Summary
本协议描述了辛醇辅助脂质体组装(OLA),这是一种产生生物相容性脂质体的微流体技术。OLA生产具有高效封装的单分散微米级脂质体,允许立即进行片上实验。预计该协议特别适用于合成生物学和合成细胞研究。
Abstract
微流体是一种广泛使用的工具,以受控和高通量的方式产生各种液滴和囊泡。脂质体是简单的细胞模拟物,由被脂质双层包围的水性内部组成;它们在设计合成细胞和体 外 理解生物细胞的基本原理方面很有价值,并且对于应用科学(例如治疗应用的货物交付)非常重要。本文介绍了芯片上微流体技术辛醇辅助脂质体组装(OLA)的详细工作方案,以产生单分散,微米大小,生物相容性脂质体。OLA的功能类似于吹泡,其中内部水相(IA)和周围的携带脂质的1-辛醇相被含有表面活性剂的外部流体流捏掉。这很容易产生带有突出辛醇口袋的液滴。当脂质双层在液滴界面处组装时,口袋自发分离以产生单层脂质体,该脂质体已准备好进行进一步的操作和实验。OLA具有多种优势,例如稳定的脂质体生成(>10 Hz),生物材料的高效封装和单分散脂质体群,并且需要非常小的样品体积(~50 μL),这在处理珍贵生物制剂时至关重要。该研究包括微加工、软光刻和表面钝化的详细信息,这些细节是在实验室中建立OLA技术所必需的。通过跨膜质子通量 诱导 脂质体内生物分子凝聚物的形成,还显示了原理合成生物学的应用。预计此随附的视频协议将有助于读者在其实验室中建立和排除OLA故障。
Introduction
所有细胞都有一个质膜作为它们的物理边界,这种膜本质上是由两亲性脂质分子的自组装形成的脂质双层形式的支架。脂质体是生物细胞的最小合成对应物;它们具有被磷脂包围的水腔,磷脂形成脂质双层,亲水性头基面向水相,疏水尾向内埋。脂质体的稳定性受疏水效应以及极性基团之间的亲水性、疏水性碳尾之间的范德华力以及水分子与亲水头之间的氢键控制1,2。根据脂质双层的数量,脂质体可分为两大类,即包含单个双层的单层囊泡和由多个双层构建的多层囊泡。单层囊泡根据其大小进一步分类。它们通常呈球形,可以生产各种尺寸,包括小的单层囊泡(SUV,直径30-100 nm),大的单层囊泡(LUV,直径100-1,000 nm),最后是巨大的单层囊泡(GUV,直径>1,000 nm)3,4。已经开发了各种技术来产生脂质体,这些技术可以大致分为体技术5和微流体技术6。常用的块状技术包括脂膜再水化、电形成、倒置乳液转移和挤出7、8、9、10。这些技术相对简单有效,是它们在合成生物学界广泛使用的主要原因。然而,与此同时,它们在尺寸的多分散性、缺乏对层状性的控制以及低包封效率方面存在重大缺点7,11。连续液滴界面交叉封装(cDICE)12和液滴喷射和尺寸过滤(DSSF)13等技术在一定程度上克服了这些限制。
在过去十年中,微流体方法已经变得突出。微流体技术由于特征性的层流和扩散主导的传质,为操纵用户定义的微通道内的流体流动提供了一个可控的环境。由此产生的芯片实验室设备为分子的时空控制提供了独特的可能性,显著减少了样品量和多重检测能力14。已经开发了许多制造脂质体的微流体方法,包括脉冲喷射15,模板16,瞬时膜喷射17,液滴乳液转移18和流体动力学聚焦19。这些技术可产生单分散、单层、细胞大小的脂质体,具有高包封效率和高通量。
本文详细介绍了辛醇辅助脂质体组装(OLA)的程序,这是一种基于流体动力学夹断和随后的溶剂去湿机制的片上微流控方法20(图1)。人们可以将OLA的工作与气泡吹制过程联系起来。六通液络部将内水相 (IA)、两个携带脂质的有机 (LO) 流和两个含表面活性剂的外部水性 (OA) 流集中在一个点上。这导致水包(脂质+辛醇)水包液滴。当这些液滴向下游流动时,界面能量最小化、外部剪切流以及与通道壁的相互作用导致溶剂袋脱落时在界面处形成脂质双层,从而形成单层脂质体。根据辛醇口袋的大小,脱湿过程可能需要几十秒到几分钟。在出口通道的末端,密度较低的辛醇液滴漂浮到表面,而较重的脂质体(由于更密集的封装溶液)沉到可视化室的底部准备进行实验。作为代表性实验,展示了脂质体内部的液-液相分离(LLPS)过程。为此,所需的组分以酸性pH值封装在脂质体中,以防止LLPS。通过外部触发pH值变化,从而触发跨膜质子通量,在脂质体内形成相分离的冷凝液滴。这突出了OLA系统的有效封装和操作能力。
