Summary
Her beskriver vi en detaljeret protokol til brug af et luciferase-baseret reporterassay i et semi-automatiseret screeningsformat med høj kapacitet.
Abstract
Voksende beviser har vist, at høj autofagisk flux er relateret til tumorprogression og kræftbehandlingsresistens. Analyse af individuelle autofagiproteiner er en forudsætning for terapeutiske strategier rettet mod denne vej. Hæmning af autofagi protease ATG4B har vist sig at øge den samlede overlevelse, hvilket tyder på, at ATG4B kunne være et potentielt lægemiddelmål for kræftbehandling. Vores laboratorium har udviklet et selektivt luciferase-baseret assay til overvågning af ATG4B-aktivitet i celler. Til dette assay er substratet for ATG4B, LC3B, mærket ved C-terminalen med en udskillelig luciferase fra den marine vandloppe Gaussia princeps (GLUC). Denne reporter er knyttet til actincytoskelettet og holder det således i cytoplasmaet i celler, når det onkeleres. ATG4B-medieret spaltning resulterer i frigivelse af GLUC ved ikke-konventionel sekretion, som derefter kan overvåges ved at høste supernatanter fra cellekultur som et korrelat af cellulær ATG4B-aktivitet. Dette papir præsenterer tilpasningen af dette luciferase-baserede assay til automatiseret high-throughput screening. Vi beskriver arbejdsgangen og optimeringen til eksemplarisk high-throughput analyse af cellulær ATG4B-aktivitet.
Introduction
Autofagi er en konserveret metabolisk proces, der gør det muligt for celler at holde intracellulær homeostase og reagere på stress ved at nedbryde alderen, defekt eller unødvendigt cellulært indhold via lysosomerne 1,2,3. Under nogle patofysiologiske forhold fungerer denne proces som et afgørende cellulært respons på næringsstof- og iltmangel, hvilket resulterer i genanvendte næringsstoffer og lipider, hvilket gør det muligt for cellerne at tilpasse sig deres metaboliske behov 2,3,4. Autofagi er også blevet identificeret som et cellulært stressrespons relateret til flere sygdomme, såsom neurodegenerative lidelser, patogeninfektion og forskellige former for kræft. Funktionen af autofagi i kræft er kompleks og afhængig af tumorens type, stadium og status. Det kan undertrykke tumorigenese gennem autofagisk nedbrydning af beskadigede celler, men kan også fremme overlevelsen af avancerede tumorer ved at forbedre celleoverlevelsen under stressende forhold, såsom hypoxi, næringsstofmangel og cytotoksisk skade 2,4,5,6.
Flere undersøgelser har vist, at autofagihæmning giver en fordel som en kræftstrategi. Således kan hæmning af kritiske trin, såsom autofagosomdannelse eller dets fusion med lysosomet, være en effektiv metode til kræftbekæmpelse 2,4,5,6. Voksende beviser har vist, at ATG4B er involveret i visse patologiske tilstande, og det har fået opmærksomhed som et potentielt anticancermål 2,3,4. For eksempel blev det observeret, at kolorektal cancerceller og humane epidermale vækstfaktorreceptor 2 (HER2)-positive brystkræftceller havde signifikant højere ATG4B-ekspressionsniveauer end tilstødende normale celler 2,4. I prostatacancerceller resulterede hæmning af ATG4B i en cellelinjespecifik modtagelighed for kemoterapi og strålebehandling7. For nylig er der fremkommet stærke beviser for, at pancreas ductal adenocarcinom (PDAC) er særligt sårbar over for ATG4B-hæmning. For eksempel blev det i en genetisk manipuleret musemodel vist, at intermitterende tab af ATG4B-funktion reducerer PDAC-tumorvækst og øger overlevelsen 3,4. Samlet set er ATG4B stærkt overudtrykt i nogle kræftformer, er relateret til progression af tumor og er forbundet med kræftbehandlingsresistens 2,4,8.
ATG4 cysteinproteaser hos pattedyr har fire familiemedlemmer, ATG4A-ATG4D. Disse proteiner udviser en vis målselektivitet over for LC3/GABARAP (ATG8) familien af proteiner 9,10,11 og kan have yderligere funktioner, der ikke er knyttet til deres proteaseaktivitet12,13. Desuden fungerer ATG4 til regulering af en ny type posttranslationel modifikation, ATG8-ylering af proteiner11,12. Mens ATG4B og dets hovedsubstrat LC3B er de mest undersøgte, tegner der sig et billede, der tyder på en kompleks rolle for hvert underfamiliemedlem i reguleringen af autofagiske og ikke-autofagiske processer. Dette bekræftes yderligere af et komplekst netværk af posttranslationelle modifikationer, der regulerer ATG4B-aktivitet via phosphorylering, acetylering, glykosylering og nitrosylering 9,10,11,12,13.
