av flowcytometri, qPCR og ELISA.
      MERK: For hver 2 ml i hver brønn i MoDC-lymfocytt-kokulturen, farges 1 ml resuspenderte celler for flowcytometri, 1 ml brukes til RNA-ekstraksjon, og supernatantene fra begge brukes til ELISA.

5. Flowcytometrisk analyse

MERK: Flekk cellene med passende markører / mAb før du kjører prøvene på et flowcytometer. Se materialfortegnelsen for detaljer om reagensene (farging av mAb- og isotypekontroller), sett, instrument og programvare som brukes til flowcytometrianalysen.

  1. Protokoll for farging av flowcytometer
    MERK: Utfør celleoverflatefarging for PBMC og naive lymfocytter og monocytter ved bruk av anti-CD14 mAb (trinn 1.2.6). For celleoverflatefarging av naive MoDC-er, bruk anti-CD86-spesifikke, anti-CD40-spesifikke og anti-MHC II-spesifikke mAb. For celleoverflatefarging av celler fra dag 16 kokulturer, bruk anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25 mAbs; for intracellulær farging, bruk anti-Ki-67 mAb. Videre flekker cellene enten med negativ isotypekontroll mAb eller uten mAb (FMO: fluorescerende minus en). Hovedforskjellen ved farging for overflate- og intracellulære markører er at for celleoverflatemarkører må cellene farges med spesifikk overflate-mAb før levende/døde (L/D) farging eller andre prosesser. Imidlertid utføres intracellulær farging etter L / D-farging og krever et fikserings- pluss permeabiliseringstrinn for å tillate intracellulær penetrasjon.
    1. Overfør 1 ml cellesuspensjon til et sterilt 1,5 ml rør ved hjelp av en pipette, og sentrifuge i 10 minutter ved 500 × g.
      MERK: Etter sentrifugering, når du behandler cellene fra MoDC-lymfocytt-kokulturen, lagre supernatanten for ELISA-analyse.
    2. Resuspender pelleten i 1 ml PBS, og overfør den til et 15 ml rør. Samle restcellene ved hjelp av 1 ml PBS, og kombiner dette med den resuspenderte pelleten.
    3. Tilsett 10 ml PBS til 15 ml røret som inneholder cellene, bland med pipettering og sentrifuge i 7 minutter ved 850 x g.
    4. Forkast supernatanten, og gjenta trinn 5.1.3.
    5. Kast supernatanten, og resuspender cellepelleten forsiktig med gjenværende suspensjon (ca. 180 μL) som er igjen etter dekantering av supernatanten.
    6. Overfør cellesuspensjonen til en v-bunns 96-brønnsplate, og forsegl brønnene for å unngå søl.
    7. Sentrifuger platen ved 1 400 × g i 5 minutter. Etter sentrifugering, flikk platen over en avfallsbeholder for å tømme væskebrønnene, og bank platen på absorberende papir for å sikre fjerning av overflødig væske.
    8. Tilsett 25 μL overflatefargingsblanding per brønn, og bland forsiktig med en pipette, etterfulgt av inkubering ved 4 °C i 30 minutter.
      MERK: For å forberede overflatefarging masterblanding for en enkelt brønn, tilsett 2,5 μL overflate mAb til 20 μL FACS-buffer.
    9. Tilsett 200 μL FACS-buffer per brønn, og sentrifuge ved 1 400 × g i 5 minutter. Etter sentrifugering, tøm væskebrønnene ved dekantering, og bank platen på absorberende papir for å fjerne overflødig væske.
    10. Tilsett 100 μL L/D-fargeløsning per brønn. Bland grundig med en pipette, etterfulgt av inkubasjon ved 4 °C i 15 minutter i mørket.
      MERK: For en enkelt brønn, oppløs 0,25 μL L / D-fargestoff i 100 μL FACS-buffer. L/D-fargestoffet bidrar til å skille mellom levende og døde celler.
    11. Legg til 100 μL FACS-buffer. Dekk brønnene med lokket, og sentrifuge platen i 1.400 × g i 5 minutter. Kast supernatanten ved å dekantere, og bank på platen på absorberende papir.
    12. Gjenta trinn 5.1.11.
    13. Tilsett 50 μL fikseringsløsning per brønn (følger med settet), og bland med en pipette før du inkuberer platen ved romtemperatur i mørket i 10 minutter.
    14. Tilsett 150 μL av 1x permeabilisering-vaskebuffer (PW) som følger med settet, og dekk brønnene med lokket.
      MERK: For å forberede 10 ml 1x PW buffer, fortynn 1 ml 10x perm buffer i 10 ml dH2O.
    15. Sentrifuger platen ved 1 400 × g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten ved å dekantere, og bank på platen på absorberende papir.
    16. Tilsett 200 μL 1x PW, etterfulgt av sentrifugering ved 1 400 × g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten ved å dekantere, og bank på platen på absorberende papir.
    17. For intracellulær farging, tilsett 25 μL intracellulær fargemasterblanding (anti-human Ki-67 mAb) per brønn. Bland godt, og rug platen i 30 min ved 4 °C eller på is i mørket.
      MERK: For å forberede intracellulær fargingsmasterblanding for en enkelt brønn, tilsett 1 μL Ki-67 mAb til 24 μL 1x PW. Den intracellulære fargemarkøren brukes kun ved behandling av celler fra dag 16 samkultur. Intracellulær farging gjøres ikke under behandling av PBMC, naive lymfocytter, monocytter og naive MoDCs.
    18. Etter inkubasjon, tilsett 200 μL 1x PW til hver brønn. Bland med en pipette, og sentrifuge i 1 400 × g i 5 minutter. Kast supernatanten ved å dekantere, og bank på platen på absorberende papir.
    19. Tilsett 200 μL FACS-buffer, etterfulgt av sentrifugering ved 1 400 × g i 5 minutter. Kast supernatanten ved å dekantere, og bank på platen på absorberende papir.
    20. Resuspender cellepelleten i 200 μL FACS-buffer, og overfør innholdet i hver brønn til separate sterile flowcytometerrør. Bruk 300 μL FACS-buffer per brønn for å samle opp restcellene. Cellene er nå klare for flowcytometrianalyse.
  2. Kjøre prøven på et flowcytometer
    MERK: Prøvene ble kjørt på et flowcytometer (ved bruk av 488 nm, 638 nm og 405 nm lasere) i henhold til produsentens håndbok35. Se håndboken for detaljer, feilsøking og tilpasning av protokollen.
    1. Utfør rutinemessige rengjøringsprosedyrer før og etter avlesning av prøvene.
      MERK: Ikke hopp over en posisjon mens du legger rørene i instrumentet.
      1. For rengjøringssyklusen, bruk totalt fire rør, med det første røret som inneholder strømningsrengjøringsreagens og de resterende tre rørene som inneholder dH2O; hvert rør vil ha 3 ml. Under rengjøringskjøringen kan du samle inn data med middels strømningshastighet i ca. 1 minutt ved å registrere 100 000 hendelser per rør under 330 V for fremoverspredning (FSC) mot 265 V for sidespredning (SSC).
        MERK: Ingen rusk eller cellulære hendelser skal rapporteres under rengjøringen; Hvis dette skjer, utfører du rengjøringstrinnet på nytt. For å kjøre prøvene, sørg for at alle prøvene er i en homogen suspensjon før du samler inn dataene, fordi dette sikrer en nøyaktig avlesning.
    2. For å koble til og slå på cytometeret, klikk på applikasjonsknappen i venstre hjørne av tittellinjen. Fra rullegardinmenyen for applikasjonen , velg alternativet Cytometri, og klikk på alternativet Slå på.
      MERK: Fra rullegardinmenyen for applikasjoner lar alternativet Åpne brukere bla gjennom de forhåndsprogrammerte analysene, mens alternativet Ny protokoll lar brukerne lage nye protokoller.
    3. Først legger du den negative kontrollprøven i multirørholderen. Velg Ny protokoll, og observer arbeidslisten på venstre side av arbeidsområdet /skjermen.
    4. På arbeidslisten definerer du posisjonen til prøven i multirørholderen, og gir et navn til prøven og protokollen for identifikasjon.
    5. Fra maskinvarepanelet på venstre side av arbeidsområdet justerer og velger du flere parametere som detektorene (FSC, SSC og 10 fluorescensområder), spenningene (V) og forsterkningene til fotomultiplikatorene, og signalets områdehøydebredde (AHW).
      MERK: Følgende innstillinger for detektorene ble valgt basert på eksperimentet og instrumentet som ble brukt: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4 / Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67 / Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
    6. Fra kontrollpanelet for instrumentinnsamling under tittellinjen justerer du alternativene for strømningshastighet (medium), tid (5 min) og hendelser (se trinn 5.2.8) som skal oppdages. Klikk på alternativet Skaff singel for å la instrumentet tegne/kjøre prøven og vise forhåndsvisning i sanntid av hendelsene som er oppdaget.
    7. Fra forhåndsvisningen i sanntid, juster terskelen for fluorescens (spenning og forsterkning) og cellestørrelse for til slutt å tegne porter rundt ønsket cellepopulasjon mens du ekskluderer cellulært rusk.
      MERK: FSC bidrar til å skille celler på grunnlag av størrelse, slik at brukerne kan skille mellom celler i immunsystemet, for eksempel monocytter og lymfocytter; monocytter er større og viser en høyere FSC-intensitet sammenlignet med lymfocytter.
    8. Skaff deg omtrent 5000 levende MoDC, 50 000 levende lymfocytter og 50 000 live monocytthendelser.
    9. Når alle parametrene er justert i forhold til den negative kontrollprøven, klikker du på Stopp og lagrer protokollen.
    10. Legg nå alle prøvene på flerrørslasteren. Definer hvert utvalg på arbeidslisten, og bruk parameterne justert i referanse til den negative kontrollen på alle utvalgene i eksperimentet. Klikk på alternativet Skaff for å tillate at alle prøvene i eksperimentet kjøres fortløpende.
    11. Når dataene fra alle prøvene er anskaffet, lagre og transformere til lesbare data ved hjelp av en passende dataanalyseprogramvare som gjør det mulig å generere sekvensielle bi-parametriske og mono-parametriske histogrammer.