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Protocol
1. 制造主晶圆
- 取一个直径为4英寸(10厘米)的清洁硅片(见 材料表)。使用加压空气进一步清洁以去除任何灰尘颗粒。
- 将晶圆安装在旋转涂布机上,并在晶圆中心轻轻分配~5 mL负光刻胶(参见 材料表)。尽量避免气泡,因为它们可能会干扰晶圆的下游印刷过程。
- 要获得 10 μm 厚的光刻胶层,请以 500 rpm 的速度旋涂晶圆 30 秒,初始铺展加速度为 100 rpm/s,然后以 3,000 rpm 的速度旋转 60 s,加速度为 500 rpm/s。如果需要不同的厚度,请根据制造商的说明更改纺纱参数。
- 将晶片在65°C下在加热板上烘烤2分钟,然后在95°C下烘烤5分钟。
- 晶圆冷却后,将晶圆安装在直写光学光刻机的打印室中(见 材料表),并将OLA设计(图2A, 补充编码文件1)送入软件。
注意:OLA设计主要由两个OA通道,两个LO通道和一个IA通道组成,它们合并形成一个六路结,该结继续作为后期制作通道并最终进入实验井(EW)。 - 使用紫外激光(参见 材料表)在镀膜晶圆上打印OLA设计,剂量为300 mJ/ cm 2。
- 打印设计后,将晶圆在65°C下烘烤1分钟,然后在95°C下烘烤3分钟。
- 此时,请确保打印设备的轮廓出现在晶圆上并且肉眼可见。要洗掉未固化的光刻胶,请将晶圆浸入含有显影剂溶液的玻璃烧杯中(参见 材料表),直到未固化的光刻胶完全去除。
注意:过多的显影处理会影响设计分辨率。 - 依次用丙酮、异丙醇和去离子 (DI) 水清洗晶圆,最后用吹气枪用加压空气/N2 清洗晶圆。
- 在150°C下硬烘烤晶圆30分钟,以确保印刷设计牢固地附着在晶圆表面上,并且在下游制造过程中不会脱落。然后,主晶圆就可以进一步使用(图2B)。
2. 准备微流控装置
- 将主晶圆放在一块方形铝片上,并将铝箔缠绕在晶圆周围,形成井状结构(图2C)。
- 在 50 mL 离心管中测量 40 g 聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 和 4 g 固化剂(10:1,重量比,参见 材料表),并使用刮刀或移液器吸头剧烈混合 2-3 分钟。
- PDMS和固化剂的剧烈混合将气泡捕获在混合物内。以100 x g 离心管2-3分钟以去除大部分大气泡。
- 将步骤2.3中制备的约15-20g混合物倒在主晶片上,并使用干燥器脱气。保存多余的混合物以制作PDMS涂层的载玻片(步骤3)。
- 将组件在70°C的烤箱中孵育至少2小时。
- 将主威化从烤箱中取出,让它冷却。要去除固化的PDMS块,请取下铝箔,然后小心地从晶圆边缘剥离PDMS块。
注意:晶圆易碎,可能会破裂,因此仔细执行此过程非常重要。 - 移除PDMS块后,保持图案结构朝上,并使用锋利的刀片或手术刀切割单个PDMS块,每个块包含一个微流体装置。
- 将PDMS块放在黑暗的表面上,并调整光线方向(台灯派上用场),使雕刻的通道有光泽,因此可见。分别使用直径为0.5毫米和3毫米的活检冲头在入口和出口通道上打孔(见 材料表)。
注意:使用锋利的活检打孔以避免PDMS出现裂缝,这可能会导致以后泄漏。轻轻地将活检打孔器推入PDMS阻滞处,并确保其完全通过。要取出活检打孔器,请轻轻缩回,同时向交替方向旋转。具有雕刻OLA设计的PDMS块现在可以绑定到PDMS涂层的载玻片上。
3. 制作 PDMS 镀膜载玻片
- 取透明玻璃盖玻片,将约0.5 mL PDMS(在步骤2.4中过量制备)倒在载玻片的中心,并通过轻轻倾斜载玻片将其铺在盖玻片上,确保PDMS完全覆盖载玻片。
- 将载玻片安装在旋转涂布机上,确保其中心位置(使载玻片的中间与压力轴的中心重叠),并以 500 rpm 的速度旋转载玻片 15 秒(以 100 rpm/s 的增量),然后以 1,000 rpm 的速度旋转 30 秒(以 500 rpm/s 的增量)。
- 将PDMS涂层载玻片(涂层面朝上)放在凸起的平台上,如覆盖的培养皿中的PDMS(1cm x 1cm)块,并在70°C下烘烤2小时。
4. 微流控装置的粘接
- 通过粘贴并去除市售透明胶带(参见 材料表)两次来清洁PDMS块(在步骤2中制备)。确保在使用前保持清洁的一面朝上。