Flere kendte ATG4B-hæmmere er publiceret 2,4,14,15. Selvom disse er egnede som forskningsværktøjer, har deres farmakodynamiske profil, selektivitet eller styrke endnu udelukket dem fra udvikling som prækliniske kandidater 4,16. Samlet set er der et presserende behov for at identificere mere potente og selektive forbindelser. Ofte er forbindelserne gode biokemiske hæmmere af proteinfunktion, men deres effektivitet i cellebaserede assays er dårlig. Der er flere assays til overvågning af ATG4B-aktivitet, herunder biokemiske metoder og cellebaserede assays4. Vi har tidligere udviklet et simpelt, luminescensbaseret assay med høj kapacitet til overvågning af ATG4B-aktivitet i cellerne 8,17. Dette assay anvender et luciferaseprotein fra Gaussia princeps (GLUC), der er stabilt og aktivt i det ekstracellulære miljø og kan frigives uløseligt fra celler som reaktion på ATG4B proteolytisk aktivitet18,19.
I denne reporterkonstruktion er dNGLUC knyttet til cellernes actincytoskelet. En proteasespecifik linker kan introduceres mellem β-actinankeret og dNGLUC, hvilket gør sekretionen afhængig af kløvning af linkeren. Vi brugte LC3B's åbne læseramme i fuld længde mellem β-actin og dNGLUC for at kunne overvåge LC3B-spaltning17,18,19. Selvom sekretionsmekanismen for dNGLUC er dårligt forstået, er den specifik til overvågning af ATG4B-aktivitet, afhænger ikke af den samlede autofagi, da den forekommer i ATG5-knockout-celler, og medieres af ikke-konventionelle mekanismer, der ikke kræver et klassisk signalpeptid 4,18,19. Vi har med succes brugt denne reporter til at screene små molekyler og siRNA-biblioteker og har identificeret nye regulatorer af ATG4B-aktivitet, såsom Akt-proteinkinaser8. Dette papir beskriver en detaljeret protokol for brugen af denne luciferase reporter i et semi-automatiseret, high-throughput screeningsformat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Analyseprocessen er skitseret i figur 1. Se materialefortegnelsen for detaljer vedrørende alle materialer, reagenser og udstyr, der anvendes i denne protokol.
1. Produktion af retrovirus
BEMÆRK: Plasmidet, der koder for ActinLC3dNGLUC, er pMOWS-ActinLC3dNGLUC20. Brug et lavt antal celler til produktion af højtitervirus (ideelt set mindre end P20).
- Dyrkning HEK293T celler i Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin (P/S) ved 37 °C i en befugtet inkubator med en atmosfære på 5% CO2 , indtil de er 80% -90% sammenflydende før såning til transfektion.
- Dagen før transfektion frø cellerne i en 6-brøndplade med en densitet på 1 × 106 celler / brønd i 2 ml / brønd af komplet vækstmedium. Inkuber pladen natten over i en befugtet inkubator med en atmosfære på 5% CO2.
BEMÆRK: Følg producentens anvisninger, hvis du bruger et liposomalbaseret transfektionsreagens. Denne protokol beskriver brugen af et ikke-liposomalt baseret reagens. Før transfektionen påbegyndes, skal du lade DNA-transfektionsreagenset, DNA'et og mediet ekvilibrere til stuetemperatur (~ 15 min). - For hver transfektion tilsættes 200 μL serumfrit medium til 1,5 ml mikrocentrifugeglas. I hvert rør tilsættes følgende mængder plasmider: 1.000 ng pMOWS-ActinLC3dNGLUC; 900 ng GagPol; 100 ng VSV-G.
BEMÆRK: Mængden af plasmider og mængden af medier, der er angivet her, er for en 12-brønds plade. Hvis du bruger en anden pladetype, skal du justere medievolumen og plasmidmængder for at nå den endelige koncentration på 5 ng / μL overførselsplasmid, 4,5 ng / μL pakningsplasmid og 0,5 ng / μL konvolutplasmid. Brug ethvert pakningsplasmid, der indeholder gag- og pol-ekspressive gener, og ethvert kuvertplasmid, der indeholder VSV-G-ekspressionsgenet. - Vortex hætteglasset med DNA-transfektionsreagens i 30 s. Pipette 4 μL transfektionsreagenset pipetteres direkte ind i mediet indeholdende det fortyndede DNA. Bland forsigtigt ved forsigtigt at vippe røret.
BEMÆRK: Rør ikke ved væggene i plastrørene med spidserne. Pipette ikke op og ned eller hvirvelstrøm. - Inkuber reaktionen i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Under inkubation af reaktionen fjernes det gamle substrat fra 6-brøndpladen og erstattes med 2 ml / hul frisk serumfrit medium.
- Tilsæt hvert transfektionskompleks til hver brønd på en dråbevis måde.
- Ryst eller hvirvl forsigtigt pladen for at sikre jævn fordeling over hele brøndoverfladen.
- Pladen inkuberes natten over ved 37 °C i en befugtet inkubator med en atmosfære på 5% CO2.