6. Messenger RNA (mRNA) ekspresjonsanalyse

  1. RNA-ekstraksjon
    MERK: Ekstrahere totalt RNA fra den antigenpulserte MoDC-lymfocytt-kokulturen (spesifikk), den ikke-antigenpulserte MoDC-lymfocytt-kokulturen (ikke-spesifikk), lymfocyttkulturen uten MoDCs (kontroll) og fra naive lymfocytter (CD14-celler isolert før samtidig dyrking). For RNA-ekstraksjon, lag etanol ved bruk av RNase-fritt vann. Se materialfortegnelsen for detaljer om ekstraksjonssettet og reagenser.
    1. Overfør 1 ml cellesuspensjon fra MoDC-lymfocytt-kokulturplaten (~1 × 106 celler/ml) til et sterilt sterilt rør på 1,5 ml ved hjelp av en pipette, og sentrifuge i 10 minutter ved 500 × g.
    2. Spar supernatanten til ELISA. Resuspender cellepelleten i 1 ml PBS, og overfør den til et 15 ml rør. Samle eventuelle gjenværende celler ved hjelp av 1 ml PBS.
    3. Sentrifuge i 10 min ved 500 × g.
      MERK: Alle prøvene skal håndteres skånsomt som levende celler inntil cellelyse utføres ved hjelp av lysisbufferen som følger med i settet. Celledød frigjør RNaser som raskt hydrolyserer RNA-malene som trengs for kvantifisering nedstrøms. RLT-buffer lyser celler i en løsning som hemmer RNaser.
    4. Legg til 350 μL lysisbuffer til hver tom brønn, og inkuber i 2-3 minutter for å lyse de adherente cellene som ikke ble høstet i de forrige trinnene.
    5. Når sentrifugeringen i trinn 6.1.3 er fullført, kast supernatanten og kombiner cellepelleten med 350 μL lysisbuffer lagt til i trinn 6.1.4.
      MERK: På dette tidspunktet er det mulig å lagre rørene ved -80 ° C eller fortsette med RNA-ekstraksjon (følgende trinn).
    6. Pipette 350 μL 70% etanol til lysatet i trinn 6.1.5. Det endelige volumet per prøve er 700 μL.
    7. Sett ekstraksjonskolonnen inn i et 2 ml oppsamlingsrør (følger med settet).
    8. Overfør 700 μL prøve per ekstraksjonskolonne, og sentrifuge ved 10.000 × g i 15 s. Kast gjennomstrømningen i oppsamlingsrøret, og plasser den tilbake i sentrifugeringskolonnen.
    9. I ekstraksjonskolonnen tilsettes 350 μL streng vaskebuffer (følger med i settet) og sentrifuge ved mer enn 10 000 × g i 15 s. Forkast gjennomstrømningen.
    10. Tilsett 80 μL DNase I inkubasjonsblanding per prøve på membranen i ekstraksjonskolonnen, og la den virke i 15 minutter ved 20-30 °C.
      MERK: For å forberede DNase I inkubasjonsblanding per prøve, tilsett 10 μL DNase I-lagerløsning til 70 μL DNase-buffer for et endelig volum på 80 μL. Bland grundig ved å snu røret flere ganger, etterfulgt av et kort spinn i sentrifugen.
    11. Vask ekstraksjonskolonnen med 350 μL streng vaskebuffer, etterfulgt av sentrifugering ved 10 000 × g i 15 minutter. Kast gjennomstrømningen i oppsamlingsrøret etter sentrifugering.
    12. Vask ekstraksjonskolonnen 2x med 500 μL mild vaskebuffer hver gang og med sentrifugering ved 10 000 × g i 15 s og en gang til i 2 minutter. Kast gjennomstrømningen etter hver sentrifugering.
    13. Sentrifuger kolonnen med maksimal hastighet i 1 min for å tørke membranen, og kast oppsamlingsrøret.
    14. Plasser ekstraksjonskolonnen i et nytt 1,5 ml oppsamlingsrør.
    15. Pipett 50 μL RNasefritt vann på søylemembranen, og rug i 3-5 minutter ved romtemperatur.
      MERK: For RNA-konsentrasjoner under 100 ng, reduser elueringsvolumet til 30 μL, og re-eluer ekstraksjonskolonnemembranen ved å bruke produktet fra første eluering for å konsentrere sluttproduktet.
    16. Sentrifuge ved 10.000 × g i 1 min for å eluere RNA.
    17. Mål konsentrasjonen av RNA ved å oppdage absorbansen ved 260 nm ved bruk av 0,5-2 μL prøve. Juster den endelige RNA-konsentrasjonen til 0,1-1 μg / μL ved bruk av RNase-fritt vann.
    18. Oppbevar RNA-alikotene ved -80 °C for senere bruk.
  2. Syntese av komplementært DNA
    1. Syntetiser komplementært DNA (cDNA) fra ekstrahert mal-RNA i henhold til produsentens protokoll som følger med settet (se materialfortegnelsen for detaljer).
      MERK: Et sammendrag av reagensene og volumene som brukes er vist i tabell 1 og tabell 2. En fullstendig protokoll er beskrevet i tilleggsfil 1.
  3. Sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon
    1. For qPCR, kjør cDNA-prøvene i triplikater. Kvantifiser bovint mRNA-transkriptnivåene for Ki-67 og IFN-γ ved hjelp av spesifikke primersett i referanse til GAPDH-genet , som vist i tabell 3.
      MERK: En fullstendig protokoll er beskrevet i tilleggsfil 1.

