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Bioengineering

On-Chip-Oktanol-gestützte Liposomen-Assemblierung für die Biotechnologie

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65032
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Laboratory of Physical Chemistry and Soft Matter, Wageningen University & Research
* These authors contributed equally

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Oktanol-unterstützte Liposomenassemblierung (OLA), eine mikrofluidische Technik zur Erzeugung biokompatibler Liposomen. OLA produziert monodisperse, mikrometergroße Liposomen mit effizienter Verkapselung, die sofortige On-Chip-Experimente ermöglichen. Dieses Protokoll soll sich besonders für die synthetische Biologie und die synthetische Zellforschung eignen.

Abstract

Die Mikrofluidik ist ein weit verbreitetes Werkzeug, um Tröpfchen und Vesikel verschiedener Art kontrolliert und mit hohem Durchsatz zu erzeugen. Liposomen sind vereinfachte zelluläre Nachahmer, die aus einem wässrigen Inneren bestehen, das von einer Lipiddoppelschicht umgeben ist. Sie sind wertvoll für das Design synthetischer Zellen und das Verständnis der Grundlagen biologischer Zellen in vitro und sind wichtig für angewandte Wissenschaften, wie z. B. die Frachtlieferung für therapeutische Anwendungen. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Arbeitsprotokoll für eine mikrofluidische On-Chip-Technik, die Oktanol-unterstützte Liposomenassemblierung (OLA), zur Herstellung monodisperser, mikrometergroßer, biokompatibler Liposomen. OLA funktioniert ähnlich wie das Blasblasen, bei dem eine innere wässrige (IA) Phase und eine umgebende lipidtragende 1-Oktanol-Phase durch tensidhaltige äußere Flüssigkeitsströme abgeklemmt werden. Dadurch entstehen leicht Doppelemulsionströpfchen mit hervorstehenden Oktanoltaschen. Wenn sich die Lipiddoppelschicht an der Tröpfchengrenzfläche zusammensetzt, löst sich die Tasche spontan ab, wodurch ein unilamellares Liposom entsteht, das für weitere Manipulationen und Experimente bereit ist. OLA bietet mehrere Vorteile, wie z. B. eine stetige Liposomenbildung (>10 Hz), eine effiziente Verkapselung von Biomaterialien und monodisperse Liposomenpopulationen, und erfordert sehr kleine Probenvolumina (~50 μl), was bei der Arbeit mit wertvollen Biologika entscheidend sein kann. Die Studie enthält Details zur Mikrofabrikation, Softlithographie und Oberflächenpassivierung, die für die Etablierung der OLA-Technologie im Labor erforderlich sind. Ein Proof-of-Principle-Anwendungsfall in der synthetischen Biologie wird auch gezeigt, indem die Bildung von biomolekularen Kondensaten in den Liposomen über den Transmembranprotonenfluss induziert wird. Es wird erwartet, dass dieses begleitende Videoprotokoll den Lesern die Einrichtung und Fehlerbehebung von OLA in ihren Laboren erleichtern wird.

Introduction

Alle Zellen haben eine Plasmamembran als physikalische Grenze, und diese Membran ist im Wesentlichen ein Gerüst in Form einer Lipiddoppelschicht, die durch die Selbstorganisation amphiphiler Lipidmoleküle gebildet wird. Liposomen sind die minimalen synthetischen Gegenstücke biologischer Zellen; Sie haben ein wässriges Lumen, das von Phospholipiden umgeben ist, die eine Lipiddoppelschicht bilden, wobei die hydrophilen Kopfgruppen der wässrigen Phase zugewandt sind und die hydrophoben Schwänze nach innen vergraben sind. Die Stabilität von Liposomen wird durch den hydrophoben Effekt sowie die Hydrophilie zwischen den polaren Gruppen, die Van-der-Waals-Kräfte zwischen den hydrophoben Kohlenstoffschwänzen und die Wasserstoffbrückenbindung zwischen Wassermolekülen und den hydrophilen Köpfenbestimmt 1,2. Abhängig von der Anzahl der Lipiddoppelschichten können Liposomen in zwei Hauptkategorien eingeteilt werden, nämlich unilamellare Vesikel, die aus einer einzigen Doppelschicht bestehen, und mehrlamellare Vesikel, die aus mehreren Doppelschichten aufgebaut sind. Unilamelläre Vesikel werden weiter nach ihrer Größe klassifiziert. Sie sind in der Regel kugelförmig und können in einer Vielzahl von Größen hergestellt werden, darunter kleine unilamellare Vesikel (SUV, 30-100 nm Durchmesser), große unilamellare Vesikel (LUV, 100-1.000 nm Durchmesser) und schließlich riesige unilamellare Vesikel (GUV, >1.000 nm Durchmesser)3,4. Es wurden verschiedene Techniken zur Herstellung von Liposomen entwickelt, die grob in Bulk-Techniken5 und mikrofluidische Techniken6 unterteilt werden können. Zu den häufig praktizierten Bulk-Techniken gehören Lipidfilmrehydrierung, Elektroformation, invertierter Emulsionstransfer und Extrusion 7,8,9,10. Diese Techniken sind relativ einfach und effektiv, und dies sind die Hauptgründe für ihre weit verbreitete Verwendung in der Gemeinschaft der synthetischen Biologie. Gleichzeitig weisen sie jedoch große Nachteile in Bezug auf die Polydispersität in der Größe, die mangelnde Kontrolle über die Lamellenstruktur und die geringe Verkapselungseffizienzauf 7,11. Techniken wie Continuous Droplet Interface Crossing Encapsulation (cDICE)12 und Droplet Shooting and Size Filtration (DSSF)13 überwinden diese Einschränkungen bis zu einem gewissen Grad.

