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Biology

मुराइन गर्भाशयसेक्रल स्नायुबंधन और श्रोणि तल अंगों का अलगाव और लक्षण वर्णन

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/65074
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 2,5, 1,2,4, 1,2,4
1Biomedical Engineering Program, University of Colorado Boulder, 2Paul M. Rady Department of Mechanical Engineering, University of Colorado Boulder, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 4BioFrontiers Institute, University of Colorado Boulder, 5Department of Mechanical Science and Engineering, University of Illinois Urbana-Champaign

Summary

यह लेख महिला प्रजनन ऊतकों के अध्ययन का विस्तार करने के लिए चूहों में गर्भाशय ग्रीवा, मलाशय और मूत्राशय सहित गर्भाशयसेक्रल स्नायुबंधन और अन्य श्रोणि तल ऊतकों को विच्छेदित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है।

Abstract

पेल्विक ऑर्गन प्रोलैप्स (पीओपी) एक ऐसी स्थिति है जो श्रोणि तल की अखंडता, संरचना और यांत्रिक समर्थन को प्रभावित करती है। श्रोणि तल में अंगों को मांसपेशियों, स्नायुबंधन और श्रोणि प्रावरणी सहित विभिन्न शारीरिक संरचनाओं द्वारा समर्थित किया जाता है। गर्भाशयसेक्रल लिगामेंट (यूएसएल) एक महत्वपूर्ण भार-असर संरचना है, और यूएसएल को चोट लगने से पीओपी विकसित होने का उच्च जोखिम होता है। वर्तमान प्रोटोकॉल रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी और यांत्रिक व्यवहार के मूल्यांकन का उपयोग करके यूएसएल जैव रासायनिक संरचना और कार्य पर अद्वितीय डेटा के अधिग्रहण के साथ-साथ मुराइन यूएसएल और पेल्विक फ्लोर अंगों के विच्छेदन का वर्णन करता है। चूहे प्रीक्लिनिकल अनुसंधान के लिए एक अमूल्य मॉडल हैं, लेकिन मुराइन यूएसएल को विच्छेदित करना एक कठिन और जटिल प्रक्रिया है। यह प्रक्रिया यूएसएल सहित मुराइन पेल्विक फ्लोर ऊतकों के विच्छेदन का मार्गदर्शन करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करती है, ताकि कई आकलन और लक्षण वर्णन को सक्षम किया जा सके। इस काम का उद्देश्य बुनियादी वैज्ञानिकों और इंजीनियरों द्वारा श्रोणि तल के ऊतकों के विच्छेदन में सहायता करना है, इस प्रकार यूएसएल और पेल्विक फ्लोर स्थितियों पर अनुसंधान की पहुंच और माउस मॉडल का उपयोग करके महिलाओं के स्वास्थ्य के प्रीक्लिनिकल अध्ययन का विस्तार करना है।

Introduction

लगभग 50% महिलाएं पेल्विक ऑर्गन प्रोलैप्स (पीओपी) 1,2 से प्रभावित होती हैं। इन महिलाओं में से लगभग 11% सर्जिकल मरम्मत से गुजरने के मानदंडों को फिट करती हैं, जिसमें खराब सफलता दर (~ 30%) 3,4 है। पीओपी को यूएसएल और पैल्विक फ्लोर की मांसपेशियों की विफलता के कारण उनकी प्राकृतिक स्थिति से किसी भी या सभी श्रोणि अंगों (यानी, मूत्राशय, गर्भाशय, गर्भाशय ग्रीवा और मलाशय) के वंश की विशेषताहै। इस स्थिति में शारीरिक शिथिलता और संयोजी ऊतक का विघटन, साथ ही न्यूरोमस्कुलर चोट शामिल है, इसके अलावा प्रीडिस्पोजिंग कारक 3,6। पीओपी कई कारकों जैसे उम्र, वजन, समानता और प्रसव प्रकार (यानी, योनि या सीजेरियन जन्म) से जुड़ा हुआ है। इन कारकों को सभी श्रोणि तल के ऊतकों की यांत्रिक अखंडता को प्रभावित करने के लिए माना जाता है, गर्भावस्था और समानता को पीओपी 5,7,8 के मुख्य चालक माना जाता है।

गर्भाशयसेक्रल स्नायुबंधन (यूएसएल) गर्भाशय, गर्भाशय ग्रीवा और योनि के लिए महत्वपूर्ण सहायक संरचनाएं हैं और गर्भाशय ग्रीवा को थैली4 से जोड़ते हैं। यूएसएल को नुकसान महिलाओं को पीओपी विकसित करने के जोखिम में डालता है। यह माना जाता है कि गर्भावस्था और प्रसव यूएसएल पर अतिरिक्त तनाव डालते हैं, जो संभावित रूप से चोट को प्रेरित करता है और पीओपी की संभावना को बढ़ाता है। यूएसएल एक जटिल ऊतक है जो चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, रक्त वाहिकाओं और लिम्फैटिक्स से बना होता है जो लिगामेंट के साथ विषम रूप से वितरित होता है, जिसे तीन अलग-अलग वर्गों में विभाजित किया जा सकता है: ग्रीवा, मध्यवर्ती और त्रिक क्षेत्र9। यूएसएल की यांत्रिक अखंडता कोलेजन, इलास्टिन और प्रोटिओग्लाइकेन्स 5,9,10 जैसे बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) घटकों से प्राप्त होती है। टाइप 1 कोलेजन फाइबर को स्नायुबंधन ऊतकों के एक प्रमुख भार-असर तन्यता घटक के रूप में जाना जाता है और इसलिए, यूएसएल विफलता और पीओपी11 में शामिल होने की संभावना है।