7. Enzymbundet immunosorbentanalyse

  1. Behandle de innsamlede kultursupernatantene rike på sekretoriske proteiner for kvantifisering av IFN-γ gjennom ELISA.
    MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer om bruk av settet. En fullstendig protokoll er beskrevet i tilleggsfil 1.

8. Statistisk analyse

  1. Analysere dataene, og lage grafiske illustrasjoner av eksperimentell design ved hjelp av kommersiell programvare. Bruk en ikke-paret ikke-parametrisk test for den komparative analysen. Vurder P-verdier < 0,05 for å være statistisk signifikante.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne metoden beskriver in vitro-generering av MoDCs fra storfe for evaluering av kandidatvaksineantigener før utførelse i in vivo-studier. Figur 1 illustrerer det eksperimentelle skjemaet for MoDC-generering fra storfe og anvendelsen av MoDCs for in vitro-analysen. Ved hjelp av den magnetbaserte cellesorteringsteknikken var det mulig å samle ca. 26 millioner CD14+ myocytter fra de høstede PBMCene, som tidligere var isolert fra 50 ml storfeblod. Den eluerte cellefraksjonen uten CD14+-monocytter var rik på lymfocytter og ble brukt som kilde til naive CD4+- og CD8+ T-celler (CD14−-lymfocyttcellefraksjon).

Den naive monocyttfraksjonen var sammensatt av 98 % CD14+ monocyttceller, observert etter CD14-cellefarging og flowcytometri (figur 2A,B). De rensede, naive monocyttcellene, når de ble utsatt for dyrking i nærvær av 3% cytokincocktailen (GM-CSF og IL-4) med en etterfølgende inkubasjon på 5 dager, differensiert til en DC-lignende fenotype. Fra en startkultur på 26 millioner CD14+ monocytter, kunne totalt ca. 12 millioner MoDCs oppnås etter 5 dagers inkubasjon. De naive MoDCene var funksjonelt i stand til antigenopptak, som observert ved hjelp av flowcytometrianalysen til FITC-dextran (figur 3). Videre var de naive MoDCene fenotypisk karakterisert ved å vurdere ekspresjon av MHC klasse II og kostimulerende CD86- og CD40-celleoverflatemarkører, som validerte den DC-lignende fenotypen (figur 4).

Antigenpulserende stimulering av naive MoDCs ble oppnådd ved å dyrke dem i nærvær av inaktivert RV i 2 dager. Aktivering av naive lymfocytter (CD14-cellefraksjonen) ble oppnådd ved antigenpulsert MoDC-lymfocyttdyrkning med påfølgende tilskudd av IL-2 . Under kokultur av MoDC-lymfocytter dag 9 ble det observert en morfologisk forandring i RV-pulserende MoDC, da de viste dendrittekstensjon, som er karakteristisk for MoDC-modning (figur 5). Dag 14 ble lymfocyttaktiveringen forsterket ved å restimulere samkulturen gjennom tilsetning av nyproduserte RV-pulserende MoDCs fra samme dyr.

Sammenlignet med ikke-pulsert MoDC-lymfocytt-kokultur ble det vist en signifikant økning (p < 0,01) i lymfocyttproliferasjon ved oppregulering av Ki-67- og CD25-aktiveringsmarkørene på både CD4+- og CD8+ T-cellene dag 16 i pulserende MoDC-lymfocytt-samkultur (figur 6). CD8+ T-cellene fra de modne RV-pulserte MoDC-kokulturene viste en åtte ganger oppregulering (p < 0,01) av Ki-67 sammenlignet med den ikke-spesifikke gruppen (figur 7A). CD4+ T-cellene i samme kokultur viste en syvdobling (p < 0,01) i Ki-67 sammenlignet med kontroller (figur 7B). Dette demonstrerer RV-primede MoDCs evne til å presentere RV-antigenet til naive lymfocytter og deretter aktivere dem i en in vitro-tilstand, som ligner på hva som skjer i et levende dyr. I tillegg til å analysere cellene med flowcytometri ble kokulturene også utsatt for qPCR og ELISA for å kvantifisere RV-spesifikk lymfocyttaktivering ved henholdsvis RNA-transkripsjon (Ki-67 og IFN-γ) og ekstracellulær sekresjon (IFN-γ) (figur 8). Disse ekstra deteksjonsmetodene kan også brukes som bekreftende tester for å validere resultatene av flowcytometri ytterligere. RNA-ekspresjonen for Ki-67 og IFN-γ demonstrert av qPCR og IFN-γ-nivåene demonstrert av ELISA, viste lignende økningsmønstre, noe som indikerer lymfocyttproliferasjon, i den antigenspesifikke kokulturen sammenlignet med den ikke-spesifikke behandlingsgruppen. Derfor korrelerte qPCR- og ELISA-resultatene med flowcytometriresultatene. qPCR viste en >30% økning i IFN-γ-uttrykk og en >5% økning i Ki-67-uttrykk i alle kokulturer som brukte GAPDH som kalibrator (figur 8A, B). Signifikant høyere konsentrasjon av utskilt IFN-γ (**p > 0,01) ble målt med ELISA med dyrkningssupernatanter fra RV-pulsert MoDC-lymfocytt-kokultur sammenlignet med den uspesifikke behandlingsgruppen (figur 8C).