- 使用吹气枪用加压空气/N2 清洁 PDMS 涂层载玻片,并保持清洁面朝上。
- 将PDMS块(雕刻通道朝上)和PDMS涂层载玻片(涂层面朝上)放入等离子清洗器的真空室中(参见 材料表)。
- 打开真空,将内容物暴露在 12 MHz(RF 模式高)的射频等离子体中 15 秒以激活表面。氧气等离子体可以以粉红色调的形式出现。
- 等离子处理后,立即将PDMS涂层载玻片放在干净的表面上,PDMS面朝上。轻轻地放置PDMS块,微流体图案现在朝向PDMS涂层的载玻片,使它们粘合(图2D)。
注意:去除设备中滞留的空气对于确保彻底粘合至关重要。 - 将粘合的器件在70°C烘烤2小时。
5. 微流控器件的表面功能化
注意:在表面功能化之前,重要的是按照制造商的协议(见 材料表)校准压力泵并组装管道以将其连接到微流体装置。
- 将微流体装置连接到压力泵
- 将压力驱动的流量控制器连接到外部压力源(最大 6 bar)。至少需要四个独立的气压通道:三个 0-2 bar 的独立模块和一个 −0.9-4 bar 的模块。
- 根据制造商的方案校准压力泵(见 材料表)。
- 将管子(外径 1/16 x 内径 0.02)切成四个大小相等的碎片,长约 20 厘米。
- 在每件的一端插入 23 G 不锈钢 90° 弯曲连接器(参见 材料表)。该端随后插入微流体装置的三个入口(OA,LO和IA),第四个用于除去多余的溶液(步骤5.2.5)。
- 将管子的另一端插入微流体储液槽支架,并使用微流体接头将其密封,确保管子足够长以接触储液槽底部(1.5 mL管,参见 材料表)。这可以防止在PVA处理/脂质体生产过程中不需要的气泡进入微流体装置。
- 出口通道的PVA处理
注意:在脂质体生成之前,使设备在生产结下游部分亲水至关重要。这是通过用5%(w / v)聚乙烯醇(PVA)溶液处理这些通道来完成的。PVA溶液是通过将PVA粉末(参见 材料表)在80°C的水中溶解3小时,并使用磁力搅拌器不断搅拌来制备的。在用于表面处理之前过滤溶液。器件粘合后,由于等离子体诱导的表面活化,微流体通道立即具有亲水性,并且它们将逐渐再次变得疏水。建议在烘烤后等待2小时(步骤4.6),然后再开始PVA处理。- 将 200 μL 5% w/v PVA 溶液分配到 1.5 mL 管中,并将其连接到微流体储液槽支架。插入管道(步骤5.1.3中提到的管道),使得一端浸没在PVA溶液中,另一端连接到微流体装置的OA通道的入口。
注意:较低的PVA浓度会导致不合标准的表面功能化。 - 在没有PVA的情况下重复上述步骤(空1.5 mL管),并将其连接到LO和IA通道。
- 将OA相的压力增加到100毫巴,以使PVA溶液在OA通道中流动。将IA和LO相的压力增加到120 mbar,以防止PVA溶液在这些通道内回流(图2E)。
注意:如果需要,调整各个通道的压力,以保持弯月面稳定在生产交界处。 - 以这种方式流动PVA溶液约5分钟,确保出口通道完全功能化。
- 要去除 PVA 溶液,请从 OA 入口拆下管子,并立即将 LO 和 IA 通道中的压力增加到 2 bar。同时,使用连接到负压通道(−900 mbar)的管道,首先从出口通道中取出多余的PVA,然后从OA入口中取出多余的PVA(图2F)。
- 将设备在120°C烘烤15分钟,并在使用前冷却。该设备可以在环境条件下存放至少 1 个月。
注意:建议在进行OLA之前等待1天(在室温下),以确保未经处理的PDMS在等离子体处理后恢复其疏水性。
- 将 200 μL 5% w/v PVA 溶液分配到 1.5 mL 管中,并将其连接到微流体储液槽支架。插入管道(步骤5.1.3中提到的管道),使得一端浸没在PVA溶液中,另一端连接到微流体装置的OA通道的入口。
6. 辛醇辅助脂质体组装
- 制备脂质原液
注意:这里使用1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(赖胺罗丹明B磺酰)(Liss Rhod PE)脂质的混合物(见 材料表)作为示例;用户应以类似的方式制备所需的脂质组合物。- 使用单独的玻璃注射器将 76 μL DOPC (25 mg/mL) 和 16.6 μL Liss Rhod PE (1 mg/mL) 分配到圆底烧瓶中。
- 保持圆底烧瓶直立,用压缩的N2吹气枪给予温和的氮气流蒸发氯仿,在烧瓶底部形成干燥的脂膜。
- 将烧瓶放入干燥器中,在连续真空下至少2小时,以除去任何剩余的氯仿。
- 将 100 μL 乙醇加入圆底烧瓶中,然后轻轻移液或摇动以确保脂质溶解形成 10% (w/v) 脂质储备液。
注意:如果特定的脂质组合物不完全溶于乙醇,请使用乙醇/氯仿混合物,保持氯仿的体积尽可能小。 - 将溶液移液到深色玻璃小瓶中。使用吹气枪用氮气轻轻冲洗小瓶,用惰性气氛代替空气。用石蜡膜密封盖子,并储存在-20°C。
注意:储备溶液最多可以使用几个月。每次打开小瓶时,用氮气轻轻地更换空气,并用石蜡膜盖子重新密封。
- 准备 OLA 解决方案
- 制作不可或缺的组分的储备溶液:20 mM 葡聚糖(Mw 6,000);60%(V/V)甘油;选择的缓冲区。在这种情况下,制备5x磷酸盐缓冲盐水(0.68M NaCl,13.5mM KCl,50mM Na 2 HPO 4,9mM KH2PO 4;pH7.4)(见材料表)。
注意:由于纯甘油具有很高的粘度,因此建议在移液器吸头末端以倾斜的方式切出一小块,以便有效移液。 - 准备 100 μL IA、OA 和出口溶液(ES,填充 EW 所需的溶液)样品。为了便于可视化,在这种特殊情况下,将黄色荧光蛋白(YFP)添加到IA溶液中。通过计算封装组分的渗透压并在需要时向OA中添加适量的糖或盐来检查IA和OA之间的渗透平衡。这样做是为了防止脂质体在生产过程中破裂或收缩。
注:三个阶段的最终组成如下:
IA:15% 甘油、5 mM 葡聚糖 (Mw 6,000)、5.4 μM YFP、1x PBS
OA:15% 甘油、5% F68 表面活性剂、1x PBS
ES:15% 甘油,1x PBS
较低浓度的F68表面活性剂会对液的产生负面影响。 - 通过将 4 μL 原液脂质移液到 76 μL 1-辛醇中,制备 80 μL LO 相(参见 材料表)。DOPC的最终浓度为5毫克/毫升。
- 在进行微流体实验之前,将样品以700 x g 离心60秒以除去任何大的聚集体。这可以防止任何明显的堵塞因素进入微流控芯片。
- 制作不可或缺的组分的储备溶液:20 mM 葡聚糖(Mw 6,000);60%(V/V)甘油;选择的缓冲区。在这种情况下,制备5x磷酸盐缓冲盐水(0.68M NaCl,13.5mM KCl,50mM Na 2 HPO 4,9mM KH2PO 4;pH7.4)(见材料表)。
- 脂质体生产
- 将溶液(IA、LO、OA)分配到三个 1.5 mL 管中,组装它们(如步骤 5.1 中所述),并将它们连接到 PVA 处理的微流控芯片(步骤 5.2.6)。
- 在三个通道上施加正压:在 IA 和 LO 通道上施加 ~100 mbar,在 OA 通道上施加 ~200 mbar。
注意:由于OA压力高于其他压力,OA解决方案将首先到达EW;强烈建议这样做。 - 一旦OA溶液达到电子战,将OA压力降低到100毫巴,并将LO增加到200毫巴。 到达生产结的LO解决方案可能会导致气泡,因为空气从LO通道中排出。将气泡分配到电子战中后,将LO压力调节至100毫巴。最后,将 IA 压力增加到 200 mbar,并等待 IA 通道中的所有空气被移除。因此,到达三相交界处的理想顺序是OA、LO和IA。
- 从三个通道中取出空气后,将所有通道压力调节至 50 mbar,并将 10 μL ES 移液到出口室中。移液ES后,在出口孔上放一个盖玻片以避免蒸发。如果LO被推回,则以1 mbar为增量逐渐增加LO压力,直到它开始流向结点。
- 一旦所有三个相开始在连接处共同流动,确保开始生产液,并根据其质量进行调整(图3A-C)。逐渐改变压力(以0.1-1毫巴为步长)而不是突然改变,除非改变压力以消除通道中不必要的堵塞。
注意:要调整的通道取决于交汇点处发生的情况。例如,如果乳液太大,则需要降低IA;如果形成液但破裂而不是被夹掉,则需要增加OA;如果辛醇口袋太大,则需要降低LO。 - 检查液滴是否流向下游的电子战。随着它们的流动,辛醇口袋变得越来越突出,最后被捏掉,形成脂质体(图3D-F)。确保后期生产通道足够长,并且液的迁移足够慢以进行去湿。
注意:在正常生产后的几分钟内,脂质体和辛醇液滴将退出后期生产通道并进入电子战。结果,辛醇液滴的密度低于水,漂浮到ES表面。由于在IA中添加了葡聚糖,脂质体比周围环境重,并进入腔室底部准备观察和进一步操作。
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Representative Results
本研究表明,通过脂质体内部的液-液相分离(LLPS)过程 形成 无膜冷凝物作为代表性实验。
样品制备
IA、OA、ES 和进料溶液 (FS) 的制备方法如下:
IA:12% 甘油、5 mM 葡聚糖、150 mM KCl、5 mg/mL 聚-L-赖氨酸 (PLL)、0.05 mg/mL 聚-L-赖氨酸-FITC 标记 (PLL-FITC)、8 mM 三磷酸腺苷 (ATP)、15 mM 柠檬酸盐酸盐 (pH 4)
OA: 12% v/v 甘油, 5% w/v F68, 150 mM KCl, 15 mM 柠檬酸盐-HCl (pH 4)
ES:12% 甘油、150 mM KCl、15 mM 柠檬酸盐-HCl (pH 4)
满量程:12% 甘油、150 毫米氯化钾、75 毫米盐酸三氢盐酸 (pH 9)
脂质体内形成冷凝物
选择对带正电荷的聚-L-赖氨酸(PLL)和带负电荷的多价三磷酸腺苷(ATP)的pH敏感复合物凝聚的简单测定来证明脂质体中LLPS的现象。为了防止聚赖氨酸和ATP在封装过程中的相分离,溶液的pH值保持在4,此时ATP为中性。通过添加FS(pH 9的缓冲液)来提高ES的pH值,最终由于跨膜质子通量而增加了脂质体内部的pH值,使ATP带负电并通过带正电荷的PLL21触发其相分离(图4A)。脂质体生成约2小时后,关闭IA和LO压力。OA通道压力保持在100毫巴,以缓慢地将剩余的脂质体流入观察室。一旦通道中的所有脂质体在电子战中恢复,压力就会关闭以停止流动并防止脂质体移动。在较低pH下生成的脂质体在其管腔中显示出均匀的荧光(来自封装的荧光PLL-FITC)(图4B,D)。通过小心地从顶部移出 5 μL 溶液来去除漂浮在表面的辛醇液滴,以防止它们影响进一步的移液步骤。随后,向电子战中加入 10 μL FS 缓冲液,诱导封装的 PLL 和 ATP 的相分离。来自每个脂质体的均匀FITC荧光逐渐转化为不同的荧光凝聚液滴。最终,单个液滴合并成一个更大的凝聚液滴,在脂质体内自由扩散(图4C,E-G)。
图 1:显示 OLA 的组装和工作原理图。压力控制器连接到包含外部水溶液、辛醇脂质溶液和内部水溶液的储液罐。插入储液罐的管子连接到OLA装置的相应入口。三个通道中的适当流动导致形成水包水(脂质辛醇)水包液。形成的液迁移到出口孔,在此期间辛醇口袋分离形成脂质体。形成的脂质体被收集在孔的底部,用于可视化和进一步实验。请点击此处查看此图的大图。
图 2:OLA 芯片的制备(光刻、微加工、表面处理)。 (A) 数字设计,显示 OLA 设计的主要特征,包括三个入口、一个出口和一个六路生产接头。(B) 主晶圆示意图,显示使用紫外光刻生产的多个OLA设计。(C)在主晶片上浇铸的PDMS弹性体,放置在由铝箔制成的孔中,并通过在70°C下烘烤2小时固化。 (D)使用氧等离子体处理粘合的微流体装置,其中包含OLA设计的PDMS块连接到PDMS涂层载玻片上。(E)对所制造的芯片进行表面功能化,使器件部分亲水。这是通过将5%w / v PVA从外部水通道流向出口通道5分钟来完成的。其他通道中的正气压会阻止 PVA 溶液进入这些通道。(F) 通过在出口通道中施加真空来去除 PVA。将设备在120°C下烘烤15分钟,然后准备使用。请点击此处查看此图的大图。
图 3:OLA 有效生产单分散液并最终生产具有出色包封性的脂质体的演示。 (A)显示快速产生液液滴的明场图像。(B)荧光脂质通道显示由于部分脱湿而形成辛醇口袋。辛醇脂质相含有DOPC(5 mg/mL)和Lis Rhod PE的混合物,比例为1,000:1。(C)显示黄色荧光蛋白(YFP)包封的内部水通道。插图 (A-C) 显示了各个面板的代表性放大视图(比例尺 = 10 μm)。(D-F)出口通道中的辛醇口袋脱湿,形成脂质体。请点击此处查看此图的大图。
图 4:脂质体中 pLL/ATP 的 pH 触发液-液相分离。 (A) 包封在脂质体内的 pLL 和 ATP 均质溶液(左)到相分离的 pLL/ATP 凝聚物(右)的 pH 依赖性转变示意图。脂质体中的初始酸性环境使ATP的分子电荷为中性,抑制凝聚。当脂质体内部的pH值与外部施加的pH值升高平衡时,ATP获得负电荷,触发凝聚。(乙-丙)折线图(分别对应于面板 [D] 和 [G] 中的虚线)显示了 pLL(绿色通道)和膜(红色通道)的空间分布。(D-G)延时图像显示脂质体内pLL/ATP凝聚形成的形成。外部添加碱性缓冲液可在几分钟内提高脂质体内的pH值并引发凝聚。t = 0 min是指第一次凝聚事件发生之前的时间。请点击此处查看此图的大图。
补充编码文件1:OLA设计的CAD文件。请点击此处下载此文件。
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Discussion
细胞的复杂性使得在整体研究时很难理解活细胞。通过在体外重建关键成分来减少细胞的冗余和互连性对于进一步了解生物系统并为生物技术应用创建人工细胞模拟物是必要的22,23,24。脂质体是理解细胞现象的极好最小系统。这些现象的非详尽列表包括细胞骨架动力学和由此产生的膜变形25,26,生物分子凝聚物的时空调控27,28及其与膜的相互作用29,各种生物分子的封装,包括无细胞转录翻译系统30,无细胞脂质合成31和蛋白质的进化32,33,34.脂质体也被广泛用作药物递送的载体,并已获得美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)的临床应用批准11。脂质体和脂质纳米颗粒被用作药物递送的载体,包括最近的 COVID-19 疫苗35 等 mRNA 疫苗。
本研究描述了光刻、微流体组装和表面功能化的详细协议,以执行 OLA 技术以生成片上脂质体(图 1 和 图 3)。使用OLA产生的脂质体是单分散的(变异系数:平均值的4%-11%),并且在生物细胞大小范围内(通常在直径5-50μm之间),并且可以使用内部和外部水通道的适当流速来调节它们36。例如, 图1所示的脂质体群体的尺寸分布为23.3μm±1.8μm(n = 50)。在典型的10-30 Hz的产生速率下,形成的脂质体是单体的,正如先前通过将单个双层特异性跨膜蛋白α-溶血素36插入膜以及使用连二亚硫酸盐漂白测定37所证实的那样。OLA还与多种脂质组合物兼容,为用户提供了选择脂质的灵活性。重要的是,最初使用的脂质组合物反映在最终的脂质体组合物38中。
作为一项相对较新的技术,OLA还有进一步改进的空间。例如,使用PVA的表面功能化至关重要,但执行起来很乏味。一种更简单、更简单的器件表面功能化方法将显著减少芯片制造时间以及芯片间可变性。Pluronic F68表面活性剂是外水相中初步稳定液的重要成分;尽管如此,在某些情况下,它的使用可能会受到限制。用更具生物相容性的表面活性剂替换Pluronic F68或完全去除表面活性剂可以提高系统的多功能性。在生成的液在出口通道中的迁移过程中,它们可能会因剪切而破裂。升级OLA设计以改善液稳定性和辛醇口袋分离可以提高通量。尽管如此,OLA有几个优点,主要包括高效封装,单分散和单层脂质体以及受控片上实验。
OLA已被用于各种研究,包括脂质体39的生长和分裂,研究液-液相分离的过程27及其与膜21的相互作用,以及了解脂质体40中的细菌生长生物产物形成。基于OLA的高通量测定也被用于了解穿过膜41的离子传输和脂质双层37的药物渗透性,作为用于治疗目的的药物输送系统42,研究抗菌剂对膜的影响43,以及作为封装液晶的工具44。除了OLA技术的广泛应用外,正在开发适合特定用途的OLA的修改版本45,46,47,48,49,50。总体而言,考虑到利弊,我们坚信OLA是合成生物学的多功能平台。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
我们要感谢Dolf Weijers,Vera Gorelova和Mark Roosjen为我们提供YFP。S.D.感谢荷兰研究理事会的财政支持(资助号:OCENW.克莱因.465)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-Octanol | Sigma-Aldrich | No. 297887 | |