- Efter 24 timer udskiftes det gamle substrat med friskt, komplet substrat (2 ml/brønd), og cellerne returneres til den befugtede inkubator med en atmosfære på 5% CO2 i 72 timer.
- Efter 72 timer høstes supernatanten i et 50 ml konisk glas og centrifugeres i 10 minutter ved 4.000 × g ved 4 °C for at fjerne døde celler og snavs. Til yderligere rensning anvendes en stor 60 ml sprøjte til at føre supernatanten gennem et 0,20 μm filter. Forbered straks alikvoter til engangsbrug på 300 μl og opbevar ved -80 °C.
BEMÆRK: Undgå en fryse-optøningscyklus for at opretholde maksimal produktaktivitet.
2. Retroviral transduktion
- Dagen før transducering af cellerne sås målcellerne med medium densitet (PANC1 ved 1 × 10 5 celler/brønd) i en 12-brønds plade i 1 ml/hul medium suppleret med 10% FBS og 1% P/S. Pladen inkuberes natten over ved 37 °C i en befugtet inkubator med en atmosfære på5 % CO2.
BEMÆRK: Den bedste celletæthed skal fastlægges på forhånd, da forskellige celletyper har forskellige tilknytningsevner. Ideelt set skal du bruge en celletæthed til at opnå 40% -50% sammenløb. - De frosne retrovirusprøver tages ud af fryseren til -80 °C, og de tøs op på is før hver brug.
BEMÆRK: Nedfrys ikke ubrugte delprøver. - I et 50 ml konisk glas fremstilles en blanding af viral supernatant og polybren i en slutkoncentration på 8 μg/ml.
BEMÆRK: De efterfølgende volumener gælder for transduktion af en 12-brønds plade indeholdende et slutvolumen på 500 μL / brønd. Det endelige virale supernatantvolumen kan estimeres ved at teste en række virale fortyndinger ved tilstedeværelse af polybran. Højere eller lavere fortyndinger kan anvendes afhængigt af de ønskede ekspressionsniveauer af transgenet og størrelsen af den anvendte beholder. - Fjern det gamle medium fra pladen med 12 huller, og tilsæt 500 μL af blandingen til hvert hul. Virussupernatanten inkuberes med virussupernatten natten over ved 37 °C i en befugtet inkubator med en atmosfære på 5 % CO2.
BEMÆRK: Opbevar to huller med komplet substrat (ingen viral supernatant) til brug som kontrol ved udvælgelsen. - Det virusholdige substrat erstattes med friskt, komplet vækstmedium (1 ml/hul). Placer cellerne tilbage i den befugtede inkubator med en atmosfære på 5% CO2 i 48 timer.
3. Pulje befolkningsudvælgelse og vedligeholdelse
- Vækstmediet erstattes med selektionsmediet (komplet vækstmedium med en slutkoncentration på 1 μg/ml puromycin). Overvåg cellernes vækst og skift markeringsmediet hver 2-3 dage. Ved sammenløbet udvides til en 6-brøndskål og derefter til en vævskulturskål med en diameter på 10 cm.
- Hold cellerne i selektionsmediet mindst lige så længe, som det tager for kontrolcellerne (utransduced) at dø helt.
BEMÆRK: For vellykkede resultater anbefales det, at optimale koncentrationer af puromycin bestemmes inden forsøgsprojektet påbegyndes. Til dette skal du generere en puromycin drabskurve for at bestemme den minimumskoncentration, der kræves for at dræbe utransducerede celler mellem 3 og 10 dage. - Når cellerne vokser i selektionsmediet, skal du udvide cellerne på komplette vækstmedier og fryse lageralikvoter til det eksperimentelle projekt.
BEMÆRK: Registrer passagenummeret, og undgå at arbejde med puljepopulationer fra frosset bestand med passagenumre højere end fem. Kontroller regelmæssigt for mycoplasma-kontaminering inden analysen udføres. Ideelt set skal du bruge en frisk cellebatch før hvert assay for at opnå det maksimale signal fra luciferase. - Oprethold cellerne i selektionsmedium og frø nok celler til at nå den ønskede densitet dagen før analysen.
4. Sammensat tilsætning
BEMÆRK: Selleckchem lille molekylebibliotek består af ca. 4.000 forbindelser arrangeret i otte rækker og 10 kolonner i halvtreds 96-brøndplader ved en lagerkoncentration på 10 mM i dimethylsulfoxid (DMSO).
- Alikvote 30 μL forbindelse i det relevante hul på en kildeplade, der er kompatibel med en akustisk væskedispenser i nanoskala. Brug en polypropylenplade med 384 brønde (384PP-plade). Opbevar disse plader forseglet og opbevaret ved -20 °C.
BEMÆRK: Screeningsprotokollen beskrevet her er for i alt 10 analyseplader pr. Dag; en fast koncentration på 10 μM blev anvendt som den endelige analysekoncentration sammen med en inkubationsperiode på 24 timer. - Optø de sammensatte biblioteksplader ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Sørg for, at pladen er helt optøet og ekvilibreret til stuetemperatur. En temperaturgradient over pladen kan påvirke væskehåndteringen. - Dispenser 50 nL/brønd i en analyseplade med 384 brønde ved hjælp af en akustisk væskedispenser i nanoskala.
BEMÆRK: Sørg for, at de valgte kilde- og destinationsplader i programmet svarer til dem, der bruges til dette trin. - Opret et dispenseringsprogram på et regneark.
- Åbn softwaren.
- Åbn en ny protokol. Vælg følgende indstillinger under fanen Protokol : Prøvepladeformat, 384PP; Prøvepladetype, 384PP_DMSO2; og destinationspladetype, CellCarrier-384 Ultra PN (figur 2A).
- Vælg importindstillingen (Figur 2B) under Plukliste for at importere regnearket, der indeholder dispenseringsprogrammet (Figur 2C).
- Vælg indstillingen Kør protokol (figur 2D), kontroller, om de viste oplysninger er korrekte, og klik på Kør.
- I det nye vindue kaldet Kør status (Figur 2E), klik på Start og følg trinnene, der vises på promptvinduerne (Figur 2F, G).
5. Cellesåning
- Trypsinisere cellerne fra en cellekulturkolbe eller cellekultur petriskåle og neutralisere trypsin ved at tilføje FBS-holdige medier.
- Overfør cellesuspensionen til et 50 ml konisk rør og centrifuger ved 390 × g i 5 minutter ved stuetemperatur. Derefter fjernes supernatanten forsigtigt, og cellepelletsen resuspenderes i 10 ml hele vækstmedier.
- Udfør celletælling.
- Klargør cellesuspensionen med 4,6 × 107 celler i 230 ml komplette dyrkningsmedier.
BEMÆRK: Dette volumen og celletæthed er for 10x 384-brønds analyseplader plus et dødt volumen på to 384-brøndplader. - Der hældes 50 μL cellesuspension i hvert hul i en analyseplade med 384 huller, der er fremstillet i afsnit 4.
BEMÆRK: Cellesåning kan udføres enten manuelt eller ved hjælp af en bulkdispenser. - Cellerne inkuberes ved 37 °C i en befugtet inkubator med en atmosfære på 5% CO2 i 24 timer.
6. Udtagning af cellesupernatanten
BEMÆRK: Væskehåndteringsrobotplatformen, der bruges her, udfører væskehåndtering med en multikanalarm til 96-tip. Hvis der ikke findes automatisering af væskehåndtering, kan protokollen tilpasses til low-throughput-format ved hjælp af multikanalpipetter.
- Konfigurer præsentationen af arbejdsstationen til automatisering af laboratoriet som vist i figur 3.
- Anbring engangsstakken med 96 spidser på position P1 (figur 3A).
BEMÆRK: Hver stak med 96 spidser er dannet af otte engangsstativer. Når du bruger en multikanalarm til 96-spidser, er 384-brøndpladen opdelt i fire kvadranter. Hver spidsstak er således tilstrækkelig til at overføre supernatanten fra to analyseplader til to tomme, sorte, 384 brøndplader. Hele spidsstakken skal udskiftes efter hver kørsel af to plader. - Analysepladerne anbringes på positionerne P2 og P4 (figur 3A).
- Placer de tomme, sorte, 384-brøndede plader på positionerne P3 og P5 (figur 3A).
BEMÆRK: Denne fleksible og dygtige robotplatform er blevet tilpasset til dette assay, og der blev skrevet et specielt program (figur 3B). - Få tipene fra position P1.
- Der suges 10 μl supernatant fra pladen på position P2 og overføres til den tomme, sort-sorte plade i position P3.
BEMÆRK: Spidserne skal placeres i en passende dybde inde i hullerne for at opsuge supernatanten uden at forstyrre cellemonolaget i bunden af brønden. - Smid lossepladserne i affaldsposition P6 (figur 3A).
- Trin 6.5-6.7 gentages for de resterende huller på pladen i position P2, og derefter gentages de samme trin for at overføre supernatanten fra position P4 til position P5.
BEMÆRK: Sørg for at samle supernatanten og dispensere den i de tilsvarende huller i den tomme, sort-sorte plade (figur 3C,D). Da udskilt dNGLUC er meget stabilt i cellekulturmedium, kan pladerne forsegles og opbevares i op til 7 dage ved 4 °C i mørke.
7. Luciferase-analyse
BEMÆRK: Den dNGLUC, der anvendes i reporteren, udviser flashkinetik med hurtigt signalhenfald. På grund af det hurtige nedbrydning af luminescens efter tilsætning af substrat (coelenterazin) bør pladelæseren indstilles til at måle luminescenssignalet i supernatanterne; Injicer substratet i en brønd og læs det godt efter et par sekunder. Brug derfor en pladelæser, der er i stand til at overvåge luminescens og udstyret med en substratinjektor for at sikre, at tiden mellem injektions- og læsetrinnet vil være ensartet for alle prøver. De indstillinger, der bruges på pladelæseren, findes i figur 4.