Figure 1
Figur 1: Eksperimentell design av den bovine MoDC-baserte in vitro-analysen. (A) Høsting og cellesortering av CD14+-monocytt- og CD14-lymfocyttcellefraksjonene fra storfe PBMC. Storfeblod behandles ved sentrifugering av tetthetsgradient for å samle PBMC, etterfulgt av magnetisk basert cellesortering ved hjelp av immunomagnetiske celleseparasjonskolonner og den påfølgende dyrkingen av den høstede CD14+-naive monocyttcellefraksjonen i supplert RPMI 1640-medium. (B) Produksjon av MoDCs ved bruk av 3% cytokincocktail (GM-CSF + IL-4) med 5 dagers inkubasjon og MoDC-lymfocytt samkultur. På dag 0 dyrkes monocyttene i nærvær av cytokincocktailen og inkuberes i 48 timer for å indusere differensiering. På dag 2 restimuleres kulturen med samme cytokincocktail, etterfulgt av inkubasjon i 72 timer, noe som fører til produksjon av naive MoDCs. På dag 5 tilsettes vaksineantigenet (rabiesvaksinen) til den naive MoDC-cellekulturen, etterfulgt av 48 timers inkubasjon. Dag 7 gjøres samtidig dyrkning av antigenpulserende MoDCs med naive lymfocytter (CD14-cellefraksjonen), etterfulgt av inkubasjon. På dag 9 legges IL-2 til samkulturen. Dag 14 utføres anrikning/restimulering av aktiverte/primede lymfocytter ved tillegg av antigenpulserende MoDC, etterfulgt av inkubasjon i 48 timer. Til slutt, på dag 16, høstes cellene og kultursupernatanten for lymfocyttproliferasjonsanalysen. Forkortelser: MODCs = bovine monocytt-avledede dendrittiske celler; PBMCs = mononukleære celler i perifert blod; GM-CSF = granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Morfologi og renhet av storfe CD14+ monocytter høstet fra PBMC ved bruk av anti-CD14-konjugerte mikroperler. (A) Morfologi av storfemonocytter inkubert i 4 timer ved 37 ° C i komplett kulturmedium for å fjerne mikroperler, festet på polylysinbelagte lysbilder og farget med modifisert Giemsa-flekk. Skala bar = 50 μm. (B) Flowcytometrihistogram som viser eluert CD14+ cellefraksjon med 98,6 % renhetsnivå observert ved bruk av anti-CD14 antistoff (rød) og FITC-konjugert IgG1 isotype kontrollantistoff hos mus (grønn). Forkortelser: PBMCs = mononukleære celler i perifert blod; FITC cont = fluorescein isotiocyanat kontroll. Denne figuren er modifisert fra Kangethe et al., 201811. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Endocytisk aktivitet av bovine MoDCs generert in vitro. Flowcytometrihistogram som viser opptak av sporstoffmolekylet (FITC-dextran) ved dag 5 naive MoDCs. MoDC-er inkuberes ved 37 °C i 60 minutter med sporstoffmolekylet (blått) og MoDC-er inkubert på is med sporstoffmolekylet (grått) brukt som bakgrunnskontroll. Forkortelser: MODCs = bovine monocytt-avledede dendrittiske celler; FITC = fluoresceinisotiocyanat. Denne figuren er modifisert fra Kangethe et al., 201811. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Fenotyping av in vitro-genererte moDC-spesifikke celleoverflatemarkører fra storfe. Flowcytometrihistogrammer for (A) gatingstrategier for MoDCs og for (B) dag 5 naive MoDCs farget med tre forskjellige DC-spesifikke mAbs (blå), inkludert følgende: anti-sau MHC II mAb, anti-bovin CD86 mAb og anti-bovine CD40 mAb. Alt sammenlignet med deres tilsvarende isotypekontroller (rød). Forkortelser: DC = dendrittiske celler; MODC = bovine monocytt-avledede DCer; MHC II = hovedhistokompatibilitetskompleks II. Denne figuren er modifisert fra Kangethe et al., 201811. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Tegn på modning av in vitro-produserte MoDCs under MoDC-lymfocytt-samkultur. Observasjon av den karakteristiske utvidede dendrittiske strukturen ved antigenpulserende MoDCs med invertert mikroskopi på dag 9 av MoDC-lymfocytt-samkulturen. (A) Modne MoDCs innenfor et svært konfluent område av co-dyrkede lymfocytter. (B) Eldre MoDCs er lett å skille i et område med færre lymfocytter i samkultur. Skalastenger = 50 μm. Forkortelse: MODCs = bovine monocytt-avledede dendrittiske celler. Denne figuren er modifisert fra Kangethe et al., 201811. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Sekvensiell gatingstrategi tatt i bruk for punktplott mot Ki-67- og CD25-uttrykk av lymfocytter i MoDC-lymfocytt-kokultur. (A) Than full gating strategi for celler høstet fra dag 16 MoDC-lymfocytt co-kultur. (B) Ki-67-ekspresjonen fra CD4+-kontrollerte lymfocytter og (C) fra CD8+-lymfocytter sammenlignet med FMO-kontrollen (uten mAb) og musens IgG1-k isotypekontroll mAb. CD25-uttrykket på inngjerdede (D) CD8+- og (E) CD4+-lymfocytter sammenlignet med musens IgG1 isotypekontroll mAb. Behandlingsgruppen representerer spesifikt lymfocytter dyrket sammen med RV-pulserte MoDCs, mens kontrollgruppen representerer lymfocytter dyrket i fravær av MoDCs. Forkortelser: MODCs = bovine monocytt-avledede dendrittiske celler; FMO = fluorescerende minus en; RV = rabiesvaksine. Denne figuren er modifisert fra Kangethe et al., 201811. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Flowcytometridataanalyse av Ki-67- og CD25-ekspresjon ved CD4+- og CD8+-lymfocytter etter priming med antigen. Ki-67 og CD25 uttrykk fra dag 16 samkultur. Behandlingsgruppen (spesifikk) er definert som lymfocytter dyrket med RV-pulserte MoDCs; den ikke-spesifikke gruppen tilsvarer lymfocytter dyrket med ikke-antigenpulserende MoDCs; kontrollgruppen tilsvarer lymfocytter dyrket uten MoDCs. De horisontale stolpene representerer gjennomsnittet av seks tekniske replikater. (A) Intracellulær ekspresjon av Ki-67-markøren av CD8 T-celler og (B) av CD4 T-celler. (C) Celleoverflateuttrykk av CD25-markøren av CD8 T-celler og (D) av CD4 T-celler. Forkortelser: MODCs = bovine monocytt-avledede dendrittiske celler; RV = rabiesvaksine. Denne figuren er modifisert fra Kangethe et al., 201811. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Th1-markør (IFN-γ og Ki-67) aktivering av MoDCs primet med rabiesvirusantigenet, påvist gjennom qPCR og ELISA. Data hentet fra ett dyr med seks tekniske replikater. De horisontale stolpene representerer gjennomsnittet. Tre PCR-replikasjoner vist som foldeforandringer sammenlignet med naive lymfocytter etter normalisering med et GAPDH-referansegen . (A) IFN-γ uttrykk, (B) Ki-67 uttrykk. (C) Sammenligning av IFN-γ sekresjon i dyrkningssupernatanten mellom tre behandlingsgrupper, som påvist av ELISA. Den spesifikke gruppen er definert som lymfocytter dyrket med RV-pulserte MoDCs; den ikke-spesifikke gruppen tilsvarer lymfocytter dyrket med ikke-antigenpulserende MoDCs; kontrollgruppen tilsvarer lymfocytter dyrket uten MoDCs. Forkortelser: MODCs = bovine monocytt-avledede dendrittiske celler; RV = rabiesvaksine. Denne figuren er modifisert fra Kangethe et al., 201811. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Reagenser Endelig konsentrasjon Volum Per reaksjon
dNTPs Mix (10 mM) 1,000 μM 1 μL
Tilfeldige Hexamer Primere (50 ng / μL) 25 μM 1 μL
RNA-mal 0,1 – 1 μg/μL χ μL (etter behov)
RNAse Fritt vann - χ μL (etter behov)
Endelig reaksjonsvolum - 10 μL