महिलाओं में पीओपी के कारणों, व्यापकता और प्रभावों के बारे में ज्ञान की कमी है। पीओपी के एक उपयुक्त पशु मॉडल का विकास महिला श्रोणि तल की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए आवश्यक है। चूहों और मनुष्यों में श्रोणि के भीतर समान शारीरिक स्थल होते हैं, जैसे मूत्रवाहिनी, मलाशय, मूत्राशय, अंडाशय और गोल स्नायुबंधन9, साथ ही गर्भाशय, गर्भाशय ग्रीवा और थैली के साथ यूएसएल के समान चौराहे बिंदु। इसके अलावा, चूहे आनुवंशिक हेरफेर में आसानी प्रदान करते हैं और पीओपी9 के अध्ययन के लिए आसानी से सुलभ, लागत प्रभावी मॉडल होने की क्षमता रखते हैं।

इस अध्ययन ने यूएसएल और विभिन्न श्रोणि तल के ऊतकों को शून्य (यानी, कभी गर्भवती नहीं) चूहों से एक्सेस करने और अलग करने की एक विधि विकसित की। निकाले गए यूएसएल को एंजाइमेटिक पाचन (यानी, कोलेजन और ग्लाइकोसामिनोग्लाइकेन्स को हटाने के लिए) के अधीन किया गया था, तन्यता लोडिंग के तहत यांत्रिक प्रतिक्रिया निर्धारित करने के लिए परीक्षण किया गया था, और एक प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट अध्ययन में जैव रासायनिक संरचना के लिए मूल्यांकन किया गया था। बरकरार ऊतकों को अलग करने की क्षमता श्रोणि तल घटकों के आगे यांत्रिक और जैव रासायनिक लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान करेगी, जो प्रसव, गर्भावस्था और पीओपी से संबंधित चोट जोखिमों की हमारी समझ में सुधार करने की दिशा में एक महत्वपूर्ण पहला कदम है।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों और प्रक्रियाओं को प्रोटोकॉल # 2705 के अनुसार किया गया था, जिसे कोलोराडो बोल्डर विश्वविद्यालय की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। वर्तमान अध्ययन के लिए छह सप्ताह की मादा C57BL / 6J चूहों का उपयोग किया गया था। जानवरों को एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

1. पशु तैयारी

  1. संस्थागत रूप से अनुमोदित विधि का पालन करते हुए जानवर को इच्छामृत्यु दें।
    नोट: वर्तमान अध्ययन ने अमेरिकन वेटरनरी मेडिकल एसोसिएशन के दिशानिर्देशों (सीओ 2 प्रति मिनट के साथ कक्ष की मात्रा का 30% से 70% की विस्थापन दर) के साथ संरेखण में सीओ2 इनहेलेशन का उपयोग किया, इसके बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था, सफल यूथेनाइजेशन सुनिश्चित करने के लिए।
    1. चूहों की एलर्जी के प्रसार को कम करने के लिए, यदि संभव हो तो एक हुड के नीचे काम करें। एक बार जब माउस हिलना और सांस लेना बंद कर देता है, तो प्रतिक्रिया की कमी को सत्यापित करने के लिए 2 मिनट या उससे अधिक की अनुमति दें।
      नोट: यदि माउस गर्भवती या प्रसवोत्तर है, तो पिल्ले को व्यक्तिगत रूप से इच्छामृत्यु दी जानी चाहिए। पिल्ले E15.5 और उससे अधिक उम्र के पिल्ले को विच्छेदन के दौरान हटा दिया जाना चाहिए।
  2. विच्छेदन पैड, एक 11-ब्लेड स्केलपेल, घुमावदार पतली तेज कैंची, दो जोड़े बल, घुमावदार बल, 5-0 पॉलीग्लाक्टिन सीवन, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप और छह पिन के साथ विच्छेदन सेटअप तैयार करें (चित्र 1, सामग्री की तालिका देखें)।
  3. पैड पर माउस रखें, और फोरलिम्ब्स को नीचे पिन करें (चित्रा 2 ए)। कैंची से पेट में लगभग 1-1.5 सेमी का चीरा लगाएं (चित्र 2बी)। चीरे के कपाल, पुच्छल और पार्श्व किनारों पर त्वचा को अलग करने के लिए धीरे से कैंची का उपयोग करें (चित्रा 2 सी, डी)।
  4. माउस को उसके पृष्ठीय पक्ष में पलटें, और धीरे-धीरे विच्छेदन स्थल से त्वचा को हटाने के लिए त्वचा को हिंदलिम्ब्स की ओर वापस छील दें (चित्रा 2 ई-एच)।
  5. माउस को अंगों पर पिन करें (चित्रा 2 आई), और छाती से श्रोणि तक पेट में लगभग 1 सेमी का चीरा लगाएं (चित्रा 2 जे)।
    नोट: सुनिश्चित करें कि अंतर्निहित अंगों को नुकसान न पहुंचे।
  6. देखने के क्षेत्र को साफ करने के लिए धीरे से अंगों को वक्ष की ओर धकेलें (चित्रा 2के)।
    नोट: हाइड्रेशन बनाए रखने के लिए 1x पीबीएस के साथ ऊतकों की सिंचाई करें।
  7. श्रोणि तल से सभी वसा ऊतक को साफ़ करें (चित्रा 2 एल-एन)।
    नोट: रुचि के अंगों और ऊतकों से वसा को धीरे से खींचने और साफ करने के लिए बल का उपयोग करें।