Mikrofluidische Ansätze haben in den letzten zehn Jahren an Bedeutung gewonnen. Die Mikrofluidik-Technologie bietet aufgrund der charakteristischen laminaren Strömung und des diffusionsdominierten Stofftransfers eine kontrollierbare Umgebung für die Manipulation von Fluidströmungen innerhalb benutzerdefinierter Mikrokanäle. Die daraus resultierenden Lab-on-a-Chip-Geräte bieten einzigartige Möglichkeiten für die raumzeitliche Kontrolle von Molekülen mit deutlich reduzierten Probenvolumina und Multiplexing-Fähigkeiten14. Zahlreiche mikrofluidische Methoden zur Herstellung von Liposomen wurden entwickelt, darunter das gepulste Jetting 15, das Doppelemulsions-Templating 16, der transiente Membranauswurf 17, der Tröpfchenemulsionstransfer 18 und die hydrodynamische Fokussierung 19. Diese Techniken erzeugen monodisperse, unilamellare Liposomen in Zellgröße mit hoher Verkapselungseffizienz und hohem Durchsatz.

Dieser Artikel beschreibt detailliert das Verfahren für die Oktanol-unterstützte Liposomenassemblierung (OLA), eine mikrofluidische On-Chip-Methode, die auf dem hydrodynamischen Pinch-off- und anschließenden Lösungsmittel-Entnetzungsmechanismus20 basiert (Abbildung 1). Man kann die Funktionsweise von OLA mit einem Blasenblasprozess in Verbindung bringen. Eine Sechs-Wege-Verbindung fokussiert die innere wässrige (IA) Phase, zwei lipidtragende organische (LO) Ströme und zwei tensidhaltige äußere wässrige (OA) Ströme an einer einzigen Stelle. Dies führt zu Wasser-in-(Lipiden + Oktanol)-in-Wasser-Doppelemulsionströpfchen. Wenn diese Tröpfchen stromabwärts fließen, führen die Minimierung der Grenzflächenenergie, die externe Scherströmung und die Wechselwirkung mit den Kanalwänden zur Bildung einer Lipiddoppelschicht an der Grenzfläche, wenn sich die Lösungsmitteltasche ablöst und so unilamellare Liposomen bilden. Abhängig von der Größe der Oktanoltasche kann der Entnetzungsprozess mehrere zehn Sekunden bis einige Minuten dauern. Am Ende des Austrittskanals schwimmen die weniger dichten Oktanoltröpfchen an die Oberfläche, während die schwereren Liposomen (aufgrund einer dichteren verkapselten Lösung) experimentierbereit auf den Boden der Visualisierungskammer sinken. Als repräsentatives Experiment wird der Prozess der Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) innerhalb von Liposomen demonstriert. Dazu werden die benötigten Komponenten in Liposomen bei einem sauren pH-Wert verkapselt, der LLPS verhindert. Durch die äußere Auslösung einer pH-Änderung und damit eines transmembranen Protonenflusses bilden sich phasengetrennte Kondensattröpfchen im Inneren der Liposomen. Dies unterstreicht die effektiven Verkapselungs- und Manipulationsmöglichkeiten des OLA-Systems.

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Protocol

1. Herstellung des Master-Wafers

  1. Nehmen Sie einen sauberen Siliziumwafer mit einem Durchmesser von 10 cm (4 Zoll) (siehe Materialtabelle). Reinigen Sie es weiter mit Druckluft, um Staubpartikel zu entfernen.
  2. Montieren Sie den Wafer auf einem Spin-Coater und geben Sie vorsichtig ~5 ml eines negativen Fotolacks (siehe Materialtabelle) in der Mitte des Wafers ab. Versuchen Sie, Luftblasen zu vermeiden, da diese den nachgelagerten Druckprozess des Wafers stören könnten.
  3. Um eine 10 μm dicke Fotolackschicht zu erhalten, schleudern Sie den Wafer 30 s lang bei 500 U/min mit einer Beschleunigung von 100 U/min für die anfängliche Spreizung, gefolgt von einem 60 s Spin bei 3.000 U/min mit einer Beschleunigung von 500 U/min. Falls eine andere Dicke gewünscht wird, ändern Sie die Spinnparameter gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  4. Die Waffel auf einer Heizplatte 2 min bei 65 °C und dann 5 min bei 95 °C backen.
  5. Sobald der Wafer abgekühlt ist, montieren Sie den Wafer in der Druckkammer des optischen Lithographiegeräts mit Direktbeschreibung (siehe Materialtabelle) und führen Sie das OLA-Design (Abbildung 2A, Supplementary Coding File 1) in die Software ein.
    HINWEIS: Das OLA-Design besteht im Wesentlichen aus zwei OA-Kanälen, zwei LO-Kanälen und einem IA-Kanal, die zu einer Sechs-Wege-Verbindung verschmelzen, die sich als Postproduktionskanal fortsetzt und im Experimentalbrunnen (EW) endet.
  6. Drucken Sie das/die OLA-Design(s) mit einem UV-Laser (siehe Materialtabelle) mit einer Dosis von 300 mJ/cm2 auf den beschichteten Wafer.
  7. Sobald das Design gedruckt ist, backen Sie die Waffel bei 65 °C für 1 Minute, gefolgt von 95 °C für 3 Minuten.
  8. Stellen Sie an dieser Stelle sicher, dass der Umriss des gedruckten Geräts auf dem Wafer erscheint und mit bloßem Auge sichtbar ist. Um den nicht ausgehärteten Fotolack abzuwaschen, tauchen Sie den Wafer in ein Glasbecherglas mit der Entwicklerlösung (siehe Materialtabelle), bis der nicht ausgehärtete Fotolack vollständig entfernt ist.
    HINWEIS: Eine übermäßige Entwicklerbehandlung kann sich auf die Designauflösung auswirken.
  9. Waschen Sie den Wafer nacheinander mit Aceton, Isopropanol und deionisiertem Wasser (DI) und schließlich mit Druckluft/N2 unter Verwendung einer Blaspistole.
  10. Brennen Sie den Wafer bei 150 °C für 30 min hart, um sicherzustellen, dass das gedruckte Design fest auf der Waferoberfläche haftet und sich im nachgelagerten Herstellungsprozess nicht ablöst. Der Master-Wafer ist dann bereit für die weitere Verwendung (Abbildung 2B).