- Forbered native coelenterazin som en 1 mg/ml stamopløsning i syrnet methanol (10 μL 3 M HCI til 1 ml methanol).
BEMÆRK: Følg lokale sundheds- og sikkerhedsretningslinjer vedrørende håndtering af methanol i laboratoriet og undgå kontakt med huden. Forbered den friske arbejdssubstratopløsning, inden analysen påbegyndes. - Initialiser injektorpumpen (figur 5A).
- Skyl slangen med deioniseret vand (figur 5B-D).
- Skyl slangen med methanol.
- Under skylning af slangen fremstilles arbejdssubstratopløsningen ved at fortynde substratet 1:100 (for en plade med 384 huller tilsættes 220 μL fra substratstamopløsningen til 21,8 ml 1x fosfatbufret saltvand [PBS]).
- Skyl slangen med substratarbejdsløsningen (figur 5B-D).
- Læg pladen i læseren, og start målingen ved hjælp af indstillingerne beskrevet i figur 4.
- Gentag trin 7.6-7.7 for alle analyseplader.
- Når du er færdig med alle analysepladerne, skylles slangen med methanol.
- Skyl slangen med deioniseret vand.
BEMÆRK: I slutningen af dette trin opnås rå luciferaseværdier, der er korreleret med den cellulære ATG4B-aktivitet. For normalisering til cellenumre er de næste trin nødvendige ved at tælle cellenummeret i hver brønd ved fluorescensmikroskopi.
8. Cellefiksering og farvning
BEMÆRK: Dette trin kan udføres manuelt ved hjælp af en multikanalpipette eller ved hjælp af en bulkdispenser.
- Fastgør cellerne med 4% paraformaldehyd (i 1x PBS) i 15 min.
BEMÆRK: Følg lokale sundheds- og sikkerhedsretningslinjer vedrørende håndtering af paraformaldehyd i laboratoriet og undgå kontakt med huden. Udfør dette trin i en sikkerhedshætte, hvis det er muligt. - Vask tre gange med 1x PBS.
- Plet kernerne med Hoechst 33342 fortyndet 1:5.000 i 1x PBS i 15 min.
- Vask tre gange med 1x PBS.
9. Optagelse af billeder
BEMÆRK: Udfør billedoptagelse ved hjælp af et automatiseret mikroskop. Som et alternativ til billedoptagelse for at bestemme antallet af celler kan den intracellulære luciferaseaktivitet også bestemmes. Der er fordele og ulemper med hensyn til, om man normaliserer til cellenumre eller til intracellulær luciferaseaktivitet, som diskuteres nedenfor. Vi finder ud af, at bestemmelse af cellenumre er mindre invasiv og resulterer i lavere variabilitet end bestemmelse af intracellulære luciferaseværdier.
- Start mikroskopets driftssoftware (figur 6).
- På fanen Opsætning skal du vælge den korrekte foruddefinerede pladetype. Hvis pladetypen ikke er forudindstillet, skal du indtaste pladedimensionerne manuelt.
- Læg pladen i mikroskopet ved at klikke på Skub ud og indlæs mulighed.
- Vælg derefter målsætningen 20x Air (numerisk blænde [NA]: 0,4).
BEMÆRK: Sørg for, at målkraven er indstillet til den korrekte værdi, hvilket giver korrekt fokus med forskellige pladetyper. - Under Valg af kanal skal du vælge Hoechst 33342.
BEMÆRK: Kanalindstillingerne for tid, effekt og højde skal optimeres i henhold til den anvendte pladetype. - I Definer layout skal du markere alle felter fra pladen og fire felter fra brønden.
- På Online Jobs skal du vælge den tilsvarende mappe for at overføre dataene til analysesoftwaren.
10. Billedanalyse
BEMÆRK: Enhver billedanalysesoftware kan bruges til at segmentere og tælle cellekerner fra de erhvervede billeder. Her beskriver vi trinene til at bruge en bestemt online software, der er kompatibel med flere automatiserede mikroskopfiler.
- Start billedanalysesoftwaren.
- Gå til fanen Billedanalyse for at starte billedsegmenteringen (figur 7A).
- På fanen Inputbillede skal du klikke på + -tegnet for at tilføje en ny dokumentkomponent (figur 7A).
- Vælg indstillingen Find kerner på listen (figur 7A), og vælg Hoechst 33342 som kanalindstilling (figur 7B).
- Undersøg visuelt de segmenterede objekter på billedet, og vælg den mest nøjagtige segmenteringsmetode.
BEMÆRK: Til dette eksperiment brugte vi metode C (figur 7C). Hver metodeindstilling har underkategorier, der kan justeres for at opnå den bedst mulige segmentering. - Klik derefter på fanen Definer resultater (figur 7C) og vælg Standardoutput som metodeindstilling .
- Fra underkategorien skal du vælge Nuclei-number of objects og Object count (figur 7C).
- Gem analysepipelinen ved hjælp af indstillingen Gem analyse på disk eller Gem analyse i database .
- Under fanen Batchanalyse skal du vælge de data, der skal analyseres fra træet.
- Vælg den analysepipeline, der blev gemt i trin 10.8, under Metode.
BEMÆRK: Det er også muligt at uploade en scriptfil uden for den refererede software eller uploade en eksisterende analyse, der er gemt i databasen. - Klik på Kør analyse for at starte analysen (figur 7D). I slutningen af denne arbejdsgang genereres to datasæt: rå luciferaseværdier fra supernatanterne og cellenummeret i hvert hul. Brug begge til at normalisere luciferase-værdien pr. celle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en tidligere publikation8 brugte vi med succes dette assay til at screene små molekyle- og siRNA-biblioteker og identificerede nye regulatorer af ATG4B. Her beskriver vi protokollen og repræsentative resultater af denne luciferase reporter i et semi-automatiseret, high-throughput screeningsformat. Figur 8 viser et eksempel på rådataanalyse for både cellekerner og luminescens. Et typisk resultat af en luminescensmåling er vist i figur 8A. Det basale luminescenssignal fra DMSO kan ses i kolonne 1 og i nærvær af 10 μM af ATG4B-hæmmeren FMK9A i kolonne 24. Kernetællingsresultatet fra den samme plade kan ses i figur 8B. Råværdier for hver forbindelse blev normaliseret til neutrale kontrolmiddelværdier for at opnå procentdelen af ATG4B-aktivitet og celleoverlevelse (figur 9A, B). Som forventet havde de fleste forbindelser ingen effekt på ATG4B-aktiviteten, som angivet ved værdier tæt på basalluminescensen fra den negative kontrol (DMSO - kolonne 1). Z'-faktoren, som er et kvalitetsindeks for screening med høj kapacitet, blev beregnet ved hjælp af ligning (1):
Z' = 1 - (3 × 
) (1)
Hvor STDpos er standardafvigelsen for den positive kontrol (FMK9a), er STDneg standardafvigelsen for den negative kontrol (DMSO), AVGpos er gennemsnittet af den positive kontrol, og AVGneg er gennemsnittet af den negative kontrol.
For at vælge hitsene brugte vi de normaliserede værdier til at beregne et forhold, der skulle bruges som en cut-off-værdi til identifikation af ATG4B-hæmmere. Forholdet blev beregnet ved at dividere ATG4B-aktiviteten af hver forbindelse med dens cellelevedygtighed. Vi vurderede, at forhold >1 indikerede mulige ATG4B-aktivatorer, og forhold <1 indikerede mulige ATG4B-hæmmere (figur 9C). Vi udvalgte alle stoffer med forholdsværdier svarende til den positive kontrol FMK9A og udelukkede forbindelser, der var cytotoksiske.
På denne skærm har vi udvalgt 53 ATG4B-hæmmere for at bekræfte og evaluere deres aktivitet og toksicitet. Forbindelserne blev testet i 10 koncentrationer som tofoldsfortyndinger fra 100 μM til 195 nM. De celler, der blev behandlet på en koncentrationsresponsmåde, gjorde det muligt at tilpasse de kvantificerede data og beregne EC50-værdierne . Hæmmernes relative toksicitet blev kvantificeret ved hjælp af data om cellelevedygtighed. Samlet set viste disse resultater, at denne tilgang muliggør identifikation af ATG4B-modulatorer.
Figur 1: Assay workflow. Eksperimentet beskriver tidslinjen for stabil cellelinjegenerering og en analysearbejdsgang med høj kapacitet, startende med den stabile cellelinjegenerering, sammensat screening, måling af luciferase, billedoptagelse og dataanalyse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Trin for trin instruktioner til opsætning af væskehåndterer . (A) Indstillinger for fanen Protokol . (1) Vælg prøvepladeformat og -type. (2) Vælg destinationspladetype. (B) Vælg fanen Liste . (1) Brug importindstillingen til at importere regnearket. (C) Importer promptvindue til plukliste . (1) Vælg de parametre, der skal importeres. (2) Klik Importere at konkludere. (D) Løbende protokol. (1) Klik på Kør ikon. (2) Promptvindue, der viser kørselsindstillingen og for at starte protokolkørslen. (E) Kør status fane. (1) Start protokollen. (F) Promptvindue til ilægning af kildepladen. (G) Promptvindue til ilægning af destinationsskiltet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Konfiguration af væskehåndteringsrobot. (A) Konfiguration af Tecan-dækket. (P1) Position for 50 μL engangsspidsstakken. (P2,P4) Positioner for analysepladen. (P3,P5) Positioner for de tomme, solid-sorte, 384-brønds plader. (P6) Position til bortskaffelse af de brugte spidser. (B) Skærmbillede af analysescriptet. (C) Skærmbillede af MAC96-aspireringsdetaljerne. (1) Vælg aspirationsvæskeklasse. (2) Indtast volumen for aspiration. (3) Vælg brøndpositionerne for aspiration. (D) Skærmbillede af MAC96-udleveringsdetaljerne. (1) Vælg dispenservæskeklasse. (2) Indtast volumen til dispensering. (3) Vælg de samme brøndpositioner til dispensering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Skærmbillede af indstillingerne for luminescenspladelæseren . (A) Fanen Måleindstillinger . (1) Vælg blænden. (2) Vælg afstand, tid og korrektionsfaktor. (B) Protokol generelle indstillinger. (1) Vælg pladetype. (2) Vælg måletilstand. (3) Vælg antallet af analyseplader. (C) Dispenser måleindstillinger. (1) Vælg målingen. (2) Indstil måletiden. (3) Vælg pumpe, dispenseringshastighed og volumen. (4) Definer dispenseringsrækkefølgen og pladegentagelsen. (D) Fanen Valg af brønd. (1) Vælg de brønde, der skal måles. (2) Start måleprotokollen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Skærmbillede af dispenserstyringen af luminescenspladelæseren . (A) Fanen Initialisering . (1) Vælg pumpen. (2) Start pumpen. (B) Skyl protokol mulighed. (1) Vælg skylleindstillingen. (2) Klik på næste for at gå til indstillinger. (C) Indstillinger for skylning af fane. (1) Vælg pumpen. (2) Vælg spidsbeslaget. (3) Klik på næste for at gå til næste fane. (D) Tab til start af skylningen. (1) Klik på start for at starte skylleprotokollen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Skærmbillede af den automatiserede billedbehandlingssoftware med højt indhold af mikroskoper. Oplysninger om de indstillinger, der bruges til hentning af billeder. (1) Fanen Opsætning . (2) Vælg pladetype. (3) Vælg Skub ud for at lægge pladen i mikroskopet. (4) Vælg målet. (5) Tilføj kanalen. (6) Vælg den mappe, hvor data skal overføres til Columbus-softwaren. (7) Vælg brønde. (8) Vælg felter. (9) Klik på Kør eksperiment fanen for at starte billedoptagelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Billedanalyse på online software . (A) Fanen Billedanalyse . (1) Klik på + for at tilføje en dokumentkomponent. (2) Vælg Find kerner mulighed. (B) Find kerneindstillinger . (1) Vælg kanalen. (2) Vælg segmenteringsmetode. (C) Definer resultater fane. (1) Vælg Standard output. (2) Vælg den indstilling, der skal vises som resultat. (D) Billedanalyse. (1) Fanen Batchanalyse . (2) Vælg målingen. (3) Vælg analysemetode. (4) Start billedanalyse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Repræsentative billeder fra luciferasemålinger og kimtal . (A) Luciferase relative intensitetsværdier fra en 384-brønds analyseplade repræsenteret af tal og farver. (B) Resultater af billedanalyse. (1) Varmekort over kerneantallet af objekter. (2) Tabel, der viser resultaterne for hver brønd. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Repræsentative resultater efter datanormalisering. (A) Repræsentativ ATG4B-aktivitetsprocent efter datanormalisering til gennemsnitlig ATG4B-aktivitet fra negative kontrolbrønde (DMSO) inden for samme plade. Aktivatorer er vist i rødt og inhibitorer i blåt, hvor hvid indikerer ingen signifikant ændring i aktiviteten. Negativ kontrol (DMSO) findes i kolonne 1, og positiv kontrol (FMK9A) findes i kolonne 24. (B) Repræsentativ cellelevedygtighedsprocent efter datanormalisering til gennemsnitligt celleantal fra negative kontrolbrønde (DMSO) inden for samme plade. Proliferation er vist i grønt og toksicitet i rødt, hvor gul indikerer ingen signifikant ændring i cellelevedygtighed. Negativ kontrol (DMSO) findes i kolonne 1, og positiv kontrol (FMK9A) findes i kolonne 24. (C) Fordeling af forbindelser i henhold til forholdsværdien. Hver prik repræsenterer en forbindelse. Forholdet blev beregnet ved at dividere ATG4B-aktiviteten med cellelevedygtighed. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver et cellebaseret reporter-genassay til identifikation af ATG4B-hæmmere. Identifikationen af primære hits er baseret på luciferaseaktivitet ved behandling af celler, der udtrykker LC3B's åbne læseramme i fuld længde mellem β-actin og dNGLUC. Nogle fordele ved dette assay er, at det er følsomt, meget kvantitativt og ikke-invasivt, da det kan detektere dNGLUC uden at lysere cellerne. Dette papir præsenterer en detaljeret protokol til generering af en stabil cellelinje og en primær screening. Der er et par kritiske trin i protokollen.