Figure 1
चित्रा 1: विच्छेदन करने के लिए आवश्यक सभी उपकरणों के साथ एक साफ कार्यस्थान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: त्वचा को हटाना और माउस के श्रोणि और वक्ष गुहाओं को खोलना। (ए) सभी अंगों को नीचे गिराना। (बी) प्रारंभिक चीरा। (सी) कैंची का उपयोग करके अंतर्निहित प्रावरणी से त्वचा को अलग करना। (डी) त्वचा को काटना और हटाने की तैयारी। (E-G) माउस के चारों ओर जाकर त्वचा को खींचना। (एच) पृष्ठीय पक्ष से त्वचा को पूरी तरह से हटाना। (I) धड़ से त्वचा को पूरी तरह से हटाना, और माउस अंगों को फिर से पिन करना। (जे) पेट का खुलना। (के) खुले पेट का दृश्य। (एल) अंगों को दृश्य क्षेत्र से बाहर ले जाना। (एम) वसा को हटाना। (एन) साफ श्रोणि तल का दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. यूएसएल कटाई

  1. अंडाशय से गर्भाशय के सींग ों को काटें (चित्रा 3 बी), दृश्य के क्षेत्र से दूर खींचें, और गर्भाशय ग्रीवा कनेक्शन (चित्रा 3 सी) पर काट दें।
    नोट: गर्भाशय के सींगों को चित्रा 3 ए में योजनाबद्ध के बाद पहचाना जा सकता है। हाइड्रेशन बनाए रखने के लिए 1x पीबीएस के साथ ऊतकों की सिंचाई करें।
  2. मूत्रवाहिनी को मूत्राशय कनेक्शन से दूर काट लें (चित्रा 3 डी)।
    नोट: यह यूएसएल के साथ भ्रम से बचने के लिए है।
  3. बृहदान्त्र को यथासंभव गर्भाशय ग्रीवा के करीब काटें (चित्रा 3 ई, एफ)।
    नोट: हाइड्रेशन बनाए रखने के लिए 1x पीबीएस के साथ ऊतकों की सिंचाई करें।
  4. यूएसएल (चित्रा 3 जी) की कल्पना करने के लिए विच्छेदन दायरे के तहत विच्छेदन पैड के साथ माउस रखें।
  5. यूएसएल से आसपास की वसा को साफ करने के लिए धीरे से बल का उपयोग करें।
    नोट: गर्भाशय ग्रीवा को एक छोटे कोण पर रखने के लिए बल की दूसरी जोड़ी का उपयोग करें ताकि यूएसएल गर्भाशय ग्रीवा के साथ प्रतिच्छेद करने के दृश्य को बढ़ा सके। हाइड्रेशन बनाए रखने के लिए 1x पीबीएस के साथ ऊतकों की सिंचाई करें।
  6. दोनों यूएसएल के ग्रीवा छोर के चारों ओर 5-0 पॉलीग्लाक्टिन सीवन बांधें (चित्रा 4 बी, सी)।
    नोट: यूएसएल को योजनाबद्ध और आवर्धन छवियों (चित्रा 4 आई-के) का उपयोग करके पहचाना जा सकता है।
  7. इस अध्ययन में, एक यूएसएल का उपयोग रूपात्मक या जैव रासायनिक विश्लेषण (यानी, रमन माइक्रोस्कोपी, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, हिस्टोलॉजी) के लिए किया जाता है। यूएसएल के ग्रीवा छोर को काटें, गर्भाशय ग्रीवा का एक टुकड़ा संलग्न छोड़ दें, और यूएसएल के नीचे से मांसपेशियों का एक टुकड़ा काट लें (चित्रा 4 डी)। ऊतक को हाइड्रेटेड रखने के लिए विच्छेदित ऊतक को 1x पीबीएस के साथ स्नान में रखें (चित्रा 4 जी, एच)।
  8. यांत्रिक परीक्षण और इमेजिंग के लिए शेष यूएसएल का उपयोग करें। यांत्रिक सेटअप (चित्रा 4 डी) को सुविधाजनक बनाने के लिए यूएसएल के ग्रीवा छोर को काट दें, गर्भाशय ग्रीवा का एक टुकड़ा संलग्न छोड़ दें।
    नोट: यांत्रिक परीक्षण के दौरान यूएसएल को सुरक्षित करने के लिए ग्रीवा ऊतक एक लंगर के रूप में कार्य करेगा।
  9. एक बार जब रुचि के सभी ऊतक ों को काट लिया जाता है (चरण 3-5), श्रोणि से फीमर को अलग करें (चित्रा 4 ई)।
    नोट: जब ऊरु सिर को एसिटैबुलर कप से अलग किया जाता है तो किसी को एक धुंधली क्लिकिंग ध्वनि सुननी चाहिए।
  10. श्रोणि की हड्डी के बाहर और समीपस्थ सिरों से श्रोणि की हड्डी को काटें, कुल ऊतक का लगभग 10 मिमी छोड़ दें (चित्रा 4 एफ)। विच्छेदित ऊतक को 1x PBS में रखें।

Figure 3
चित्रा 3: यूएसएल विच्छेदन के लिए साफ़ श्रोणि तल । (ए) शरीर रचना विज्ञान का योजनाबद्ध। (बी) डिम्बग्रंथि कनेक्शन पर गर्भाशय के सींग काटना। (सी) गर्भाशय के सींगों को काटना। (डी) मूत्रवाहिनी की कटाई। (ई) बृहदान्त्र का काटना। (एफ) मलाशय और यूएसएल का एक स्पष्ट दृश्य। (जी) विच्छेदन दायरे के तहत माउस और विच्छेदन पैड रखना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: यूएसएल और आसपास के ऊतकों का दृश्य और यूएसएल का विच्छेदन। (बी) ग्रीवा के सिरों के चारों ओर एक सीवन बांधना। (सी) यूएसएल के ग्रीवा सिरों को काटना। (डी) त्रिक कनेक्शन पर जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले यूएसएल को काटना। (ई) श्रोणि की हड्डी से फीमर का काटना। (एफ) श्रोणि के समीपस्थ छोर को काटना। (जी) यूएसएल को 35 मिमी पेट्री डिश में विच्छेदित करना। (एच) 35 मिमी पेट्री डिश में संलग्न श्रोणि के साथ यूएसएल। (I) 0.75x आवर्धन पर यूएसएल और मलाशय। (जे) यूएसएल से वसा को हटाना। (के) यूएसएल की सफाई 1.0 गुना आवर्धन पर। स्केल बार = 2 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. मूत्राशय की कटाई

  1. वसा साफ होने के बाद, मूत्राशय को बल के साथ पकड़ें, और धीरे से इसे लगभग 40 ° (चित्रा 5 ए) के कोण पर उठाएं।
  2. कैंची के साथ, मूत्राशय को बाहर की तरफ से काट लें, गर्भाशय ग्रीवा के ठीक ऊपर (चित्रा 5 बी)।
  3. ऊतक को हाइड्रेटेड रखने के लिए ऊतक को 1x पीबीएस के साथ स्नान में रखें (चित्रा 5 एच)।

4. मलाशय की कटाई

  1. एक बार जब यूएसएल गर्भाशय ग्रीवा से डिस्कनेक्ट हो जाते हैं और मूत्राशय विच्छेदित हो जाता है, तो गर्भाशय ग्रीवा को बल के साथ लगभग 40 डिग्री के कोण पर उठाएं। रेक्टोवेजिनल प्रावरणी है जो मलाशय और गर्भाशय ग्रीवा को जोड़ती है। स्केलपेल के साथ, धीरे से इस कनेक्शन को काट लें (चित्रा 5 सी, डी)।
  2. कैंची का उपयोग करके जघन सिम्फिसिस पर जघन हड्डी को काटें। ऊतक सम्मिलन के लिए दृश्य पहुंच बढ़ाने के लिए कार्यक्षेत्र को धीरे से चौड़ा करें।
  3. बल के साथ, धीरे से मलाशय को वक्ष की ओर खींचें, और कैंची का उपयोग मलाशय को उसके पीछे की तरफ से गुदा तक करने के लिए करें। गुदा में मलाशय को काटें (चित्रा 5 ई)।
  4. ऊतक को हाइड्रेटेड रखने के लिए ऊतक को 1x पीबीएस में रखें (चित्रा 5 आई)।

5. गर्भाशय ग्रीवा-योनि जटिल कटाई

  1. यूएसएल को गर्भाशय ग्रीवा से हटाने के बाद, गर्भाशय ग्रीवा को पकड़ने के लिए बल का उपयोग करें। कैंची का उपयोग करके गर्भाशय ग्रीवा को जितना संभव हो उतना योनी के करीब काटें (चित्रा 5 एफ, जी)।
    नोट: योनि के बाहर के छोर को नेत्रहीन रूप से देखने के लिए जघन सिम्फिसिस को काटना सुनिश्चित करें।
  2. ऊतक को हाइड्रेटेड रखने के लिए ऊतक को 1x पीबीएस में रखें (चित्रा 5 जे)।

Figure 5
चित्र 5: मूत्राशय, मलाशय, और गर्भाशय ग्रीवा / योनि विच्छेदन । (ए) मूत्राशय को एक कोण पर पकड़ना। (बी) मूत्राशय को काटना। (सी) गर्भाशय ग्रीवा और मलाशय को जोड़ने वाले कण्डरा को काटना। (डी) 1.0 x आवर्धन पर कण्डरा। (ई) मलाशय को काटना। (एफ) गर्भाशय ग्रीवा को बल के साथ पकड़ना। (छ) योनि के बाहरी छोर पर काटना। (एच) 35 मिमी पेट्री डिश में मूत्राशय। (I) 35 मिमी पेट्री डिश में मलाशय। (जे) 35 मिमी पेट्री डिश में गर्भाशय ग्रीवा-योनि ऊतक परिसर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

6. ऊतक लक्षण वर्णन के लिए नमूना तैयारी।

  1. यूएसएल के यांत्रिक और दृश्य विश्लेषण
    1. धुंधला समाधान में पूर्ण विसर्जन सुनिश्चित करने के लिए टी-आकार की दीवार पर एक टी-आकार की दीवार के ऊपर पैल्विक अटैचमेंट के साथ यूएसएल रखें (कुएं के सीएडी चित्र पूरक कोडिंग फ़ाइल 1 और पूरक कोडिंग फ़ाइल 2 में पाए जा सकते हैं)।
      नोट: प्लेसमेंट में मदद करने के लिए सीवन और फोर्सप्स का उपयोग करें।
    2. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डाई को पतला करें जो 1x PBS के 2.5 मिलीलीटर में मुक्त अमाइन समूहों (5 μL, सामग्री की तालिका देखें) को दाग देता है, समाधान को कस्टम धुंधला करने में अच्छी तरह से जोड़ें, और ऊतक को 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रॉकर पर 2 घंटे के लिए दाग दें।
      नोट: घोल को अच्छी तरह से धुंधला करने से पहले भंवर करें।
    3. धुंधला होने के अंतिम 15 मिनट के दौरान, घोल में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मृत कोशिका नाभिक दाग ( सामग्री की तालिका देखें) का 2.5 μL जोड़ें।
      नोट: धुंधला पन को अच्छी तरह से जोड़ने से पहले घोल को भंवर करें।
  2. यूएसएल का रमन विश्लेषण।
    1. यूएसएल को एक पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) ब्लॉक पर एक सीधी रेखा में पिन करें जो एक कस्टम कुएं में निहित है।
      नोट: पीडीएमएस वांछित कॉन्फ़िगरेशन में नमूने की पिनिंग को सक्षम करने के लिए एक नरम सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किया जाता है। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए दो घटकों को मिलाकर अलग-अलग आयामों के ब्लॉक बनाए जा सकते हैं (सामग्री की तालिका देखें), पेट्री डिश में कास्टिंग, और, पोलीमराइजेशन के बाद, पीडीएमएस को स्केलपेल ब्लेड के साथ आवश्यक ज्यामिति में काटना।
    2. सीवन लूप और श्रोणि की मांसपेशियों पर कीट पिन के साथ पिन। 1x PBS के साथ ऊतक हाइड्रेट करें।
  3. शेष ऊतक
    1. वांछित विश्लेषण के आधार पर तरल नाइट्रोजन के साथ या एक उपयुक्त एम्बेडिंग यौगिक में शेष ऊतकों को स्नैप-फ्रीज करें।
    2. बाद के विश्लेषण (जैसे, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल या जैव रासायनिक परख) तक -80 डिग्री सेल्सियस पर ऊतकों को सहेजें।

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Representative Results

वाइल्ड-टाइप माउस के विच्छेदन के प्रत्येक चरण को प्रोटोकॉल से संबंधित संबंधित वीडियो और आंकड़ों में विस्तृत किया गया है। इस अध्ययन के लिए, 6 सप्ताह की महिला C57BL/6J चूहों का उपयोग किया गया (पूरक तालिका 1)। विभिन्न एंजाइमों के साथ इलाज किए गए यूएसएल के साथ तीन नमूना समूहों का विश्लेषण किया गया: नियंत्रण (कोई उपचार नहीं), कोलेजनेज-उपचारित, और चोंड्रोइटिनेज-उपचारित समूह। यूएसएल में चिकनी मांसपेशियों, नसों और लसीका फाइब्रिलर कोलेजन और ग्लाइकोसामिनोग्लाइकेन्स (जीएजी) 5 में समृद्ध ईसीएम से घिरे होते हैं, जिन्हें ऊतक को यांत्रिक अखंडता प्रदान करने के लिए माना जाता है। एंजाइम उपचार को इन ईसीएम घटकों को बाधित करने और रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी और यांत्रिक (तन्यता) परीक्षण का उपयोग करके जैव रासायनिक और यांत्रिक मतभेदों को हल करने की व्यवहार्यता का प्रदर्शन करने के लिए चुना गया था।

पाचन के लिए, सभी यूएसएल को 37 डिग्री सेल्सियस और 300 आरपीएम पर 1 एमएल के घोल में 3 घंटे के लिए थर्मोमिक्सर में रखा गया था। नियंत्रण यूएसएल को 1x PBS के समाधान में रखा गया था, कोलेजनेज-उपचारित यूएसएल को 1.0 U / mL कोलेजनेस टाइप I के समाधान में रखा गया था, और चोंड्रोइटिनेज-उपचारित यूएसएल को 2.0 U / mL chondroitinase ABC के समाधान में रखा गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

मैकेनिकल परीक्षण के लिए यूएसएल चरण 6.1 के आधार पर तैयार किए गए थे। नमूने यांत्रिक परीक्षण प्रोटोकॉल12 के लिए एक कस्टम लोडिंग चैंबर (कक्ष का एक सीएडी ड्राइंग पूरक कोडिंग फ़ाइल 3 में पाया जा सकता है) में रखा गया था। श्रोणि को एक स्थिर विन्यास में तय किया गया था, और यूएसएल के ग्रीवा छोर को एक बॉय एक्ट्यूएटर से जोड़ा गया था, जो जिमेनेज एट अल .12 में वर्णित डिजाइन पर आधारित था (चित्रा 6 बी; पूरक कोडिंग फ़ाइल 4), एक ईमानदार कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत और 100 mN लोड सेल (चित्रा 6 ए) से जुड़ा हुआ है। बल12 को मापते समय बॉय सिस्टम एक्ट्यूएटर की बांह के कारण होने वाले शोर को कम करता है। यूएसएल के संदर्भ कॉन्फ़िगरेशन को सेट करने के लिए लगभग 500 μN के प्री-लोड का उपयोग किया गया था, और प्रत्येक यूएसएल को इस स्थिति में रहते हुए चित्रित किया गया था। फिर, 750 μm का वैश्विक विस्थापन लागू किया गया और फिर से इमेजिंग से पहले 5 मिनट के लिए आयोजित किया गया। यूएसएल को तब संदर्भ विन्यास में वापस लाया गया था, और इस प्रक्रिया को 1,000 μm वैश्विक विस्थापन के लिए दोहराया गया था। तनाव छूट वक्रों (चित्रा 7) को प्राप्त करने के लिए सभी तीन नमूना समूहों (एन = 1/समूह) के लिए इस प्रोटोकॉल का पालन किया गया था, और प्रत्येक यूएसएल द्वारा सामना किए गए चरम और संतुलन तनाव निर्धारित किए गए थे (तालिका 1)। तनाव की गणना औसत पार-अनुभागीय क्षेत्र (पूरक तालिका 2 और पूरक तालिका 3) द्वारा मापा बल को विभाजित करके की गई थी।

Figure 6
चित्रा 6: मैकेनिकल परीक्षण सेटअप । (ए) कंफोकल माइक्रोस्कोप के तहत लोडिंग चैंबर और एक्ट्यूएटर से जुड़ा हुआ। (बी) लोडिंग चैंबर में यूएसएल; श्रोणि स्थिर रहता है, जबकि ग्रीवा का अंत एक परस्पर जुड़े हुए बॉय सिस्टम से बंधा होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: विभिन्न एंजाइम उपचारों के अधीन मुराइन यूएसएल के मैक्रोस्कोपिक अक्षीय तनाव-विश्राम प्लॉट। एंजाइम उपचार औसत अक्षीय शिखर को कम करने और तनाव को कम करने के लिए दिखाई दिया जो यूएसएल निर्धारित वैश्विक विस्थापन पर अनुभव करता है। (*) आराम से तनाव मूल्यों को इंगित करता है, जिसे चरम तनाव के 200 सेकंड बाद मापा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नमूना वैश्विक विस्थापन (μm) पीक तनाव (kPa) आराम संतुलन तनाव (kPa)
नियंत्रण 750 95 67
1000 135 97
कोलेजनेज़- इलाज किया जाता है 750 60 27
1000 94 60
चोंड्रोइटिनेस-इलाज 750 17 10
1000 25 16

तालिका 1: यूएसएल के तनाव माप पर एंजाइम उपचार का प्रभाव।

ली गई छवियों (चित्रा 8) से, संदर्भ (अनलोडेड) औरविकृत अवस्थाओं के बीच स्नायुबंधन की मैनुअल और स्वचालित (मैटलैब में "इमरेगडेमन्स" फ़ंक्शन) बनावट ट्रैकिंग के संयोजन का उपयोग करके तनाव क्षेत्रों का अनुमान लगाया गया था। संदर्भ और विकृत छवियों में एक ही सेल नाभिक का चयन करके मैनुअल ट्रैकिंग की गई थी। ग्रीन-लैग्रेंज तनाव क्षेत्रों की गणना अनुमानित विस्थापन क्षेत्रों से की गई थी (चित्रा 9)। औसत अक्षीय उपभेदों (ई11) की गणना प्रत्येक नमूने के मध्यवर्ती भाग के लिए की गई थी (तालिका 2)।

Figure 8
चित्र 8: वैश्विक विस्थापन के बाद एक नियंत्रण (अनुपचारित) नमूने की विकृत और संदर्भ अवस्थाओं की छवियां। (ए) एक 750 μm वैश्विक विस्थापन। (बी) एक 1,000 μm वैश्विक विस्थापन। हरा संदर्भ राज्य का प्रतिनिधित्व करता है, और बैंगनी विकृत स्थिति है (स्केल बार = 500 μm)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्र 9: तनाव क्षेत्र अनुमान। प्रत्येक उपचार समूह में नमूनों के लिए अनुमानित तनाव क्षेत्र दर्शाते हैं कि अक्षीय (ई 11), अनुप्रस्थ (ई 22), और कतरनी (ई 12) उपभेद स्थानिक रूप से असंगत थे, और अक्षीय तनाव बढ़ते लागू विस्थापन के साथ बढ़ गया (δ). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Global Displacement (μm) नियंत्रण कोलेजनेज़-इलाज चोंड्रोइटिनेस-इलाज
750 9.57% 8.01% 6.67%
1000 11.20% 15.75% 10.29%

तालिका 2: औसत अक्षीय उपभेद। प्रत्येक यांत्रिक रूप से परीक्षण किए गए नमूने के लिए औसत अक्षीय उपभेदों से संकेत मिलता है कि एंजाइम-उपचारित नमूनों में वैश्विक अक्षीय तनाव नियंत्रण नमूने के समान या बड़ा था, यह सुझाव देते हुए कि मैक्रोस्कोपिक तनाव में कमी छोटे उपभेदों के बजाय एंजाइम उपचार के कारण थी।

कॉन्फोकल रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी (785 एनएम लेजर, 1.06 μm स्पॉट आकार) यूएसएल पर आयोजित किया गया था जैसा कि चरण 6.2 में वर्णित है और ओ'ब्रायन एट अल.14 के बाद ऊतक जैव रसायन का अर्ध-मात्रात्मक मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। कॉस्मिक किरणों की पहचान की गई और उन्हें हटा दिया गया, रैखिक आधार रेखा को घटाया गया, और प्रत्येक स्पेक्ट्रम के लिए तीव्रता सामान्यीकृत की गई। एक ही उपचार समूहों की तुलना की गई (एन = 3 / समूह)। प्रत्येक यूएसएल के मध्यवर्ती खंड के लिए प्रतिनिधि स्पेक्ट्रा (चित्रा 10), साथ ही ग्रीवा और त्रिक छोर (पूरक चित्र 1 और पूरक चित्रा 2), दिखाए गए हैं।

Figure 10
चित्रा 10: यूएसएल संरचना पर एंजाइम उपचार का प्रभाव। यूएसएल मध्यवर्ती खंड के रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी से पता चलता है कि एंजाइम उपचार ने मुराइन यूएसएल की जैव रासायनिक संरचना को बदल दिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