2. Vorbereiten des mikrofluidischen Geräts

  1. Legen Sie den Master-Wafer auf ein quadratisches Stück Aluminium und wickeln Sie die Aluminiumfolie um den Wafer, um eine gut aussehende Struktur zu bilden (Abbildung 2C).
  2. 40 g Polydimethylsiloxan (PDMS) und 4 g Härter (10:1, Gewichtsverhältnis, siehe Materialtabelle) in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen abmessen und mit einem Spatel oder einer Pipettenspitze 2-3 Minuten lang kräftig mischen.
  3. Durch die kräftige Vermischung von PDMS und Härter werden Luftblasen in der Mischung eingeschlossen. Drehen Sie das Röhrchen bei 100 x g für 2-3 Minuten, um die meisten großen Luftblasen zu entfernen.
  4. Gießen Sie ca. 15-20 g der in Schritt 2.3 hergestellten Mischung über die Masterwaffel und entgasen Sie sie mit einem Exsikkator. Bewahren Sie die überschüssige Mischung auf, um PDMS-beschichtete Glasobjektträger herzustellen (Schritt 3).
  5. Die Assemblierung wird im Ofen bei 70 °C mindestens 2 h inkubiert.
  6. Die Masterwaffel aus dem Ofen nehmen und abkühlen lassen. Um den erstarrten PDMS-Block zu entfernen, entfernen Sie die Aluminiumfolie und ziehen Sie den PDMS-Block vorsichtig vom Rand des Wafers ab.
    Anmerkungen: Der Wafer ist zerbrechlich und kann brechen, daher ist es wichtig, diesen Vorgang sorgfältig durchzuführen.
  7. Sobald der PDMS-Block entfernt ist, halten Sie die gemusterte Struktur nach oben gerichtet und schneiden Sie mit einer scharfen Klinge oder einem Skalpell einzelne PDMS-Blöcke ab, die jeweils ein einzelnes mikrofluidisches Gerät enthalten.
  8. Legen Sie den PDMS-Block auf eine dunkle Fläche und stellen Sie die Lichtrichtung so ein (eine Tischlampe ist dafür praktisch), dass die gravierten Kanäle glänzend und dadurch sichtbar sind. Bohren Sie Löcher in die Einlässe und den Austrittskanal mit Biopsiestanzen von 0,5 mm bzw. 3 mm Durchmesser (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Verwenden Sie eine scharfe Biopsiestanze, um Risse im PDMS zu vermeiden, die später zu Undichtigkeiten führen können. Schieben Sie die Biopsiestanze vorsichtig durch den PDMS-Block und stellen Sie sicher, dass sie vollständig durch ihn hindurchgeht. Um die Biopsiestanze zu entfernen, ziehen Sie sie vorsichtig zurück, während Sie sie in andere Richtungen drehen. Der PDMS-Block mit dem eingravierten OLA-Design ist nun bereit für die Bindung an einen PDMS-beschichteten Objektträger.

3. Herstellen des PDMS-beschichteten Glasobjektträgers

  1. Nehmen Sie ein transparentes Glasdeckglas, gießen Sie ca. 0,5 ml PDMS (im Überschuss in Schritt 2.4 vorbereitet) auf die Mitte des Objektträgers und verteilen Sie es durch leichtes Kippen des Objektträgers auf dem Deckglas, um eine vollständige Abdeckung des Objektträgers mit PDMS zu gewährleisten.
  2. Montieren Sie den Objektträger auf dem Schleuderbeschichter, stellen Sie sicher, dass er mittig platziert ist (so dass sich die Mitte des Objektträgers mit der Mitte der Druckwelle überlappt), und drehen Sie den Objektträger 15 s lang mit 500 U/min (in Schritten von 100 U/min) und dann 30 s lang mit 1.000 U/min (in Schritten von 500 U/min).
  3. Legen Sie den PDMS-beschichteten Glasobjektträger (beschichtete Seite nach oben) auf eine erhöhte Plattform wie einen PDMS-Block (1 cm x 1 cm) in eine abgedeckte Petrischale und backen Sie ihn bei 70 °C 2 h lang.

4. Verklebung des mikrofluidischen Gerätes

  1. Reinigen Sie den PDMS-Block (vorbereitet in Schritt 2), indem Sie handelsübliches Klebeband (siehe Materialtabelle) zweimal aufkleben und entfernen. Achten Sie darauf, dass die gereinigte Seite bis zur Verwendung nach oben zeigt.
  2. Reinigen Sie den PDMS-beschichteten Objektträger mit Druckluft/N2 mit einer Blaspistole und halten Sie die saubere Seite nach oben.
  3. Legen Sie den PDMS-Block (gravierte Kanäle nach oben) und den PDMS-beschichteten Glasobjektträger (beschichtete Seite nach oben) in die Vakuumkammer des Plasmareinigers (siehe Materialtabelle).
  4. Schalten Sie das Vakuum ein und setzen Sie den Inhalt 15 s lang einem Luftplasma mit einer Radiofrequenz von 12 MHz (HF-Modus hoch) aus, um die Oberflächen zu aktivieren. Sauerstoffplasma ist in Form eines rosafarbenen Farbtons zu sehen.
  5. Legen Sie den PDMS-beschichteten Objektträger unmittelbar nach der Plasmabehandlung mit der PDMS-Seite nach oben auf eine saubere Oberfläche. Platzieren Sie den PDMS-Block vorsichtig so, dass das mikrofluidische Muster nun in Richtung des PDMS-beschichteten Objektträgers zeigt, damit sie sich verbinden können (Abbildung 2D).
    Anmerkungen: Das Entfernen der im Gerät eingeschlossenen Luft ist entscheidend, um eine gründliche Verklebung zu gewährleisten.
  6. Backen Sie die geklebten Geräte bei 70 °C für 2 h.