For det første brugte protokollen beskrevet her PANC1-cellelinjen, som præsenterer en høj transfektionseffektivitet og høj spredningsevne. Denne screeningsmetode kan udføres ved hjælp af andre cellelinjer, men transduktionseffekten kan variere fra en cellelinje til en anden. For det andet bør man undgå at arbejde med stabile cellepopulationer fra frosset bestand med passagenumre højere end fem, da indberetterens ekspressionsniveauer kan falde over tid. For det tredje er det vigtigt at bruge en frisk cellebatch før hvert assay for at opnå det maksimale og et konsistente signal af luciferase inden for forskellige eksperimenter. For det fjerde, når cellerne sås, enten manuelt eller ved hjælp af en bulkdispenser, skal cellesuspensionen konstant omrøres for at opnå en homogen celletæthed i hele pladen. For det femte er det, når supernatanten udtages fra brønden, vigtigt, at spidserne placeres i en passende dybde inde i hullerne for at opsuge supernatanten uden at forstyrre cellemonolaget i bunden af brønden. Endelig skal substratarbejdsløsningen fremstilles på analysedagen. Coelenterazin er meget lysfølsomt og udsat for oxidation, og der er nogle rapporter om hurtig substrathenfald efter tilberedning.
En række cellebaserede assays er tilgængelige for at undersøge konsekvensen af ATG4B-hæmning eller aktivering, men undersøgelse af ATG4B's cellulære aktivitet forbliver begrænset4. Denne metode er ikke-invasiv, meget følsom, robust og direkte afhængig af ATG4B-aktivitet, da dens aktivitet resulterer i frigivelse af dNGLUC. Den beskrevne protokol er enkel og kræver kun kort tid at screene plader med 10x 384 brønde. En anden fordel ved metoden er, at den kan bruges til overvågning af ATG4B-aktivitet in vivo, da dNGLUC er meget stabil og kan måles ex vivo fra serum.
Selvom vi med succes har brugt denne reporter til at screene små molekyle- og siRNA-biblioteker og identificeret nye regulatorer af ATG4B-aktivitet, er der et par begrænsninger, der skal overvejes i denne protokol. For det første er det beskrevne cellebaserede assay afhængig af en reporteraflæsning, der indirekte afspejler ændringer i ATG4B-aktivitet, hvilket muliggør påvisning af både hæmmere og aktivatorer af ATG4B-aktivitet. Derfor bør hittene underkastes yderligere evaluering, så deres specificitet og aktivitet valideres. Desuden bør inhibitorer evalueres yderligere i deres evne til at regulere den rumlige fordeling af LC3 i celler eller af andre autofagirelaterede proteiner. For det andet, selvom dette assay let kan ændres til et mindre assay på grund af dets enkle håndtering og dataanalyse, kræver det en grad af automatisering til substrattilsætning og efterfølgende luminescensmåling. For det tredje, fordi mekanismen for dNGLUC-frigivelse er dårligt forstået på molekylært niveau, kan forbindelser, der interfererer med elementer i sekretionsvejen, påvirke resultaterne. Endelig kan cellelevedygtigheden også bestemmes af den intracellulære luciferaseaktivitet. Selvom vi finder ud af, at bestemmelse af cellenumre er mindre invasiv og resulterer i lavere variabilitet end bestemmelse af intracellulære luciferaseværdier, begrænser bestemmelse af cellenumre deres anvendelse til mindre forskningslaboratorier, da de giver vanskeligheder med hensyn til billedbehandlingsudstyr, dataanalysesoftware og datalagring. Samlet set muliggør det udviklede cellebaserede reporter-genassay identifikation af ATG4B-hæmmere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af UK Medical Research Councils kernefinansiering til MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B, MRC Dementia Platform Grant UK MR / M02492X / 1, Pancreatic Cancer UK (tilskudsreference 2018RIF_15) og UCL Therapeutic Acceleration Support scheme, støttet af finansiering fra MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC / PC / 19054. Plasmidet, der koder for ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC), blev opnået fra Dr. Robin Ketteler (Institut for Human Medicin, Medical School Berlin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
References
- Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
- Fu, Y., et al.
- Towers, C. G., Thorburn, A.
- Agrotis, A., Ketteler, R. On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns. Cells. 9 (1), 53 (2019).
- Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A.
- Kimmelman, A. C., White, E.
- Tran, E., et al. Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).
- Pengo, N., et al. Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148 (2018).
- Kauffman, K. J., et al. Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases. Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).
- Tanida, I., Sou, Y. -S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3. The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).
- Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells. Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).
- Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).
- Ketteler, R., Tooze, S. A.
- Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy. Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).
- Fernández, ÁF., López-Otín, C. The functional and pathologic relevance of autophagy proteases. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).
- Maruyama, T., Noda, N. N. Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition. The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).
- Ketteler, R., Seed, B. Quantitation of autophagy by luciferase release assay. Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).
- Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -W., Seed, B. A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage. Genome Biology. 9 (4), 64 (2008).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15, 14 (2014).
- Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors. Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).