Tabell 1: Masterblandingssammensetning (RNA-primerblanding).

Reagenser Endelig konsentrasjon Volum Per reaksjon
RT-buffer 10x 1x 2 μL
MgCl2 25 mM 5 mM 4 μL
DTT 0,1 M 10 mM 2 μL
RNAse-hemmer 40 E/μL 2 U 1 μL

Tabell 2: 2x PCR-reaksjonsblandingen. Forkortelser: RT = revers transkriptase; DTT = dithiothreitol.

Cytokin Art Tiltredelsesnummer Sekvens Lengde Tm
IFN-γ Bos taurus FJ263670 F- GTGGGCCTCTCTTCTCAGAA 234 80.5
R- GATCATCCACCGGAATTTGA
Ki-67 Bos taurus XM_015460791.2 F-AAGATTCCAGCGCCCATTCA 148 86.5
R-TGAGGAACGAACGACTGG
GAPDH Bos taurus Sassu et al., 2020 F-CCTGGAGAAACCTGCCAAGT 214 85.5
R-GCCAAATTCATTGTCGTACCA

Tabell 3: Primersett brukt til forsterkning50.

Reagenser Endelig konsentrasjon Volum Per reaksjon
Supermiks 1x 5 μL
Forward Primer (5 μM) 250/ 125 nM 1 μL
Omvendt grunning (5 μM) 250/ 125 nM 1 μL
cDNA 1:10 fortynnet 1,25 ng 2 μL
Nukleasefritt vann - 1 μL
Endelig reaksjonsvolum - 10 μL

Tabell 4: qPCR master mix

Rør nr. Konsentrasjon av Standard Seriell fortynning
1 50 ng/ml 50 μL standard + 350 μL vaskebuffer
2 12,5 ng/ml 150 μL fra rør 1 + 450 μL vaskebuffer
3 6,25 ng/ml 250 μL fra rør 2 + 250 μL vaskebuffer
4 3,13 ng/ml 250 μL fra rør 3 + 250 μL vaskebuffer
5 1,56 ng/ml 250 μL fra rør 4 + 250 μL vaskebuffer
6 0,78 ng/ml 250 μL fra rør 5 + 250 μL vaskebuffer
7 0,2 ng/ml 150 μL fra rør 6 + 450 μL vaskebuffer
8 0,1 ng/ml 250 μL fra rør 7 + 250 μL vaskebuffer
9 0,025 ng/ml 100 μL fra rør 8 + 300 μL vaskebuffer

Tabell 5: IFN-γ standard fortynningsserie

Tilleggsfil 1: Protokoller for syntese av komplementært DNA, sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) og enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA). Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S1: Antigenopptaksevnen MoDCs med forskjellige konsentrasjoner av cytokincocktailen og med 3 dager eller 5 dager med kultur. Ulike konsentrasjoner (5 % w/v og 3 % w/v) av cytokincocktailen som inneholder GM-CSF og IL-4 ble testet enten med 3 dager eller 5 dager med kultur for å vurdere den beste kombinasjonen for å generere høyytelses antigenopptak av MoDCs (ved bruk av sporstoffmolekylet FITC-dextran). Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S2: CD4- og CD8-priming med diptheriatoksoid (DT) og blåtungevirus serotype 4 (BTV). Ekspresjonen av Ki-67 av CD8-celler etter pulserende med (A) DT og (C) BTV og ekspresjonen av Ki-67 av CD4-celler etter pulserende med (B) DT og (D) BVT ved dag 16. Det ble gjort sammenligninger med dyrkning pulsert med DT og BVT (spesifikk), (C,D) med CD40L og med uspesifikk priming- og kontrollbehandling. De horisontale stolpene indikerer gjennomsnittet. *p < 0,05, **p < 0,01 i henhold til en Mann-Whitney-test. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne studien demonstrerer en standardisert in vitro-metode for generering og fenotyping av bovine MoDCs og deres påfølgende bruk ved måling av vaksineimmunogeniteten til en kommersiell vaksine (f.eks. RV). Bovine MoDCs kan brukes som et verktøy for screening potensielle vaksineantigener mot storfesykdommer og forutsi deres potensielle kliniske innvirkning basert på immunresponser før de fortsetter mot in vivo dyreforsøk. MoDC-ene som ble generert ble identifisert basert på deres morfologiske, fenotypiske og funksjonelle egenskaper. Vi viste at MoDCs avledet fra storfe CD14 + monocytter viste funksjoner sett i DCs, for eksempel utvidede dendritter, ekspresjonen av celleoverflatemarkører for antigenpresentasjon som MHC II, ekspresjonen av co-stimulerende molekyler på MoDCs som CD40 og CD86, endocytisk aktivitet og evnen til å aktivere naive lymfocytter.