1.5 mL tubes | Fisher scientific | 10451043 | Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes |
ATP | Sigma-Aldrich | No. A2383 | |
Biopsy punch | Darwin microfluidics | PT-T983-05 | 0.5 mm and 3 mm diameter |
Citrate-base | Sigma-Aldrich | No. 71405 | |
Dextran | Sigma-Aldrich | No. 31388 | Mr~6,000 |
Direct-write optical lithography machine | Durham Magneto Optics Ltd | MicroWriter ML3 Baby | setup and software |
DOPC lipid | Avanti | SKU:850375C | |
F68 | Sigma-Aldrich | No. 24040032 | |
Glass cover slip | Corning | #1, 24 x 40 mm | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | No. G2025 | |
Hydrochloric acid | Thermo Scientific Acros | No. 124630010 | |
Liss Rhod PE lipid | Avanti | SKU:810150C | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | No. P7793 | |
Photoresist | Micro resist technology GmbH | EpoCore 10 | |
Photoresist developer | micro resist technology GmbH | mr-Dev 600 | |
Plasma cleaner | Harrick plasma | PDC-32G | |
Polydimethylsiloxane | Dow | Sylgard 184 | PDMS and curing agent |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | No. P7890 | |
Poly-L-lysine–FITC Labeled | Sigma-Aldrich | No. P3543 | |
Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | no. P8136 | molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed |
Pressure controller | Elveflow | OBK1 Mk3+ | Flow controller |
Scotch tape | Magic Tape Invisible Matt Tape | ||
Silicon wafer | Silicon Materials | 0620R16002 | |
Spin coater | Laurell Technologies Corporation | Model WS-650MZ-23NPP | |
Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers | Darwin microfluidics | PN-BEN-23G | |
Tris-base | Sigma-Aldrich | No. 252859 | |
Tygon tubing | Darwin microfluidics | 1/16" OD x 0.02" ID | |
UV laser | 365 nm wavelength |
References
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