5. Oberflächenfunktionalisierung des mikrofluidischen Gerätes

Anmerkungen: Vor der Oberflächenfunktionalisierung ist es wichtig, die Druckpumpe gemäß dem Protokoll des Herstellers (siehe Materialtabelle) zu kalibrieren und den Schlauch zu montieren, um ihn mit dem mikrofluidischen Gerät zu verbinden.

  1. Anschluss des mikrofluidischen Geräts an die Druckpumpen
    1. Schließen Sie den druckgesteuerten Durchflussregler an eine externe Druckquelle (bis zu 6 bar) an. Es sind mindestens vier unabhängige Luftdruckkanäle erforderlich: drei Einzelmodule von 0-2 bar und ein Modul von −0,9-4 bar.
    2. Kalibrieren Sie die Druckpumpe gemäß dem Protokoll des Herstellers (siehe Materialtabelle).
    3. Schneiden Sie den Schlauch (1/16 Zoll Außendurchmesser x 0,02 Zoll Innendurchmesser) in vier gleich große Stücke mit einer Länge von ca. 20 cm.
    4. Setzen Sie 23 G Edelstahl-Verbinder mit 90° gebogenem Stahl (siehe Materialtabelle) an einem Ende jedes Stücks ein. Dieses Ende wird später in die drei Einlässe (OA, LO und IA) des mikrofluidischen Geräts eingeführt, und das vierte Ende wird verwendet, um überschüssige Lösung zu entfernen (Schritt 5.2.5).
    5. Führen Sie das andere Ende des Schlauchs in den Ständer des mikrofluidischen Reservoirs ein und verschließen Sie es mit mikrofluidischen Fittings, wobei Sie sicherstellen, dass der Schlauch lang genug ist, um den Boden des Reservoirs zu berühren (1,5-ml-Röhrchen, siehe Materialtabelle). Dadurch wird verhindert, dass unerwünschte Luftblasen während der PVA-Behandlung/Liposomenproduktion in das mikrofluidische Gerät gelangen.
  2. PVA-Behandlung des Austrittskanals
    HINWEIS: Vor der Liposomenbildung ist es wichtig, das Gerät stromabwärts der Produktionsstelle teilweise hydrophil zu machen. Dies geschieht durch die Behandlung dieser Kanäle mit einer 5%igen (w/v) Polyvinylalkohol (PVA)-Lösung. Die Herstellung der PVA-Lösung erfolgt durch Auflösen des PVA-Pulvers (siehe Materialtabelle) in Wasser bei 80 °C für 3 h unter ständigem Rühren unter Verwendung eines Magnetrührers. Filtern Sie die Lösung, bevor Sie sie für die Oberflächenbehandlung verwenden. Unmittelbar nach der Verklebung des Gerätes sind die mikrofluidischen Kanäle durch die plasmainduzierte Oberflächenaktivierung hydrophil und werden nach und nach wieder hydrophob. Es wird empfohlen, nach dem Backen (Schritt 4.6) 2 Stunden zu warten, bevor mit der PVA-Behandlung begonnen wird.
    1. Geben Sie 200 μl 5%ige w/v PVA-Lösung in ein 1,5-ml-Röhrchen und schließen Sie es an den mikrofluidischen Reservoirständer an. Führen Sie den Schlauch (den in Schritt 5.1.3 erwähnten) so ein, dass ein Ende in die PVA-Lösung eingetaucht ist und das andere Ende mit dem Einlass des OA-Kanals des mikrofluidischen Geräts verbunden ist.
      HINWEIS: Eine niedrigere PVA-Konzentration kann zu einer minderwertigen Oberflächenfunktionalisierung führen.
    2. Wiederholen Sie den obigen Schritt ohne PVA (leeres 1,5-ml-Röhrchen) und schließen Sie es an die LO- und IA-Kanäle an.
    3. Erhöhen Sie den Druck der OA-Phase auf 100 mbar, um die PVA-Lösung in die OA-Kanäle fließen zu lassen. Erhöhen Sie die Drücke der IA- und LO-Phasen auf 120 mbar, um den Rückfluss der PVA-Lösung in diesen Kanälen zu verhindern (Abbildung 2E).
      Anmerkungen: Passen Sie bei Bedarf die Drücke der einzelnen Kanäle an, um den Meniskus an der Produktionsstelle stabil zu halten.
    4. Lassen Sie die PVA-Lösung auf diese Weise ca. 5 Minuten lang fließen, um eine vollständige Funktionalisierung des Austrittskanals zu gewährleisten.
    5. Um die PVA-Lösung zu entfernen, lösen Sie den Schlauch vom OA-Einlass und erhöhen Sie sofort den Druck in den LO- und IA-Kanälen auf 2 bar. Verwenden Sie gleichzeitig einen Schlauch, der an einen Unterdruckkanal (−900 mbar) angeschlossen ist, um überschüssiges PVA zuerst aus dem Austrittskanal und dann aus dem OA-Einlass zu entfernen (Abbildung 2F).
    6. Backen Sie das Gerät 15 Minuten lang bei 120 °C und lassen Sie es vor Gebrauch abkühlen. Das Gerät kann mindestens 1 Monat unter Umgebungsbedingungen gelagert werden.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, 1 Tag (bei Raumtemperatur) zu warten, bevor Sie mit OLA fortfahren, um sicherzustellen, dass das unbehandelte PDMS nach der Plasmabehandlung seine Hydrophobie wiedererlangt.