Cellekulturmediene som brukes i dette eksperimentet (DMEM og RPMI) er mye brukt til celledifferensiering og dyrking, med RPMI som oftere blir vedtatt for monocytdifferensiering36. RPMI-tilskudd med enten FBS eller HS (hesteserum) påvirker ikke monocytdifferensiering37. Rekombinant GM-CSF og IL-4 tilskudd gir en inflammatorisk tilstand som utløser monocytdifferensiering og brukes rutinemessig til produksjon av funksjonelt levedyktige MoDCs som er i stand til antigenopptak og presentasjon til immunceller38,39. I denne studien induserte RPMI 1640-medium supplert med 10% FBS (komplett kulturmedium), 1% penicillin-streptomycin og tillegg av en kommersielt tilgjengelig cytokincocktail (GM-CSF pluss IL-4) bovinmonocytdifferensiering, noe som resulterte i produksjon av levedyktige MoDCs. Når de genererte MoDC-ene ble inkubert med RV før de dyrket sammen med naive lymfocytter, induserte de en T-celleavhengig immunrespons spesifikk mot RV, noe som viste at modne MoDCs tilstrekkelig kan presentere RV-antigener til lymfocytter som aldri har kommet over RV. Dette er en avgjørende egenskap ved adaptiv immunitet som vi nå kan replikere i laboratoriet.

Vi observerte at en høyere konsentrasjon av cytokincocktail (5 %) kombinert med lengre inkubasjonstid (5 dager) ga MoDCs med lavere endocytisk evne til antigenopptak enn de som ble behandlet med en lavere konsentrasjon av cytokincocktail (3 %) med samme inkubasjonstid (5 dager), som vist i tilleggsfigur S1. Derfor konkluderer vi med at en lavere konsentrasjon av cytokincocktail (f.eks. 3%) med 5 dagers inkubasjon er optimal for å produsere funksjonelt potente MoDCs. Celleoverflatemarkører som MHC II, CD40 og CD86 er tilstede på APCer, og deres oppregulering indikerer funksjonell celleaktivering40,41,4 2. Vi demonstrerte forbedret ekspresjon av MHC II, CD40 og CD86 etter monocyttdifferensiering til naive MoDCs ved bruk av cytokincocktailen (figur 4).

Optimalisering av forholdet mellom naive lymfocytter og MoDCs i et kultursystem er en nøkkelfaktor som påvirker utfallet av MoDC-analysen, med forskjellige MoDC til lymfocyttforhold som induserer varierte lymfocyttresponser43. Etter å ha evaluert forholdet mellom MoDC og lymfocytt på 1:10-1:40, observerte vi imidlertid at økt konsentrasjon av MoDCs ikke økte lymfocyttaktiveringen, og vi bestemte oss til slutt for et optimalt forhold på 1:20, som er lik tidligere rapporterte studier44,45. Det bør bemerkes at den eluerte naive lymfocyttfraksjonen kan inneholde ikke-spesifikt aktiverte T-celler; Derfor er det viktig å ha en kontrollgruppe som bare tilsvarer naiv lymfocyttkultur.

Aktiverte CD4 + og CD8 + T-celler uttrykker spesifikke markører og utskiller en rekke cytokiner, og deres kvantifisering indikerer immunaktivering. Det intracellulære uttrykket av Ki-67, en godt karakterisert immunaktiveringsmarkør, ble oppregulert i denne MoDC-lymfocytt-kokulturen29,46. På samme måte i denne studien indikerte den forbedrede IFN-γ-sekresjonen av lymfocytter en Th1-respons fremkalt mot RV-antigenet30,31,47. IL-2-uttrykk av CD4 + T-celler er også en god markør for visualisering av T-celleaktivering; Imidlertid gjorde innlemmelsen på dag 9 av MoDC-lymfocytt-samkulturen det til et uegnet mål for måling av lymfocyttproliferasjon for denne studien48. Oppreguleringen av CD25 i nærvær av IL-2 har tidligere vist seg å bestemme primingen av både CD4 + og CD8 + T-celler og ble brukt i denne studien for å måle priming av naive lymfocytter av RV-pulserte MoDCs28.

Cytotoksiske CD8 T-celler er viktige effektorceller mot intracellulære vaksineantigener eller virale patogener49. Ved å måle lymfocyttaktiveringsmarkører (Ki-67 og CD25) og cytokinekspresjon (IFN-γ) fant vi at de antigenbelastede MoDCene hadde signifikant (p < 0,01) aktivering av både CD8- og CD4 T-celleresponser, med CD8-respons og Th1-polarisasjon som mer utbredt mot RV-antigenet. En viktig faktor som må vurderes ved utforming av en MoDC-analyse for adjuvanskonjugerte vaksiner er adjuvansinducerte lymfocyttresponser. Vi anbefaler å bruke en kontrollgruppe (adjuvant kontroll) sammensatt av kun adjuvans for å eliminere bakgrunnssignaler. Dette oppsettet kan også brukes til å måle effekten av forskjellige hjelpestoffer som kan forsterke lymfocyttresponsen mot et lavimmunogent antigen, noe som er avgjørende for beskyttelse under in vivo-studier .

Det er noen begrensninger i denne studien som vi ønsker å belyse. De eksperimentelle dataene for hver analyse ble avledet fra et enkelt dyr med seks tekniske replikater. Å ha et større antall biologiske replikater vil være gunstig for å minimere feil og gi forbedret statistisk pålitelighet og resultater med høyere nøyaktighet. I en tidligere publikasjon11 ble imidlertid denne analysen også testet og validert med diptheriatoksoid (tilleggsfigur S2A,B) og kommersiell vaksine mot blåtungevirus serotype 4 (tilleggsfigur S2C,D) med henholdsvis tre og to biologiske dyr. Videre vil sammenligning av resultatene oppnådd fra denne in vitro-studien med en in vivo-studie bidra til å i tillegg validere ektheten av denne immunanalysen, noe som igjen vil akselerere prosessen med implementering av denne in vitro MoDC-analysen som en rutinemessig test i vaksineproduksjon og kvalitetskontroll. Til slutt ble uttrykket av CD14 i MoDCs ikke undersøkt, da litteraturen er inkonsistent angående dette aspektet, spesielt når man sammenligner MoDCs fra forskjellige dyrearter.