ओ'ब्रायन एट अल.15 द्वारा किए गए मानव गर्भाशय ग्रीवा के विवो रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी के आधार पर चोटियों को विभिन्न जैविक घटकों के साथ सहसंबद्ध किया गया था। हमारे डेटा को फॉस्फेटिडिलएथेनॉलमाइन (1,769 एनएम) के शिखर का उपयोग करके सामान्यीकृत किया गया था, जो कोशिका झिल्ली में पाया जाने वाला एक फॉस्फोलिपिड है, जिसे एंजाइमेटिक उपचार के बाद अपरिवर्तित रहना चाहिए। प्रतिनिधि स्पेक्ट्रा में तुलना करने से पता चला कि कोलेजनेज-उपचारित और चोंड्रोइटिनेज-उपचारित यूएसएल (चित्रा 10, पूरक चित्रा 1, और पूरक चित्रा 2) दोनों में पानी की मात्रा, कोलेजन, हाइलूरोनिक एसिड, प्रोटीओग्लाइकेन्स और जीएजी में कमी आई थी।

पूरक चित्र 1: यूएसएल संरचना पर एंजाइम उपचार का प्रभाव। यूएसएल ग्रीवा अनुभाग के रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी से पता चलता है कि एंजाइम उपचार ने मुराइन यूएसएल की जैव रासायनिक संरचना को बदल दिया। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: यूएसएल संरचना पर एंजाइम उपचार का प्रभाव। यूएसएल त्रिक खंड के रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी से पता चलता है कि एंजाइम उपचार ने मुराइन यूएसएल की जैव रासायनिक संरचना को बदल दिया। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: अध्ययन में उपयोग किए गए चूहों का वजन, आयु और यूएसएल विश्लेषण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 2: यूएसएल बल माप पर एंजाइम उपचार का प्रभाव। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 3: यांत्रिक रूप से परीक्षण किए गए यूएसएल की क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र गणना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: कुएं को धुंधला करने के लिए सीएडी फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 2: अच्छी तरह से ढक्कन को धुंधला करने के लिए सीएडी फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 3: लोडिंग कक्ष की सीएडी फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 4: बॉय सिस्टम की सीएडी फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

महिला प्रजनन ऊतकों पर संरचनात्मक क्षति का प्रभाव कम अध्ययन किया गया है, और पीओपी अनुसंधान के लिए एक आसानी से सुलभ पशु मॉडल की आवश्यकता है। माउस एक लागत प्रभावी मॉडल है जो मानव प्रजनन अध्ययन16 की नकल कर सकता है। महिला प्रजनन प्रणाली के अध्ययन में बढ़ती रुचि के कारण, इन ऊतकों के अध्ययन में सहायता करने वाले तरीकों की आवश्यकता है। इस आवश्यकता को पूरा करने के लिए, इस काम में, संरचनात्मक और कार्यात्मक विश्लेषण के लिए मुराइन पेल्विक फ्लोर ऊतकों को विच्छेदित और तैयार करने के लिए एक विधि स्थापित की गई है।

विच्छेदन की सफलता के लिए, पर्याप्त समय और देखभाल की आवश्यकता होती है। मुराइन प्रजनन ऊतक छोटे और नाजुक होते हैं। विस्तार पर ध्यान देने की आवश्यकता है, खासकर यूएसएल और श्रोणि अंगों के आसपास की वसा को साफ करते समय, वसा को हटाने पर यूएसएल या अन्य ऊतकों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए। यूएसएल और वसा के बीच अंतर की पहचान करने में सहायता के लिए विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, जिसे अप्रशिक्षित आंख आसानी से भ्रमित कर सकती है। यूएसएल के साथ भ्रम से बचने के लिए मूत्रवाहिनी को हटाना सहायक हो सकता है, क्योंकि मूत्राशय और गर्भाशय ग्रीवा के सम्मिलन बिंदु एक दूसरे के करीब हैं। यूएसएल के चारों ओर सीवन बांधते समय, सुई के लिए जगह बनाने के लिए यूएसएल को धीरे से उठाने के लिए बल का उपयोग करके किसी भी ऊतक को घुमाने से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। यूएसएल को निकालने के लिए, सही ऊतक संरचना और प्रमुख शारीरिक स्थलों की पहचान मुश्किल हो सकती है, लेकिन इस विधि और अभ्यास के साथ, विच्छेदन परिणाम दोहराए जा सकते हैं।

प्रस्तावित विधि एक ही नमूने से श्रोणि तल के ऊतकों को विच्छेदित करने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया को रेखांकित करती है। एक सीमा यह है कि सभी ऊतकों को पूरी तरह से बरकरार रखना संभव नहीं है क्योंकि गर्भाशय ग्रीवा का एक टुकड़ा यांत्रिक परीक्षण के दौरान एक लंगर के रूप में कार्य करने और अभिविन्यास की पहचान करने में मदद करने के लिए विच्छेदित यूएसएल से जुड़ा रहता है। एक और सीमा यह है कि माउस शरीर रचना विज्ञान और मानव शरीर रचना विज्ञान में ऊतक आकार, आकार और अभिविन्यास9 में अंतर है। पीओपी की जांच कई पशु मॉडलों का उपयोग करके की गई है, जैसे कि कृंतक 17,18, खरगोश 19,20 भेड़20,21, सूअर 5,22,23,24, और गैर-मानव प्राइमेट्स 25,26, साथ ही मानव शव24,26,27, और इनमें से कुछ मॉडलों ने यूएसएल की भूमिका पर ध्यान केंद्रित किया है। जबकि इनमें से प्रत्येक मॉडल पीओपी के अध्ययन के लिए फायदेमंद है, माउस का एक अतिरिक्त लाभ उपन्यास रोग मॉडल बनाने के लिए आनुवंशिक हेरफेर की आसानी है, जोबड़े जानवरों में संभव नहीं है।

एक मॉडल के रूप में माउस का लाभ उठाने के लिए, इस विधि को यूएसएल के सफल विच्छेदन और यांत्रिक परीक्षण, रमन माइक्रोस्कोपी, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और जैव रासायनिक परख सहित विभिन्न विश्लेषणों के लिए ऊतकों की तैयारी में सहायता के लिए विकसित किया गया है। इस विधि के साथ, यूएसएल को उसके अभिविन्यास की पहचान करने के लिए इसके शारीरिक कनेक्शन के साथ निकालना संभव है, यूएसएल को टेथर करने के लिए, और विवो में पाए जाने वाले समान स्थितियों में यूएसएल का यांत्रिक रूप से परीक्षण करना।

यूएसएल की यांत्रिक अखंडता ईसीएम घटकों से ली गई है, जिसमें कोलेजन, प्रोटिओग्लाइकेन्स और जीएजी शामिल हैं। टाइप 1 कोलेजन एक प्रमुख तन्यता भार-असर प्रोटीन है, और इस ईसीएम घटक को नुकसान यूएसएल विफलता और पीओपी में योगदान करने के लिए माना जाता है। इस प्रक्रिया में, दो अलग-अलग एंजाइम उपचारों की तुलना यह परीक्षण करने के लिए की गई थी कि ईसीएम संरचना यूएसएल की यांत्रिक प्रतिक्रिया और संरचना को कैसे प्रभावित करती है। यांत्रिक विश्लेषण ने सुझाव दिया कि कोलेजन और जीएजी ने यूएसएल की अक्षीय कठोरता में योगदान दिया, औसत अक्षीय शिखर और संतुलन तनाव को कम किया (चित्रा 7)। एंजाइम-उपचारित यूएसएल ने एक समान या अधिक औसत अक्षीय तनाव का अनुभव किया (तालिका 2)। रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी ने प्रदर्शित किया कि कोलेजनेज़-उपचारित यूएसएल ने कोलेजन सामग्री को कम कर दिया था, साथ ही पानी और हाइलूरोनिक एसिड में कमी आई थी, जबकि चोंड्रोइटिनेज-उपचारित यूएसएल में कम हाइलूरोनिक एसिड था, साथ ही कम पानी और कोलेजन सामग्री भी थी। इन परिणामों के लिए, रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी ने पुष्टि की कि पाचन के कारण घटकों को हटा दिया गया था। इस विधि से पैल्विक फ्लोर-आधारित अध्ययनों को अधिक सुलभ बनाने और इस कम अध्ययन वाले क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करने वाले जांचकर्ताओं की संख्या में वृद्धि होने की उम्मीद है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को सीयू बोल्डर समर अंडरग्राउंड रिसर्च ऑपर्च्युनिटीज प्रोग्राम (यूआरओपी) अनुदान (सीबी), एनएसएफ ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप (एलएस), श्मिट साइंस फैलोशिप (सीएल), यूनिवर्सिटी ऑफ कोलोराडो रिसर्च एंड इनोवेशन सीड ग्रांट प्रोग्राम (वीएफ, एससी, और केसी को 2020 पुरस्कार), और कोलोराडो विश्वविद्यालय में अंशुट्ज़ बोल्डर नेक्सस सीड ग्रांट (वीएफ और केसी को) द्वारा समर्थित किया गया था। लोडिंग चैंबर डिजाइन के साथ-साथ सहायक चर्चाओं के लिए कैल्व लैब के सदस्यों के साथ मदद के लिए डॉ टायलर टटल को विशेष स्वीकृति दी जाती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
11 Blade Fisher 3120030 Removable blade
1x PBS Fisher BP399-1 Diluted from 10x concentration
Chondroitinase ABC Sigma C3667-10UN Enzyme 
Collagenase Type I Worthington Biochemical LS004194 Enzyme 
Confocal Microscope Leica STELLARIS 5 Upright configuration
Dissection Microscope Leica S9E With camera
Dumont #5 Forceps Fisher NC9626652 Thin tip
Female C57BL/6J mice Jackson Laboratory strain #: 000664
FemtoTools Micromanipulator FemtoTools FT-RS1002 100 mN load cell
FST Curved Forceps Fisher NC9639443 Curved tip
FST Sharp 9 mm Scissors  Fisher NC9639443 Dissection scissors
Ghost Dye 780  Tonbo 13-0865-T500 Free amine stain
Kimwipes Fisher 06-666 Box of 50 wipes
OCT Tissue Tek 4583 Used for tissue preservation
PDMS Thermo Fisher 044764.AK Follow manufacturer's instructions
Petri Dishes 35 mm Fisher FB0875711A Used for dissected tissue
Polyglactin 5-0 Suture Veter.Sut VS385VL With needle
Renishaw InVia Raman Microscope Renishaw PN192(EN)-02-A With confocal objectives
Rocking Platform VWR 10127-876 2 tier platform
Surgical Gloves Fisher 52818 For dissection 
Sytox Thermo Fisher S11381 Nuclear stain 
T-pins Fisher S99385 For dissection 
Transfer Pipets Fisher 13-711-7M For dissection 
Underpads Fisher 22037950 To cover dissection pad

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References

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मुराइन गर्भाशयसेक्रल स्नायुबंधन और श्रोणि तल अंगों का अलगाव और लक्षण वर्णन
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Bastías, C. S., Savard, L. M.,… More

Bastías, C. S., Savard, L. M., Eckstein, K. N., Connell, K., Luetkemeyer, C. M., Ferguson, V. L., Calve, S. Isolation and Characterization of the Murine Uterosacral Ligaments and Pelvic Floor Organs. J. Vis. Exp. (193), e65074, doi:10.3791/65074 (2023).

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