6. Oktanol-unterstützte Liposomen-Assemblierung (OLA)

  1. Zubereitung des Lipidstocks
    HINWEIS: Hier wird ein Gemisch aus 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) und 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(lissamin-rhodamin-B-sulfonyl) (Liss Rhod PE)-Lipiden (siehe Materialtabelle) als Beispiel verwendet; Anwender sollten die benötigte Lipidzusammensetzung auf ähnliche Weise vorbereiten.
    1. Geben Sie 76 μl DOPC (25 mg/ml) und 16,6 μl Liss Rhod PE (1 mg/ml) mit separaten Glasspritzen in einen Rundkolben ab.
    2. Halten Sie den Rundkolben aufrecht und verwenden Sie eine komprimierte N 2-Blaspistole, um einen sanften Stickstoffstrahl abzugeben, um das Chloroform zu verdampfen und einen getrockneten Lipidfilm am Boden des Kolbens zu bilden.
    3. Stellen Sie den Kolben für mindestens 2 h unter kontinuierliches Vakuum in den Exsikkator, um das restliche Chloroform zu entfernen.
    4. Geben Sie 100 μl Ethanol in den Rundkolben und pipettieren oder schütteln Sie ihn vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Lipide aufgelöst werden, um einen 10%igen (w/v) Lipidstock zu bilden.
      Anmerkungen: Falls eine bestimmte Lipidzusammensetzung nicht vollständig in Ethanol löslich ist, verwenden Sie ein Ethanol/Chloroform-Gemisch und halten Sie das Chloroformvolumen so gering wie möglich.
    5. Pipettieren Sie die Lösung in eine Durchstechflasche aus dunklem Glas. Spülen Sie die Durchstechflasche vorsichtig mit Stickstoff mit einer Blaspistole, um die Luft durch eine inerte Atmosphäre zu ersetzen. Verschließen Sie den Deckel mit Paraffinfolie und lagern Sie ihn bei −20 °C.
      HINWEIS: Die Stammlösung kann bis zu einigen Monaten verwendet werden. Ersetzen Sie jedes Mal, wenn die Durchstechflasche geöffnet wird, vorsichtig die Luft durch Stickstoff und verschließen Sie den Deckel wieder mit Paraffinfolie.
  2. Vorbereiten der OLA-Lösungen
    1. Stellen Sie Standardlösungen aus den unverzichtbaren Komponenten her: 20 mM Dextran (Mw 6.000); 60% (v/v) Glycerin; ein Puffer der Wahl. In diesem Fall wurde 5x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (0,68 M NaCl, 13,5 mM KCl, 50 mMNa2HPO4, 9 mMKH2PO4; pH 7,4) hergestellt (siehe Materialtabelle).
      Anmerkungen: Da reines Glycerin hochviskos ist, wird empfohlen, ein kleines Stück am Ende der Pipettenspitze schräg herauszuschneiden, um ein effektives Pipettieren zu gewährleisten.
    2. Bereiten Sie 100 μl IA-, OA- und Ausgangslösungsproben (ES, die gewünschte Lösung zum Befüllen des EW) vor. Zur leichteren Visualisierung wurde in diesem speziellen Fall gelb fluoreszierendes Protein (YFP) zur IA-Lösung hinzugefügt. Überprüfen Sie das osmotische Gleichgewicht zwischen IA und OA, indem Sie die Osmolarität der verkapselten Komponenten berechnen und bei Bedarf eine angemessene Menge Zucker oder Salz in die OA geben. Dies geschieht, um das Platzen oder Schrumpfen der Liposomen während der Produktion zu verhindern.
      HINWEIS: Die endgültigen Zusammensetzungen der drei Phasen lauten wie folgt:
      IA: 15% Glycerin, 5 mM Dextran (Mw 6.000), 5,4 μM YFP, 1x PBS
      OA: 15% Glycerin, 5% F68 Tensid, 1x PBS
      ES: 15% Glycerin, 1x PBS
      Eine geringere Konzentration des F68-Tensids wirkt sich negativ auf die Bildung von Doppelemulsionen aus.
    3. Bereiten Sie 80 μl der LO-Phase vor, indem Sie 4 μl Stammlipid in 76 μl 1-Oktanol pipettieren (siehe Materialtabelle). Die Endkonzentration von DOPC beträgt 5 mg/ml.
    4. Zentrifugieren Sie die Proben bei 700 x g für 60 s, um alle großen Aggregate zu entfernen, bevor Sie mit den mikrofluidischen Experimenten fortfahren. Dadurch wird verhindert, dass offensichtliche Verstopfungsfaktoren in den mikrofluidischen Chip gelangen.
  3. Liposomenproduktion
    1. Geben Sie die Lösungen (IA, LO, OA) in drei 1,5-ml-Röhrchen, setzen Sie sie zusammen (wie in Schritt 5.1 erwähnt) und verbinden Sie sie mit dem PVA-behandelten Mikrofluidik-Chip (Schritt 5.2.6).
    2. Üben Sie einen Überdruck auf die drei Kanäle aus: ~100 mbar auf den IA- und LO-Kanälen und ~200 mbar auf dem OA-Kanal.
      HINWEIS: Da der OA-Druck höher ist als bei den anderen, wird die OA-Lösung die erste sein, die bei EW eintrifft. Dies wird dringend empfohlen.
    3. Sobald die OA-Lösung EW erreicht hat, verringern Sie den OA-Druck auf 100 mbar und erhöhen Sie den LO auf 200 mbar.  Die LO-Lösung, die an der Produktionsstelle ankommt, führt wahrscheinlich zu Luftblasen, da Luft aus den LO-Kanälen verdrängt wird. Sobald die Luftblasen in den EW abgegeben wurden, stellen Sie den LO-Druck auf 100 mbar ein. Erhöhen Sie zum Schluss den IA-Druck auf 200 mbar und warten Sie, bis die gesamte Luft im IA-Kanal entfernt ist. Die ideale Reihenfolge der Ankunft am Übergang der drei Phasen ist also OA, LO und IA.
    4. Nachdem Sie die Luft aus den drei Kanälen entfernt haben, stellen Sie alle Kanaldrücke auf 50 mbar ein und pipettieren Sie 10 μl ES in die Austrittskammer. Setzen Sie nach dem Pipettieren des ES einen Abdeckschieber auf das Austrittsloch, um eine Verdunstung zu vermeiden. Falls der LO zurückgedrückt wird, erhöhen Sie den LO-Druck allmählich in Schritten von 1 mbar, bis er zum Diaphragma zu fließen beginnt.
    5. Sobald alle drei Phasen an der Verbindungsstelle mitfließen, stellen Sie sicher, dass die doppelte Emulsionsproduktion beginnt, und passen Sie sie entsprechend ihrer Qualität an (Abbildung 3A-C). Ändern Sie die Drücke schrittweise (in Schritten von 0,1 bis 1 mbar) und nicht abrupt, es sei denn, der Druck wird geändert, um eine unerwünschte Verstopfung im Kanal zu beseitigen.
      HINWEIS: Welche Kanäle angepasst werden müssen, hängt davon ab, was an der Kreuzung passiert. Zum Beispiel muss die IA verringert werden, wenn die Emulsionen zu groß sind; die OA muss erhöht werden, wenn sich doppelte Emulsionen bilden, aber platzen, anstatt abgeklemmt zu werden; und der LO muss verringert werden, wenn die Oktanoltasche zu groß ist.
    6. Prüfen Sie, ob die Tröpfchen der Doppelemulsion stromabwärts zu EW fließen. Während des Fließens treten die Oktanoltaschen immer stärker hervor und werden schließlich abgeklemmt, wodurch Liposomen gebildet werden (Abbildung 3D-F). Stellen Sie sicher, dass der Postproduktionskanal lang genug ist und dass die Migration der Doppelemulsionen langsam genug ist, um sie zu entnetzen.
      HINWEIS: Innerhalb von Minuten nach der anständigen Produktion verlassen Liposomen und Oktanoltröpfchen den Postproduktionskanal und gelangen in den EW. Infolgedessen schwimmen die Oktanoltröpfchen, da sie weniger dicht als Wasser sind, an die Oberfläche des ES. Durch die Zugabe von Dextran in der IA sind die Liposomen schwerer als ihre Umgebung und gehen zur Beobachtung und weiteren Manipulation auf den Boden der Kammer.

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Representative Results

Diese Arbeit demonstriert als repräsentatives Experiment die Bildung membranloser Kondensate durch den Prozess der Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) in Liposomen.

Probenvorbereitung
Die IA-, OA-, ES- und Feed-Lösung (FS) werden wie folgt hergestellt:

IA: 12 % Glycerin, 5 mM Dextran, 150 mM KCl, 5 mg/ml Poly-L-Lysin (PLL), 0,05 mg/ml Poly-L-Lysin-FITC-markiert (PLL-FITC), 8 mM Adenosintriphosphat (ATP), 15 mM Citrat-HCl (pH 4)

OA: 12% v/v Glycerin, 5% w/v F68, 150 mM KCl, 15 mM Citrat-HCl (pH 4)

ES: 12% Glycerin, 150 mM KCl, 15 mM Citrat-HCl (pH 4)

FS: 12% Glycerin, 150 mM KCl, 75 mM Tris-HCl (pH 9)

Kondensatbildung in Liposomen
Ein einfacher Assay der pH-sensitiven komplexen Koazervation von positiv geladenem Poly-L-Lysin (PLL) und negativ geladenem multivalentem Adenosintriphosphat (ATP) wurde ausgewählt, um das Phänomen von LLPS in Liposomen zu demonstrieren. Um eine Phasentrennung von Polylysin und ATP während der Verkapselung zu verhindern, wurde der pH-Wert der Lösung bei 4 gehalten, bei dem ATP neutral ist. Die Erhöhung des pH-Werts des ES durch Zugabe von FS (einem Puffer von pH 9) erhöhte schließlich den pH-Wert in den Liposomen aufgrund des Transmembranprotonenflusses, wodurch ATP negativ geladen wurde und seine Phasentrennung mit positiv geladenem PLL21 ausgelöst wurde (Abbildung 4A). Nach ca. 2 h Liposomenbildung wurden die IA- und LO-Drücke abgeschaltet. Der Druck des OA-Kanals wurde auf 100 mbar gehalten, um die verbleibenden Liposomen langsam in die Beobachtungskammer zu fließen. Nachdem alle Liposomen im Kanal in der EW wiederhergestellt waren, wurden die Drücke abgeschaltet, um den Fluss zu stoppen und zu verhindern, dass sich die Liposomen bewegen. Die bei niedrigerem pH-Wert erzeugten Liposomen zeigten eine homogene Fluoreszenz (aus dem verkapselten fluoreszierenden PLL-FITC) in ihrem Lumen (Abbildung 4B,D). An der Oberfläche schwimmende Oktanoltröpfchen wurden durch vorsichtiges Herauspipettieren von 5 μl Lösung von oben entfernt, um zu verhindern, dass sie weitere Pipettierschritte beeinträchtigen. Anschließend wurden 10 μL FS-Puffer in die EW gegeben, was eine Phasentrennung der verkapselten PLL und ATP induzierte. Die homogene FITC-Fluoreszenz von jedem Liposom wandelte sich allmählich in unterschiedliche fluoreszierende Kondensattröpfchen um. Schließlich verschmolzen die einzelnen Tröpfchen zu einem größeren Kondensattröpfchen, das frei in den Liposomen diffundierte (Abbildung 4C, E-G).

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Zusammenbaus und der Funktionsweise von OLA. Der Druckregler ist mit den Reservoirs verbunden, die äußere wässrige, Lipid-in-Oktanol- und innere wässrige Lösungen enthalten. Die in die Reservoirs eingelegten Schläuche werden mit den jeweiligen Einlässen des OLA-Gerätes verbunden. Entsprechende Strömungen in den drei Kanälen führen zur Bildung von Wasser-in-(Lipid-in-Octanol)-in-Wasser-Doppelemulsionen. Die gebildeten Doppelemulsionen wandern in die Austrittsvertiefung, wobei sich die Oktanoltaschen ablösen und Liposomen bilden. Die gebildeten Liposomen werden am Boden der Vertiefung gesammelt, um sie zu visualisieren und weiter zu experimentieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Präparation des OLA-Chips (Fotolithographie, Mikrofabrikation, Oberflächenbehandlung). (A) Digitales Design, das die wichtigsten Merkmale des OLA-Designs zeigt, einschließlich drei Einlässen, einem Auslass und einer sechsfachen Produktionsverbindung. (B) Ein Schema des Master-Wafers, das mehrere OLA-Designs zeigt, die mit UV-Lithographie hergestellt wurden. (C) Ein PDMS-Elastomer, das auf den Master-Wafer gegossen wird, in eine aus Aluminiumfolie hergestellte Vertiefung gelegt und durch Einbrennen bei 70 °C für 2 h ausgehärtet wird. (D) Eine mikrofluidische Vorrichtung, die durch Sauerstoffplasmabehandlung geklebt wird, wobei der PDMS-Block, der das OLA-Design enthält, auf einem PDMS-beschichteten Glasobjektträger befestigt ist. (E) Oberflächenfunktionalisierung des hergestellten Chips, um die Vorrichtung teilweise hydrophil zu machen. Dies geschieht durch Fließen von 5 % w/v PVA für 5 min aus dem äußeren wässrigen Kanal in Richtung des Austrittskanals. Ein positiver Luftdruck in den anderen Kanälen verhindert, dass die PVA-Lösung in diese Kanäle eindringt. (F) PVA wird durch Anlegen eines Vakuums im Austrittskanal entfernt. Das Gerät wird bei 120 °C für 15 min gebacken und ist dann einsatzbereit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Demonstration der effizienten Herstellung von monodispersen Doppelemulsionen und schließlich Liposomen mit ausgezeichneter Verkapselung. (A) Ein Hellfeldbild, das die schnelle Erzeugung von Doppelemulsionströpfchen zeigt. (B) Der fluoreszierende Lipidkanal zeigt die Bildung einer Oktanoltasche durch partielle Entnetzung. Die Lipid-in-Octanol-Phase enthielt eine Mischung aus DOPC (5 mg/ml) und Lis Rhod PE in einem Verhältnis von 1.000:1. (C) Der innere wässrige Kanal, der die Verkapselung des gelb fluoreszierenden Proteins (YFP) zeigt. Die Einschübe in (A-C) zeigen repräsentative vergrößerte Ansichten der jeweiligen Panels (Maßstabsbalken = 10 μm). (D-F) Entnetzung der Oktanoltasche im Austrittskanal, die ein Liposom bildet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: pH-getriggerte Flüssig-Flüssig-Phasentrennung von pLL/ATP innerhalb von Liposomen. (A) Schematische Darstellung des pH-abhängigen Übergangs der homogenen Lösung von pLL und ATP, die im Liposom verkapselt sind (links) zu phasengetrennten pLL/ATP-Koazervaten (rechts). Das anfängliche saure Milieu im Liposom macht die molekulare Ladung von ATP neutral und hemmt die Koazervation. Wenn sich der pH-Wert in den Liposomen mit dem von außen aufgebrachten pH-Anstieg ausgleicht, erhält ATP eine negative Ladung, was eine Koazervation auslöst. (B-C) Liniendiagramme (entsprechend den gestrichelten Linien in den Feldern [D] bzw. [G]), die die räumliche Verteilung von pLL (grüner Kanal) und der Membran (roter Kanal) zeigen. (D-G) Zeitrafferaufnahmen, die die Bildung von pLL/ATP-Koazervaten innerhalb der Liposomen zeigen. Die externe Zugabe eines basischen Puffers erhöht den pH-Wert im Inneren der Liposomen im Laufe von Minuten und leitet die Koazervation ein. t = 0 min bezieht sich auf die Zeit kurz vor dem Auftreten des ersten Koazervationsereignisses. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Codierungsdatei 1: CAD-Datei des OLA-Designs. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Die zelluläre Komplexität macht es extrem schwierig, lebende Zellen zu verstehen, wenn sie als Ganzes betrachtet werden. Die Verringerung der Redundanz und Interkonnektivität von Zellen durch die Rekonstitution der Schlüsselkomponenten in vitro ist notwendig, um unser Verständnis biologischer Systeme zu verbessern und künstliche zelluläre Nachahmungen für biotechnologische Anwendungen zu schaffen22,23,24. Liposomen dienen als hervorragendes Minimalsystem, um zelluläre Phänomene zu verstehen. Eine nicht erschöpfende Liste dieser Phänomene umfasst die Dynamik des Zytoskeletts und die daraus resultierenden Membrandeformationen 25,26, die raumzeitliche Regulation biomolekularer Kondensate 27,28 und ihre Wechselwirkung mit der Membran 29, die Verkapselung einer Vielzahl von Biomolekülen, einschließlich zellfreier Transkriptions-Translationssysteme 30, die zellfreie Lipidsynthese 31 und die Evolution von Proteinen 32.33,34. Liposomen werden auch häufig als Träger für die Verabreichung von Medikamenten verwendet und wurden von der Food and Drug Administration (FDA) und der Europäischen Arzneimittel-Agentur (EMA) für den klinischen Gebrauch zugelassen11. Liposomen und lipidbasierte Nanopartikel werden als Träger für die Verabreichung von Medikamenten verwendet, einschließlich mRNA-Impfstoffen wie dem jüngsten COVID-19-Impfstoff35.

Diese Studie beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Photolithographie, mikrofluidischen Assemblierung und Oberflächenfunktionalisierung zur Durchführung der OLA-Technik zur Erzeugung von On-Chip-Liposomen (Abbildung 1 und Abbildung 3). Die unter Verwendung von OLA hergestellten Liposomen sind monodispers (Variationskoeffizient: 4%-11% des Mittelwerts) und im biologischen Zellgrößenbereich (typischerweise zwischen 5-50 μm im Durchmesser) und können unter Verwendung geeigneter Strömungsgeschwindigkeiten der inneren und äußeren wässrigen Kanäle36 eingestellt werden. Zum Beispiel hat die in Abbildung 1 gezeigte Liposomenpopulation eine Größenverteilung von 23,3 μm ± 1,8 μm (n = 50). Bei typischen Produktionsraten von 10-30 Hz sind die gebildeten Liposomen unilamellar, wie zuvor durch Einfügen eines einzelnen Doppelschicht-spezifischen Transmembranproteins, alpha-Hämolysin36, in die Membran sowie durch Verwendung des Dithionat-Bleich-Assays37 bestätigt wurde. OLA ist zudem mit einer Vielzahl von Lipidzusammensetzungen kompatibel und bietet dem Anwender Flexibilität bei der Wahl der Lipide. Wichtig ist, dass sich die anfänglich verwendete Lipidzusammensetzung in der endgültigen Liposomenzusammensetzung38 widerspiegelt.

Da es sich um eine relativ neue Technologie handelt, gibt es noch mehr Spielraum für die Verbesserung von OLA. Zum Beispiel ist die Oberflächenfunktionalisierung mit PVA wichtig, aber mühsam durchzuführen. Eine einfachere und einfachere Möglichkeit, das Bauteil auf der Oberfläche zu funktionalisieren, würde die Chipherstellungszeit sowie die Chip-zu-Chip-Variabilität erheblich reduzieren. Pluronic F68 Tensid ist ein wichtiger Bestandteil in der äußeren wässrigen Phase, um die Doppelemulsionen zunächst zu stabilisieren; Dennoch kann die Verwendung in bestimmten Fällen restriktiv sein. Der Ersatz von Pluronic F68 durch ein biokompatibleres Tensid oder die vollständige Entfernung von Tensiden kann die Vielseitigkeit des Systems verbessern. Bei der Migration der erzeugten Doppelemulsionen in den Austrittskanal können diese durch Scherung platzen. Eine Aufrüstung des OLA-Designs zur Verbesserung der doppelten Emulsionsstabilität und der Oktanol-Taschentrennung könnte somit den Durchsatz erhöhen. Nichtsdestotrotz hat OLA mehrere Vorteile, zu denen vor allem die effiziente Verkapselung, monodisperse und unilamellare Liposomen sowie kontrollierte On-Chip-Experimente gehören.

OLA wurde in einer Vielzahl von Studien eingesetzt und angepasst, einschließlich des Wachstums und der Teilung von Liposomen39, der Untersuchung des Prozesses der Flüssig-Flüssig-Phasentrennung27 und seiner Wechselwirkung mit der Membran21 und des Verständnisses der Bildung von Bioprodukten des bakteriellen Wachstums in Liposomen40. OLA-basierte Hochdurchsatz-Assays werden auch verwendet, um den Ionentransport durch die Membran41 und die Wirkstoffpermeabilität durch die Lipiddoppelschicht37 zu verstehen, als Wirkstoffabgabesystem für therapeutische Zwecke 42, um die Wirkung von antimikrobiellen Mitteln auf die Membran 43 zu untersuchen und als Werkzeug zum Verkapseln von Flüssigkristallen 44. Neben dem breiten Anwendungsspektrum der OLA-Technologie werden modifizierte Versionen von OLA entwickelt, die für bestimmte Zwecke geeignet sind 45,46,47,48,49,50. Insgesamt sind wir in Anbetracht der Vor- und Nachteile der festen Überzeugung, dass OLA eine vielseitige Plattform für die synthetische Biologie ist.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Wir bedanken uns bei Dolf Weijers, Vera Gorelova und Mark Roosjen für die freundliche Bereitstellung von YFP. S.D. bedankt sich für die finanzielle Unterstützung durch den niederländischen Forschungsrat (Fördernummer: OCENW. KLEIN.465).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Octanol Sigma-Aldrich No. 297887
1.5 mL tubes Fisher scientific 10451043 Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes
ATP Sigma-Aldrich No. A2383
Biopsy punch Darwin microfluidics PT-T983-05 0.5 mm and 3 mm diameter
Citrate-base Sigma-Aldrich No. 71405
Dextran Sigma-Aldrich No. 31388 Mr~6,000
Direct-write optical lithography machine Durham Magneto Optics Ltd MicroWriter ML3 Baby setup and software
DOPC lipid Avanti SKU:850375C
F68 Sigma-Aldrich No. 24040032
Glass cover slip Corning #1, 24 x 40 mm
Glycerol Sigma-Aldrich No. G2025
Hydrochloric acid Thermo Scientific Acros No. 124630010
Liss Rhod PE lipid Avanti SKU:810150C
Parafilm Sigma-Aldrich No. P7793
Photoresist Micro resist technology GmbH EpoCore 10
Photoresist developer micro resist technology GmbH mr-Dev 600
Plasma cleaner Harrick plasma PDC-32G
Polydimethylsiloxane Dow Sylgard 184 PDMS and curing agent
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich No. P7890
Poly-L-lysine–FITC Labeled Sigma-Aldrich No. P3543
Polyvinyl alcohol Sigma-Aldrich no. P8136 molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed
Pressure controller Elveflow  OBK1 Mk3+ Flow controller
Scotch tape Magic Tape Invisible Matt Tape
Silicon wafer Silicon Materials 0620R16002
Spin coater  Laurell Technologies Corporation Model WS-650MZ-23NPP
Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers Darwin microfluidics PN-BEN-23G
Tris-base Sigma-Aldrich No. 252859
Tygon tubing Darwin microfluidics 1/16" OD x 0.02" ID
UV laser  365 nm wavelength

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References

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Diesen Monat in JoVE Ausgabe 193
On-Chip-Oktanol-gestützte Liposomen-Assemblierung für die Biotechnologie
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Chen, C., Ganar, K. A., Deshpande,… More

Chen, C., Ganar, K. A., Deshpande, S. On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering. J. Vis. Exp. (193), e65032, doi:10.3791/65032 (2023).

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