Avslutningsvis rapporterer vi en in vitro bovin MoDC-analyse som kan brukes til å måle vaksineindusert immunogenisitet. Denne MoDC-analysen kan også evalueres ved hjelp av forskjellige metoder, inkludert flowcytometri, ELISA og qPCR. Å ha flere metoder for å evaluere aktiveringsmarkører er avgjørende i områder med begrensede ressurser der et flowcytometer kanskje ikke er lett tilgjengelig. Denne analysen kan inkluderes som et kvalitetskontrolltrinn av nasjonale veterinærlaboratorier som produserer store partier av storfevaksiner. I tillegg kan den brukes til å identifisere potensielle vaksineantigener under utviklingen av nye storfevaksiner og til og med å velge hvilken adjuvans som skal brukes før en dyreforsøk. Alle disse faktorene vil bidra til en mer etisk og rimelig tilnærming til utvikling og bruk av storfevaksiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Eveline Wodak og Dr. Angelika Loistch (AGES) for deres støtte til å bestemme helsestatusen til dyrene og for å gi BTV, Dr. Bernhard Reinelt for å gi storfeblod, og Dr. Bharani Settypalli og Dr. William Dundon fra IAEA for nyttige råd om henholdsvis sanntids PCR-eksperimenter og språkredigering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK Lysing Buffer Gibco, Thermo Fisher A1049201 Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin Tubes Becton, Dickinson (BD) and Company 366480 10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
Bovine Dendritic Cell Growth Kit Bio-Rad, UK PBP015KZZ Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA Kit Bio-Rad MCA5638KZZ Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant
CD14 Antibody Bio-Rad MCA2678F Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1
CD25 Antibody Bio-Rad MCA2430PE Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1
CD4 Antibody Bio-Rad MCA1653A647 Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a
CD40 Antibody Bio-Rad MCA2431F Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1
CD8 Antibody Bio-Rad MCA837F Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 Antibody Bio-Rad MCA2437PE Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad - Thermal cycler PCR machine
Corning Centrifuge Tube Falcon Corning  352096 & 352070 15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube
Cytofix/Cytoperm Plus BD Bio Sciences 555028 Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining
Ethanol Sigma Aldrich 1009832500 Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher 10500064 Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUS GE Health care Life Sciences, USA 341691 Lymphocyte-isolation medium
FlowClean Cleaning Agent Beckman Coulter, Life Sciences A64669 500 mL
FlowJo FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA - Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS  (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube Falcon Corning  352235 5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis
Fluoresceinisothiocynat-Dextran Sigma Aldrich, Germany 60842-46-8 FITC-dextran MW
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter - Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Bio-Rad HSP9601 96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear
Human CD14 MicroBeads Miltenyi Bioteck, Germany 130-050-201 2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs
Kaluza Beckman Coulter, Germany - Flow cytometer multicolor data analysis software
MACS Column Miltenyi Bioteck, Germany 130-042-401 Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens
MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody Bio-Rad MCA2228F Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine
Microcentrifuge Tube Sigma Aldrich HS4325 1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube
Microsoft Power Point Microsoft - The graphical illustrations of experimental design
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody Bio-Rad MCA928F Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD86 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD25 monoclonal antibody 
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody Bio-Rad MCA929F Isotype control for MHC class II monoclonal antibody 
Nobivac Rabies MSD Animal Health, UK - 1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain
Optical seals Bi0-Rad TCS0803 0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine
Penicillin-Streptomycin Gibco, Thermo Fisher 15140122 100 mL
Phosphate Buffer Saline (PBS) Gibco, Thermo Fisher 10010023 pH 7.4, 1x concentration
Prism - GraphPad 5 Software  Dotmatics - Statistical software
Purified Anti-human Ki-67 antibody Biolegend, USA 350501 Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody Biolegend 400101 Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody
READIDROP Propidium Iodide BD Bio Sciences 1351101 Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye
Recombinant Human IL-2 Protein R&D System, USA 202-IL-010/CF Interleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106 Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.
RPMI 1640 Medium Sigma Aldrich R8758 Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate
SMART-servier medical art  Les Laboratories Servier - Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5270 2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen, Thermo Fisher 18080051 Kit for cDNA synthsis
Tissue Culture Test plate 24 TPP, Switzerland 92024 24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL
Trypan Blue Solution Gibco, Thermo Fisher 15250061 0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen, Thermo Fisher 10977023 0.1 µm membrane filtered distilled water
VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes Thermo Fisher Scientific 15206067 VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.
Water Sigma Aldrich W3500-1L Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roth, J. A., Sandbulte, M. R. The role of veterinary vaccines in livestock production, animal health, and public health. In Veterinary Vaccines: Principles and Applications. Metwally, S., El Idrissi, A., Viljoen, G. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1-10 (2021).
  2. Roberts, N. J., Douglas, R. G., Simons, R. M., Diamond, M. E. Virus-induced interferon production by human macrophages. The Journal of Immunology. 123 (1), 365-369 (1979).
  3. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., López-Expósito, I., Kleiveland, C., Lea, T., Mackie, A., Requena, T., Swiatecka, D., Wichers, H. , Springer. Cham, Switzerland. 161-167 (2015).
  4. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  5. Domínguez, P. M., Ardavín, C. Differentiation and function of mouse monocyte-derived dendritic cells in steady state and inflammation. Immunological Reviews. 234 (1), 90-104 (2010).
  6. Steinman, R. M. Linking innate to adaptive immunity through dendritic cells. Novartis Foundation Symposium. 279, 101-109 (2006).
  7. Vandebriel, R. J., Hoefnagel, M. H. N. Dendritic cell-based in vitro assays for vaccine immunogenicity. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 8 (9), 1323-1325 (2012).
  8. Hopewell, E. L., Cox, C. Manufacturing dendritic cells for immunotherapy: Monocyte enrichment. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 16, 155-160 (2020).
  9. Morse, M. A., Zhou, L. -J., Tedder, T. F., Lyerly, H. K., Smith, C. Generation of dendritic cells in vitro from peripheral blood mononuclear cells with granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor, interleukin-4, and tumor necrosis factor-alpha for use in cancer immunotherapy. Annals of Surgery. 226 (1), 6-16 (1997).
  10. Robinson, L., et al. Foot-and-mouth disease virus exhibits an altered tropism in the presence of specific immunoglobulins, enabling productive infection and killing of dendritic cells. Journal of Virology. 85 (5), 2212-2223 (2011).
  11. Kangethe, R. T., Pichler, R., Chuma, F. N. J., Cattoli, G., Wijewardana, V. Bovine monocyte derived dendritic cell based assay for measuring vaccine immunogenicity in vitro. Veterinary Immunology and Immunopathology. 197, 39-48 (2018).
  12. Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., McCullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: Influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
  13. Hussen, J., et al. Phenotypic and functional heterogeneity of bovine blood monocytes. PLoS One. 8 (8), 71502 (2013).
  14. Shi, Y., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: What we do and don't know. Cell Research. 16 (2), 126-133 (2006).
  15. Zhou, L. -J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2588-2592 (1996).
  16. Bautista, E. M., Nfon, C., Ferman, G. S., Golde, W. T. IL-13 replaces IL-4 in development of monocyte derived dendritic cells (MoDC) of swine. Veterinary Immunology and Immunopathology. 115 (1-2), 56-67 (2007).
  17. León, B., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells in innate and adaptive immunity. Immunology and Cell Biology. 86 (4), 320-324 (2008).
  18. Berger, A. Th1 and Th2 responses: What are they. British Medical Journal. 321 (7258), 424 (2000).
  19. Romagnani, S. Th1/th2 cells. Inflammatory Bowel Diseases. 5 (4), 285-294 (1999).
  20. Kaiko, G. E., Horvat, J. C., Beagley, K. W., Hansbro, P. M. Immunological decision-making: How does the immune system decide to mount a helper T-cell response. Immunology. 123 (3), 326-338 (2008).
  21. Duckworth, B. C., Groom, J. R. Conversations that count: Cellular interactions that drive T cell fate. Immunological Reviews. 300 (1), 203-219 (2021).
  22. León, B., López-Bravo, M., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells formed at the infection site control the induction of protective T helper 1 responses against Leishmania. Immunity. 26 (4), 519-531 (2007).
  23. Singh, D., et al. Differential responses of chicken monocyte-derived dendritic cells infected with Salmonella gallinarum and Salmonella typhimurium. Scientific Reports. 11, 17214 (2021).
  24. Pujol, M., et al. Variability in the response of canine and human dendritic cells stimulated with Brucella canis. Veterinary Research. 48, 72 (2017).
  25. Pujol, M., Borie, C., Montoya, M., Ferreira, A., Vernal, R. Brucella canis induces canine CD4+ T cells multi-cytokine Th1/Th17 production via dendritic cell activation. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 62, 68-75 (2019).
  26. Lašťovička, J., Rataj, M., Bartůňková, J. Assessment of lymphocyte proliferation for diagnostic purpose: Comparison of CFSE staining, Ki-67 expression and 3H-thymidine incorporation. Human Immunology. 77 (12), 1215-1222 (2016).
  27. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: An in vitro model to monitor cellular immune function. Journal of Immunological Methods. 293 (1-2), 127-142 (2004).
  28. Shatrova, A. N., et al. Time-dependent regulation of IL-2R α-chain (CD25) expression by TCR signal strength and IL-2-induced STAT5 signaling in activated human blood T lymphocytes. PLoS One. 11 (12), 0167215 (2016).
  29. Shedlock, D. J., et al. Ki-67 staining for determination of rhesus macaque T cell proliferative responses ex vivo. Cytometry, Part A. 77 (3), 275-284 (2010).
  30. Yen, H. -R., et al. Tc17 CD8 T cells: Functional plasticity and subset diversity. Journal of Immunology. 183 (11), 7161-7168 (2009).
  31. Kawamura, I., et al. IFN-gamma-producing ability as a possible marker for the protective T cells against Mycobacterium bovis BCG in mice. Journal of Immunology. 148 (9), 2887-2893 (1992).
  32. Federal Ministry Republic of Austria. Agriculture, Forestry, Regions and Water Management. The Federal Act on Animal Welfare (Tierschutzgesetz - TSchG). Federal Law Gazette I 2004/118. , Available from: https://info.bml.gv.at/en/topics/agriculture/agriculture-in-austria/animal-production-in-austria/animal-welfare-act.html (2005).
  33. Corripio-Miyar, Y., et al. Phenotypic and functional analysis of monocyte populations in cattle peripheral blood identifies a subset with high endocytic and allogeneic T-cell stimulatory capacity. Veterinary Research. 46, 112 (2015).
  34. Wijewardana, V., et al. Generation of canine dendritic cells from peripheral blood monocytes without using purified cytokines. Veterinary Immunology and Immunopathology. 114 (1-2), 37-48 (2006).
  35. Gallios Flow Cytometer with Kaluza for Gallios Software. Instructions for Use. Beckman Coulter. , Available from: http://www.cytometrie-imagerie-saint-antoine.org/media/3924/Kaluza.Gallos.pdf (2014).
  36. Švajger, U., Jeras, M. Optimal dendritic cell differentiation in rpmi media requires the absence of HEPES buffer. Immunological Investigations. 40 (4), 413-426 (2011).
  37. Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), 0231132 (2020).
  38. Blanco, F. C., et al. Semi-stable production of bovine IL-4 and GM-CSF in the mammalian episomal expression system. Journal of Veterinary Research. 65 (3), 315-321 (2021).
  39. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. Journal of Experimental Medicine. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  40. Cho, K. -J., Roche, P. A. Regulation of MHC class II-peptide complex expression by ubiquitination. Frontiers in Immunology. 4, 369 (2013).
  41. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 313-318 (2003).
  42. Han Lee, G., et al. The role of CD40 expression in dendritic cells in cancer biology; a systematic review. Current Cancer Drug Targets. 14 (7), 610-620 (2014).
  43. Tanaka, H., Demeure, C. E., Rubio, M., Delespesse, G., Sarfati, M. Human monocyte-derived dendritic cells induce naive T cell differentiation into T helper cell type 2 (Th2) or Th1/Th2 effectors: Role of stimulator/responder ratio. Journal of Experimental Medicine. 192 (3), 405-412 (2000).
  44. Klechevsky, E., et al. Cross-priming CD8+ T cells by targeting antigens to human dendritic cells through DCIR. Blood. 116 (10), 1685-1697 (2010).
  45. Schlienger, K., Craighead, N., Lee, K. P., Levine, B. L., June, C. H. Efficient priming of protein antigen-specific human CD4+ T cells by monocyte-derived dendritic cells. Blood. 96 (10), 3490-3498 (2000).
  46. Soares, A., et al. Novel application of Ki67 to quantify antigen-specific in vitro lymphoproliferation. Journal of Immunological Methods. 362 (1-2), 43-50 (2010).
  47. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2009).
  48. Bachmann, M. F., Oxenius, A. Interleukin 2: From immunostimulation to immunoregulation and back again. EMBO Reports. 8 (12), 1142-1148 (2007).
  49. Koup, R. A., Douek, D. C. Vaccine design for CD8 T lymphocyte responses. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 1 (1), 007252 (2011).
  50. Sassu, E. L., et al. Development and evaluation of a real-time PCR panel for the detection of 20 immune markers in cattle and sheep. Veterinary Immunology and Immunopathology. 227, 110092 (2020).

Tags

Tom verdi utgave 195
Bestemmelse av vaksineimmunogenisitet ved bruk av dendrittiske celler fra bovint monocytt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liaqat, F., Kangethe, R. T.,… More

Liaqat, F., Kangethe, R. T., Pichler, R., Liu, B., Huber, J., Wijewardana, V., Cattoli, G., Porfiri, L. Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (195), e64874, doi:10.3791/64874 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter