Summary
Burada, yarı otomatik, yüksek verimli bir tarama formatında lusiferaz bazlı bir raportör testinin kullanımı için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.
Abstract
Artan kanıtlar, yüksek otofajik akının tümör ilerlemesi ve kanser tedavisi direnci ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bireysel otofaji proteinlerinin tahlili, bu yolu hedefleyen terapötik stratejiler için bir ön koşuldur. Otofaji proteazı ATG4B'nin inhibisyonunun genel sağkalımı arttırdığı gösterilmiştir, bu da ATG4B'nin kanser tedavisi için potansiyel bir ilaç hedefi olabileceğini düşündürmektedir. Laboratuvarımız, hücrelerde ATG4B aktivitesini izlemek için seçici lusiferaz bazlı bir test geliştirmiştir. Bu tahlil için, ATG4B'nin substratı, LC3B, deniz kopepodu Gaussia princeps'ten (GLUC) salgılanabilir bir lusiferaz ile C-terminalinde etiketlenir. Bu raportör, aktin hücre iskeleti ile bağlantılıdır, böylece ayrılmadığında hücrelerin sitoplazmasında tutulur. ATG4B aracılı bölünme, geleneksel olmayan sekresyon yoluyla GLAC'ın salınmasına neden olur, bu daha sonra hücresel ATG4B aktivitesinin bir korelasyonu olarak hücre kültüründen süpernatanların toplanmasıyla izlenebilir. Bu makale, bu lusiferaz bazlı testin otomatik yüksek verimli taramaya uyarlanmasını sunmaktadır. Hücresel ATG4B aktivitesinin örnek niteliğindeki yüksek verimli analizi için iş akışını ve optimizasyonu açıklıyoruz.
Introduction
Otofaji, hücrelerin hücre içi homeostazı korumasına ve lizozomlar 1,2,3 yoluyla yaşlı, kusurlu veya gereksiz hücresel içerikleri parçalayarak strese yanıt vermesine izin veren korunmuş bir metabolik süreçtir. Bazı patofizyolojik koşullar altında, bu süreç, besin ve oksijen yoksunluğuna karşı çok önemli bir hücresel yanıt görevi görür ve geri dönüştürülmüş besinler ve lipitlerle sonuçlanırve hücrelerin metabolik ihtiyaçlarına uyum sağlamasına izin verir 2,3,4. Otofaji ayrıca nörodejeneratif bozukluklar, patojen enfeksiyonu ve çeşitli kanser türleri gibi çeşitli hastalıklarla ilişkili hücresel bir stres tepkisi olarak tanımlanmıştır. Kanserde otofajinin işlevi karmaşıktır ve tümörün tipine, evresine ve durumuna bağlıdır. Hasarlı hücrelerin otofajik bozunması yoluyla tümör oluşumunu baskılayabilir, ancak hipoksi, besin yoksunluğu ve sitotoksik hasargibi stresli koşullar sırasında hücre sağkalımını iyileştirerek ileri tümörlerin hayatta kalmasını da teşvik edebilir 2,4,5,6.
Birçok çalışma, otofaji inhibisyonunun bir antikanser stratejisi olarak fayda sağladığını göstermiştir. Bu nedenle, otofagozom oluşumu veya lizozomla füzyonu gibi kritik adımların inhibisyonu, kanser kontrolü için etkili bir yöntem olabilir 2,4,5,6. Artan kanıtlar, ATG4B'nin belirli patolojik durumlarda rol oynadığını göstermiştir ve potansiyel bir antikanser hedefiolarak dikkat çekmiştir 2,3,4. Örneğin, kolorektal kanser hücrelerinin ve insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) pozitif meme kanseri hücrelerinin, bitişik normal hücrelere göre önemli ölçüde daha yüksek ATG4B ekspresyon seviyelerinesahip olduğu gözlenmiştir 2,4. Prostat kanseri hücrelerinde, ATG4B'nin inhibisyonu, kemoterapi ve radyoterapiye hücre hattına özgü bir duyarlılıkla sonuçlandı7. Son zamanlarda, pankreatik duktal adenokarsinomun (PDAC) ATG4B inhibisyonuna karşı özellikle savunmasız olduğuna dair güçlü kanıtlar ortaya çıkmıştır. Örneğin, genetiği değiştirilmiş bir fare modelinde, ATG4B fonksiyonunun aralıklı kaybının PDAC tümör büyümesini azalttığı ve sağkalımı artırdığı gösterilmiştir 3,4. Genel olarak, ATG4B bazı kanser türlerinde yüksek oranda aşırı eksprese edilir, tümörün ilerlemesi ile ilgilidir ve kanser tedavisi direnciile bağlantılıdır 2,4,8.
Memelilerdeki ATG4 sistein proteazlarının ATG4A-ATG4D olmak üzere dört aile üyesi vardır. Bu proteinler, LC3/GABARAP (ATG8) protein ailesine 9,10,11 karşı bir miktar hedef seçicilik sergiler ve proteaz aktivitelerine12,13 bağlı olmayan ek işlevlere sahip olabilir. Ayrıca, ATG4, yeni bir translasyon sonrası modifikasyon türü olan proteinlerin ATG8-ilasyonunudüzenlemede işlev görür 11,12. ATG4B ve ana substratı LC3B en yaygın olarak çalışılanlar olsa da, otofajik ve otofajik olmayan süreçlerin düzenlenmesinde her bir alt aile üyesi için karmaşık bir rol öneren bir resim ortaya çıkmaktadır. Bu, fosforilasyon, asetilasyon, glikozilasyon ve nitrosilasyon yoluyla ATG4B aktivitesini düzenleyen karmaşık bir translasyon sonrası modifikasyon ağı ile daha da desteklenmektedir9,10,11,12,13.
Bilinen birkaç ATG4B inhibitörü yayınlanmıştır 2,4,14,15. Bunlar araştırma araçları olarak uygun olsa da, farmakodinamik profilleri, seçicilikleri veya potansiyelleri, klinik öncesi adaylar olarak gelişmelerini henüz engellemiştir 4,16. Genel olarak, daha güçlü ve seçici bileşiklerin tanımlanmasına acil bir ihtiyaç vardır. Genellikle, bileşikler protein fonksiyonunun iyi biyokimyasal inhibitörleridir, ancak hücre bazlı tahlillerdeki etkinlikleri zayıftır. Biyokimyasal yöntemler ve hücre bazlı testler dahil olmak üzere ATG4B aktivitesini izlemek için birden fazla test vardır4. Daha önce 8,17 hücrelerinde ATG4B aktivitesini izlemek için basit, lüminesans tabanlı, yüksek verimli bir test geliştirmiştik. Bu test, hücre dışı ortamda stabil ve aktif olan ve ATG4B proteolitik aktivitesine yanıt olarak hücrelerden indüklenebilir şekilde salınabilen Gaussia princeps'ten (GLUC) bir lusiferaz proteini kullanır18,19.
Bu raportör yapısında dNGLUC, hücrelerin aktin hücre iskeleti ile bağlantılıdır. β-aktin ankrajı ile dNGLUC arasına proteaza özgü bir bağlayıcı eklenebilir ve bu da sekresyonun bağlayıcının bölünmesine bağlı olmasını sağlar. LC3B bölünmesini izleyebilmek için LC3B'nin β-aktin ve dNGLUC arasında tam uzunlukta açık okuma çerçevesinikullandık 17,18,19. dNGLUC'un salgılama mekanizması tam olarak anlaşılamamış olsa da, ATG4B aktivitesini izlemek için spesifiktir, ATG5 nakavt hücrelerinde meydana geldiği gibi genel otofajiye bağlı değildir ve klasik bir sinyal peptidigerektirmeyen geleneksel olmayan mekanizmalar aracılık eder 4,18,19. Bu raporlayıcıyı küçük molekülleri ve siRNA kütüphanelerini taramak için başarıyla kullandık ve Akt protein kinazları8 gibi ATG4B aktivitesinin yeni düzenleyicilerini belirledik. Bu makale, bu lusiferaz raporlayıcının yarı otomatik, yüksek verimli bir tarama formatında kullanımı için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tahlil süreci Şekil 1'de özetlenmiştir. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Retrovirüs üretimi
NOT: ActinLC3dNGLUC'u kodlayan plazmid pMOWS-ActinLC3dNGLUC20'dir. Yüksek titreli virüs üretimi için düşük geçişli hücre sayısı kullanın (ideal olarak P20'den az).
- Dulbecco'nun modifiye kartal ortamındaki (DMEM) kültür HEK293T hücreleri, nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (P / S) ile desteklenmiş, transfeksiyon için tohumlamadan önce% 80 -% 90 birleşene kadar% 5CO2 atmosferi ile.
- Transfeksiyondan bir gün önce, hücreleri 1 × 10 6 hücre / kuyu yoğunluğunda 2 mL / tam büyüme ortamında6 oyuklu bir plakaya tohumlayın. Plakayı gece boyunca% 5CO2 atmosferine sahip nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
NOT: Lipozomal bazlı bir transfeksiyon reaktifi kullanıyorsanız üreticinin talimatlarını izleyin. Bu protokol, lipozomal bazlı olmayan bir reaktifin kullanımını açıklar. Transfeksiyona başlamadan önce, DNA transfeksiyon reaktifinin, DNA'nın ve ortamın oda sıcaklığına (~15 dakika) dengelenmesini bekleyin. - Her transfeksiyon için, 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine 200 μL serumsuz ortam ekleyin. Her tüpe aşağıdaki miktarlarda plazmit ekleyin: 1.000 ng pMOWS-ActinLC3dNGLUC; 900 ng GagPol; 100 ng VSV-G.
NOT: Burada listelenen plazmit miktarı ve ortam hacmi 12 oyuklu bir plaka içindir. Farklı bir plaka tipi kullanıyorsanız, 5 ng/μL transfer plazmidi, 4.5 ng/μL ambalaj plazmidi ve 0.5 ng/μL zarf plazmidinin nihai konsantrasyonuna ulaşmak için ortam hacmini ve plazmit miktarlarını ayarlayın. Gag ve pol eksprese eden genleri içeren herhangi bir ambalaj plazmidini ve VSV-G eksprese eden geni içeren herhangi bir zarf plazmidini kullanın. - DNA transfeksiyon reaktif şişesini 30 saniye boyunca vorteksleyin. Transfeksiyon reaktifinin 4 μL'sini doğrudan seyreltilmiş DNA'yı içeren ortama pipetleyin. Tüpü hafifçe eğerek hafifçe karıştırın.
NOT: Plastik tüplerin duvarlarına uçlarla dokunmayın. Yukarı ve aşağı pipetleme veya girdap yapmayın. - Reaksiyonu oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
- Reaksiyonu inkübe ederken, eski ortamı 6 oyuklu plakadan çıkarın ve 2 mL/kuyucuklu taze serumsuz ortamla değiştirin.
- Her bir transfeksiyon kompleksini her bir kuyucuğa damla damla ekleyin.
- Tüm kuyu yüzeyine eşit dağılım sağlamak için plakayı hafifçe sallayın veya döndürün.
- Plakayı gece boyunca 37 °C'de% 5CO2 atmosferine sahip nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
- 24 saat sonra, eski ortamı taze tam ortamla (2 mL / kuyu) değiştirin ve hücreleri 72 saat boyunca% 5CO2 atmosferi ile nemlendirilmiş inkübatöre geri koyun.
- 72 saat sonra, süpernatanı 50 mL'lik konik bir tüpte hasat edin ve ölü hücreleri ve kalıntıları gidermek için 4 ° C'de 4.000 × g'de 10 dakika santrifüjleyin. Daha fazla saflaştırma için, süpernatanı 0.20 μm'lik bir filtreden geçirmek için 60 mL'lik büyük bir şırınga kullanın. Hemen 300 μL'lik tek kullanımlık alikotlar hazırlayın ve -80 °C'de saklayın.
NOT: Maksimum ürün etkinliğini korumak için donma-çözülme döngüsünden kaçının.
2. Retroviral transdüksiyon
- Hücrelerin transdüksiyonundan bir gün önce, hedef hücreleri orta yoğunlukta (1 × 105 hücre/kuyucukta PANC1) 12 oyuklu bir plakada %10 FBS ve %1 P/S ile desteklenmiş 1 mL/oyuklu ortamda tohumlayın.
NOT: Farklı hücre tipleri farklı bağlanma yeteneklerine sahip olduğundan, en iyi hücre yoğunluğu önceden belirlenmelidir. İdeal olarak, %40-50 birleşme elde etmek için bir hücre yoğunluğu kullanın. - Dondurulmuş retrovirüs alikotlarını -80 °C dondurucudan çıkarın ve her kullanımdan önce buz üzerinde çözdürün.
NOT: Kullanılmayan alikotları tekrar dondurmayın. - 50 mL'lik konik bir tüpte, 8 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyonda viral süpernatan ve polibren karışımı hazırlayın.
NOT: Sonraki hacimler, 500 μL/kuyucuk nihai hacmi içeren 12 oyuklu bir plakanın transdüksiyonu için geçerlidir. Nihai viral süpernatan hacmi, polibren varlığında bir dizi viral dilüsyonun test edilmesiyle tahmin edilebilir. Transgenin istenen ekspresyon seviyelerine ve kullanılan damarın boyutuna bağlı olarak daha yüksek veya daha düşük dilüsyonlar kullanılabilir. - Eski ortamı 12 oyuklu plakadan çıkarın ve her oyuğa 500 μL karışım ekleyin. Hücreleri, %5CO2 atmosferine sahip nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de gece boyunca viral süpernatan ile inkübe edin.
NOT: Seçim için bir kontrol olarak kullanmak üzere tam besiyeri (viral süpernatan yok) olan iki kuyu tutun. - Virüs içeren ortamı taze tam büyüme ortamı (1 mL / kuyu) ile değiştirin. Hücreleri, 48 saat boyunca% 5CO2 atmosferi olan nemlendirilmiş inkübatöre geri yerleştirin.
3. Havuzlanmış nüfus seçimi ve bakımı
- Büyüme ortamını seçim ortamı ile değiştirin (nihai konsantrasyon 1 μg / mL puromisin ile tam büyüme ortamı). Hücrelerin büyümesini izleyin ve seçim ortamını her 2-3 günde bir değiştirin. Birleşme noktasında, 6 oyuklu bir tabağa ve ardından 10 cm çapında bir doku kültürü kabına genişletin.
- Hücreleri, en azından kontrol (dönüştürülmemiş) hücrelerin tamamen ölmesi için gereken süre boyunca seçim ortamında tutun.
NOT: Başarılı sonuçlar için, deneysel projeye başlamadan önce optimal puromisin konsantrasyonlarının belirlenmesi önerilir. Bunun için, 3 ila 10 gün arasında transdüksiyonsuz hücreleri öldürmek için gereken minimum konsantrasyonu belirlemek için bir puromisin öldürme eğrisi oluşturun. - Hücreler seçim ortamında büyüdükten sonra, hücreleri tam büyüme ortamında genişletin ve deneysel proje için stok alikotlarını dondurun.
NOT: Geçiş numarasını kaydedin ve geçiş numaraları beşten yüksek olan donmuş stoklardan havuzlanmış popülasyonlarla çalışmaktan kaçının. Testi gerçekleştirmeden önce mikoplazma kontaminasyonunu düzenli olarak kontrol edin. İdeal olarak, maksimum lusiferaz sinyalini elde etmek için her testten önce taze bir hücre partisi kullanın. - Hücreleri seçim ortamında tutun ve tahlilden bir gün önce istenen yoğunluğa ulaşmak için yeterli hücreyi tohumlayın.
4. Bileşik ekleme
NOT: Selleckchem küçük molekül kütüphanesi, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 10 mM stok konsantrasyonunda elli 96 oyuklu plakada sekiz sıra ve 10 sütun halinde düzenlenmiş yaklaşık 4.000 bileşikten oluşur.
- 30 μL bileşiği, nano ölçekli bir akustik sıvı dağıtıcı ile uyumlu bir kaynak plakasının uygun kuyusuna ekleyin. 384 oyuklu bir polipropilen plaka (384PP plaka) kullanın. Bu plakaları kapalı tutun ve -20 °C'de saklayın.
NOT: Burada açıklanan tarama protokolü, günde toplam 10 test plakası içindir; 24 saatlik bir inkübasyon periyodu ile birlikte son tahlil konsantrasyonu olarak 10 μM'lik sabit bir konsantrasyon kullanıldı. - Bileşik kitaplık plakalarını oda sıcaklığında çözdürün.
NOT: Plakanın tamamen çözüldüğünden ve oda sıcaklığına dengelendiğinden emin olun. Plaka boyunca bir sıcaklık gradyanı, sıvının işlenmesini etkileyebilir. - Nano ölçekli bir akustik sıvı dağıtıcı kullanarak 50 nL / kuyuyu 384 oyuklu bir tahlil plakasına dağıtın.
NOT: Programda seçilen kaynak ve hedef plakaların bu adım için kullanılanlarla eşleştiğinden emin olun. - Elektronik tabloda bir dağıtım programı oluşturun.
- Yazılımı açın.
- Yeni bir protokol açın. Protokol sekmesinden aşağıdaki seçenekleri belirleyin: Numune plakası formatı, 384PP; Numune plakası tipi, 384PP_DMSO2; ve Hedef plaka tipi, CellCarrier-384 Ultra PN (Şekil 2A).
- Seçim Listesi altında, dağıtım programını içeren elektronik tabloyu içe aktarmak için içe aktarma seçeneğini (Şekil 2B) seçin (Şekil 2C).
- Protokolü çalıştır seçeneğini seçin (Şekil 2D), görüntülenen bilgilerin doğru olup olmadığını doğrulayın ve Çalıştır'a tıklayın.
- Çalıştırma durumu (Şekil 2E) adlı yeni pencerede, Başlat'a tıklayın ve istem pencerelerinde görüntülenen adımları izleyin (Şekil 2F,G).
5. Hücre tohumlama
- Hücreleri bir hücre kültürü şişesinden veya hücre kültürü Petri kaplarından tripsinize edin ve FBS içeren ortam ekleyerek tripsini nötralize edin.
- Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 390 × g'da santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı nazikçe çıkarın ve hücre peletini 10 mL tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin.
- Hücre sayımı gerçekleştirin.
- Hücre süspansiyonunu 230 mL tam kültür ortamında 4.6 × 107 hücre ile hazırlayın.
NOT: Bu hacim ve hücre yoğunluğu, 10x 384 oyuklu tahlil plakası artı iki 384 oyuklu plakanın ölü hacmi içindir. - Bölüm 4'te hazırlanan 384 oyuklu bir tahlil plakasının her bir oyuğuna 50 μL hücre süspansiyonu dağıtın.
NOT: Hücre tohumlama, manuel olarak veya toplu dağıtıcı kullanılarak yapılabilir. - Hücreleri, 24 saat boyunca% 5CO2 atmosferine sahip nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
6. Hücresel süpernatantın hasat edilmesi
NOT: Burada kullanılan sıvı işleme robotik platformu, 96 uç için çok kanallı bir kol ile sıvı işleme gerçekleştirir. Sıvı işleme otomasyonu mevcut değilse, protokol çok kanallı pipetler kullanılarak düşük verimli formata uyarlanabilir.
- Laboratuvar otomasyonu iş istasyonunun destesini Şekil 3'te gösterildiği gibi yapılandırın.
- Tek kullanımlık 96 uçlu yığını P1 konumuna yerleştirin (Şekil 3A).
NOT: Her 96 uçlu yığın, sekiz adet tek kullanımlık raftan oluşur. 96 uçlu çok kanallı bir kol kullanıldığında, 384 oyuklu plaka dört çeyreğe bölünür. Bu nedenle, her bir uç yığını, süpernatanı iki tahlil plakasından iki boş, katı siyah, 384 oyuklu plakaya aktarmak için yeterlidir. Her iki plaka çalışmasından sonra tüm uç yığınının değiştirilmesi gerekir. - Tahlil plakalarını P2 ve P4 konumlarına yerleştirin (Şekil 3A).
- Boş, düz siyah, 384 oyuklu plakaları P3 ve P5 konumlarına yerleştirin (Şekil 3A).
NOT: Bu esnek ve yetenekli robotik platform bu test için uyarlanmış ve özel bir program yazılmıştır (Şekil 3B). - P1 konumundan ipuçlarını alın.
- P2 pozisyonundaki plakadan 10 μL süpernatan aspire edin ve P3 pozisyonundaki boş, katı siyah plakaya aktarın.
NOT: Uçlar, kuyu dibindeki hücre tek tabakasını bozmadan süpernatanı aspire etmek için kuyucukların içinde uygun bir derinlikte konumlandırılmalıdır. - Uçları P6 konumuna bırakın (Şekil 3A).
- P2 konumundaki plakanın kalan oyukları için 6.5-6.7 adımlarını tekrarlayın ve ardından süpernatanı P4 konumundan P5 konumuna aktarmak için aynı adımları tekrarlayın.
NOT: Süpernatanı topladığınızdan ve ilgili kuyucuklara boş, katı siyah plakaya dağıttığınızdan emin olun (Şekil 3C,D). Salgılanan dNGLUC, hücre kültürü ortamında çok kararlı olduğundan, plakalar kapatılabilir ve karanlıkta 4 ° C'de 7 güne kadar saklanabilir.
7. Lusiferaz testi
NOT: Raporlayıcıda kullanılan dNGLUC, hızlı sinyal bozulması ile flaş kinetiği sergiler. Alt tabaka (coelenterazine) eklendikten sonra lüminesansın hızlı bir şekilde bozulması nedeniyle, plaka okuyucu süpernatantlardaki lüminesans sinyalini ölçecek şekilde ayarlanmalıdır; Alt tabakayı bir kuyuya enjekte edin ve birkaç saniye sonra o kuyuyu okuyun. Bu nedenle, enjeksiyon ve okuma adımları arasındaki sürenin tüm numuneler için aynı olmasını sağlamak için lüminesansı izleyebilen ve bir alt tabaka enjektörü ile donatılmış bir plaka okuyucu kullanın. Plaka okuyucuda kullanılan ayarlar Şekil 4'te bulunabilir.
- Asitlendirilmiş metanol (10 μL 3 M HCl ila 1 mL metanol) içinde 1 mg/mL stok çözeltisi olarak doğal coelenterazine hazırlayın.
NOT: Laboratuvarda metanolün işlenmesiyle ilgili yerel sağlık ve güvenlik yönergelerine uyun ve cilt ile temasından kaçının. Tahlil başlamadan önce taze çalışma substratı çözeltisini hazırlayın. - Enjektör pompasını çalıştırın (Şekil 5A).
- Hortumu deiyonize suyla durulayın (Şekil 5B-D).
- Boruyu metanol ile durulayın.
- Boruyu durularken, substratı 1:100 oranında seyrelterek çalışma substratı çözeltisini hazırlayın (384 oyuklu bir plaka için, substrat stok çözeltisinden 220 μL'yi 21.8 mL 1x fosfat tamponlu salin [PBS]'ye ekleyin).
- Boruyu alt tabaka çalışma solüsyonu ile durulayın (Şekil 5B-D).
- Plakayı okuyucuya yükleyin ve Şekil 4'te açıklanan ayarları kullanarak ölçümü başlatın.
- Tüm tahlil plakaları için 7.6-7.7 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Tüm tahlil plakaları ile işiniz bittiğinde, boruyu metanol ile durulayın.
- Hortumu deiyonize suyla durulayın.
NOT: Bu adımın sonunda, hücresel ATG4B aktivitesine karşılık gelen ham lusiferaz değerleri elde edilir. Hücre sayılarının normalizasyonu için, floresan mikroskobu ile her bir oyuktaki hücre sayısını sayarak sonraki adımlar gereklidir.
8. Hücre fiksasyonu ve boyama
NOT: Bu adım, çok kanallı bir pipet yardımıyla veya bir yığın dağıtıcı kullanılarak manuel olarak gerçekleştirilebilir.
- Hücreleri 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (1x PBS'de) ile sabitleyin.
NOT: Laboratuvarda paraformaldehitin kullanımıyla ilgili yerel sağlık ve güvenlik yönergelerine uyun ve cilt ile temasından kaçının. Mümkünse bu adımı bir güvenlik başlığında gerçekleştirin. - 1x PBS ile üç kez yıkayın.
- Çekirdekleri Hoechst 33342 ile 15x PBS'de 1: 5.000 seyreltilmiş olarak boyayın.
- 1x PBS ile üç kez yıkayın.
9. Görüntü edinme
NOT: Otomatik bir mikroskop kullanarak görüntü alımı gerçekleştirin. Hücre sayısını belirlemek için görüntü elde etmeye alternatif olarak, hücre içi lusiferaz aktivitesi de belirlenebilir. Aşağıda tartışılan hücre sayılarına veya hücre içi lusiferaz aktivitesine normalleşip normalleşmediği konusunda avantajlar ve dezavantajlar vardır. Hücre sayılarını belirlemenin daha az invaziv olduğunu ve hücre içi lusiferaz değerlerini belirlemekten daha düşük değişkenlikle sonuçlandığını bulduk.
- Mikroskop işletim yazılımını başlatın (Şekil 6).
- Kurulum sekmesinde, önceden tanımlanmış doğru plaka tipini seçin. Plaka tipi önceden ayarlanmamışsa, plaka boyutlarını manuel olarak girin.
- Çıkar ve Yükle seçeneğine tıklayarak plakayı mikroskoba yükleyin.
- Ardından, 20x Air (sayısal açıklık [NA]: 0,4) hedefini seçin.
NOT: Farklı plaka türlerinde doğru odaklanmaya izin verecek şekilde objektif bileziğinin doğru değere ayarlandığından emin olun. - Kanal Seçimi altında, Hoechst 33342'yi seçin.
NOT: Zaman, güç ve yükseklik için kanal ayarları, kullanılan plaka tipine göre optimize edilmelidir. - Düzeni Tanımla'da, plakadan tüm kuyucukları ve kuyudan dört alanı seçin.
- Çevrimiçi İşler'de, verileri analiz yazılımına aktarmak için ilgili klasörü seçin.
10. Görüntü analizi
NOT: Elde edilen görüntülerden hücre çekirdeklerini segmentlere ayırmak ve saymak için herhangi bir görüntü analiz yazılımı kullanılabilir. Burada, birden fazla otomatik mikroskop dosyasıyla uyumlu belirli bir çevrimiçi yazılımı kullanma adımlarını açıklıyoruz.
- Görüntü analizi yazılımını başlatın.
- Görüntü segmentasyonunu başlatmak için Görüntü Analizi sekmesine gidin (Şekil 7A).
- Giriş Görüntüsü sekmesinde, yeni bir yapı taşı eklemek için + işaretine tıklayın (Şekil 7A).
- Listeden Çekirdek Bul seçeneğini seçin (Şekil 7A) ve kanal seçeneği olarak Hoechst 33342'yi seçin (Şekil 7B).
- Görüntüdeki bölümlere ayrılmış nesneleri görsel olarak inceleyin ve en doğru bölümleme yöntemini seçin.
NOT: Bu deney için C yöntemini kullandık (Şekil 7C). Her yöntem seçeneğinin, mümkün olan en iyi segmentasyonu elde etmek için ayarlanabilen alt kategorileri vardır. - Ardından, Sonuçları Tanımla sekmesine tıklayın (Şekil 7C) ve Yöntem seçeneği olarak Standart Çıktı'yı seçin.
- Alt kategoriden, Nesnelerin çekirdek sayısı ve Nesne sayısı'nı seçin (Şekil 7C).
- Analizi Diske Kaydet veya Analizi Veritabanına Kaydet seçeneğini kullanarak analiz işlem hattını kaydedin.
- Toplu Analiz sekmesi altında, ağaçtan analiz edilecek verileri seçin.
- Yöntem'in altında, adım 10.8'de kaydedilen analiz işlem hattını seçin.
NOT: Başvurulan yazılımın dışından bir komut dosyası yüklemek veya veritabanına kaydedilmiş mevcut bir analizi yüklemek de mümkündür. - Analizi başlatmak için Analizi Çalıştır'a tıklayın (Şekil 7D). Bu iş akışının sonunda iki veri kümesi oluşturulur: süpernatantlardan gelen ham lusiferaz değerleri ve her bir oyuktaki hücre sayısı. Hücre başına lusiferaz değerini normalleştirmek için her ikisini de kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Önceki bir yayında8, bu testi küçük molekül ve siRNA kütüphanelerini taramak için başarıyla kullandık ve ATG4B'nin yeni düzenleyicilerini tanımladık. Burada, bu lusiferaz raporlayıcının protokolünü ve temsili sonuçlarını yarı otomatik, yüksek verimli bir tarama formatında açıklıyoruz. Şekil 8 , hem hücre çekirdeği hem de lüminesans için ham veri analizinin bir örneğini göstermektedir. Lüminesans ölçümünün tipik bir sonucu Şekil 8A'da gösterilmektedir. DMSO'dan gelen bazal lüminesans sinyali sütun 1'de ve sütun 24'te 10 μM ATG4B inhibitörü FMK9A varlığında görülebilir. Aynı plakadan elde edilen çekirdek sayımı sonucu Şekil 8B'de görülebilir. Her bileşik için ham değerler, ATG4B aktivitesi ve hücre sağkalımı yüzdesini elde etmek için nötr kontrol ortalama değerlerine normalleştirildi (Şekil 9A, B). Beklendiği gibi, çoğu bileşiğin, negatif kontrolden bazal lüminesansa yakın değerlerle gösterildiği gibi ATG4B aktivitesi üzerinde hiçbir etkisi olmamıştır (DMSO - sütun 1). Yüksek verimli tarama için bir kalite indeksi olan Z' faktörü, denklem (1) kullanılarak hesaplanmıştır:
Z' = 1 - (3 × 
) (1)
STDpos pozitif kontrolün standart sapması (FMK9a), STDneg negatif kontrolün (DMSO) standart sapması, AVGpos pozitif kontrolün ortalaması ve AVGneg negatif kontrolün ortalamasıdır.
İsabetleri seçmek için, ATG4B inhibitörlerinin tanımlanması için bir kesme değeri olarak kullanılacak bir oranı hesaplamak için normalleştirilmiş değerleri kullandık. Oran, her bir bileşiğin ATG4B aktivitesinin hücre canlılığına bölünmesiyle hesaplandı. >1 oranlarının olası ATG4B aktivatörlerini ve <1 oranlarının olası ATG4B inhibitörlerini gösterdiğini düşündük (Şekil 9C). Pozitif kontrol FMK9A'ya benzer oran değerlerine sahip tüm bileşikleri seçtik ve sitotoksik olan bileşikleri hariç tuttuk.
Bu ekranda, aktivitelerini ve toksisitelerini doğrulamak ve değerlendirmek için 53 ATG4B inhibitörünü seçtik. Bileşikler, 100 μM ila 195 nM arasında değişen iki katlı seyreltmeler olarak 10 konsantrasyonda test edildi. Konsantrasyon tepkisi şeklinde muamele edilen hücreler, niceliksel verilerin sığdırılmasını ve EC50 değerlerinin hesaplanmasını sağladı. İnhibitörlerin nispi toksisitesi, hücre canlılık verileri ile ölçüldü. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar bu yaklaşımın ATG4B modülatörlerinin tanımlanmasını sağladığını göstermiştir.
Şekil 1: Test iş akışı. Deney, kararlı hücre hattı üretimi, bileşik tarama, lusiferaz ölçümü, görüntü elde etme ve veri analizi ile başlayarak kararlı hücre hattı üretimi ve yüksek verimli bir tahlil iş akışı için zaman çizelgesini detaylandırıyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sıvı işleyici kurulumu için adım adım talimatlar . (A) Protokol sekmesi ayarları. (1) Numune plakası formatını ve türünü seçin. (2) Hedef plaka tipini seçin. (B) Seçim Listesi sekmesi. (1) Elektronik tabloyu içe aktarmak için içe aktarma seçeneğini kullanın. (C) Seçim Listesini İçe Aktar istem penceresi. (1) İçe aktarılacak parametreleri seçin. (2) tıklayın ithalat sonuçlandırmak için. (D) Çalışan protokol. (1) Çalıştır simgesine tıklayın. (2) Çalıştırma seçeneğini görüntüleyen ve protokol çalışmasını başlatmak için pencereyi isteyin. (E) Durum sekmesini çalıştırın . (1) Protokolü başlatın. (F) Kaynak plakasını yüklemek için istem penceresi. (G) Hedef plakanın yüklenmesi için komut istemi penceresi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sıvı işleme robotunun konfigürasyonu. (A) Tecan güvertesinin konfigürasyonu. (P1) 50 μL tek kullanımlık uç yığını için konum. (P2,P4) Tahlil plakası için pozisyonlar. (P3,P5) Boş, düz siyah, 384 oyuklu plakalar için konumlar. (sayfa 6) Kullanılmış uçları atma pozisyonu. (B) Tahlil senaryosunun ekran görüntüsü. (C) MAC96 aspirat ayrıntılarının ekran görüntüsü. (1) Aspirasyon sıvısı sınıfını seçin. (2) Aspirasyon hacmini yazın. (3) Aspirasyon için kuyu konumlarını seçin. (D) MAC96 dağıtım ayrıntılarının ekran görüntüsü. (1) Dağıtım sıvısı sınıfını seçin. (2) Dağıtım hacmini yazın. (3) Dağıtım için aynı kuyu konumlarını seçin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Lüminesans plaka okuyucu ayarlarının ekran görüntüsü . (A) Ölçüm ayarları sekmesi. (1) Diyaframı seçin. (2) Mesafeyi, zamanı ve düzeltme faktörünü seçin. (B) Protokol genel ayarları. (1) Plaka tipini seçin. (2) Ölçüm modunu seçin. (3) Tahlil plakalarının sayısını seçin. (C) Dağıtım ölçüm ayarları. (1) Ölçümü seçin. (2) Ölçüm süresini ayarlayın. (3) Pompayı, dağıtım hızını ve hacmi seçin. (4) Dağıtım sırasını ve plaka tekrarını tanımlayın. (D) Kuyu seçimi sekmesi. (1) Ölçüm için kuyuları seçin. (2) Ölçüm protokolünü başlatın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Lüminesans plaka okuyucusunun dağıtıcı kontrolünün ekran görüntüsü . (A) Başlatma sekmesi. (1) Pompayı seçin. (2) Pompayı çalıştırın. (B) Durulama protokolü seçeneği. (1) Durulama seçeneğini seçin. (2) Ayarlara gitmek için ileri'ye tıklayın. (C) Durulama sekmesi ayarları seçenekleri. (1) Pompayı seçin. (2) Uç montajını seçin. (3) Sonraki sekmeye geçmek için ileri'ye tıklayın. (D) Durulamayı başlatmak için sekme. (1) Durulama protokolünü başlatmak için başlat'a tıklayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Otomatik yüksek içerikli mikroskop görüntüleme yazılımının ekran görüntüsü. Görüntü alma için kullanılan ayarların ayrıntıları. (1) Kurulum sekmesi. (2) Plaka tipini seçin. (3) Plakayı mikroskoba yüklemek için Çıkar'ı seçin. (4) Reklam verme amacını seçin. (5) Kanalı ekleyin. (6) Columbus yazılımına veri aktarılacak klasörü seçin. (7) Kuyuları seçin. (8) Alanları seçin. (9) Görüntü alımını başlatmak için Denemeyi çalıştır sekmesine tıklayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Çevrimiçi yazılımda görüntü analizi. (A) Görüntü analizi sekmesi. (1) Bir yapı taşı eklemek için + işaretine tıklayın. (2) Çekirdekleri Bul seçeneğini seçin. (B) Çekirdek ayarlarını bulun . (1) Kanalı seçin. (2) Segmentasyon yöntemini seçin. (C) Sonuçları tanımla sekmesi. (1) Standart Çıktı'yı seçin. (2) Sonuç olarak görüntülenecek seçeneği seçin. (D) Görüntü analizi. (1) Toplu Analiz sekmesi. (2) Ölçümü seçin. (3) Analiz yöntemini seçin. (4) Görüntü analizini başlatın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Lusiferaz ölçümlerinden ve çekirdek sayımından temsili görüntüler . (A) Sayılar ve renklerle temsil edilen 384 oyuklu bir tahlil plakasından alınan lusiferaz bağıl yoğunluk değerleri. (B) Görüntü analizi sonuçları. (1) Nesnelerin çekirdek sayısının ısı haritası. (2) Her kuyu için sonuçları gösteren tablo. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Veri normalleştirmesinden sonra temsili sonuçlar . (A) Veri normalizasyonundan sonra, aynı plaka içindeki negatif kontrol (DMSO) kuyularından ortalama ATG4B aktivitesine temsili ATG4B aktivite yüzdesi. Aktivatörler kırmızı ve inhibitörler mavi renkle gösterilir, beyaz aktivitede önemli bir değişiklik olmadığını gösterir. Negatif kontrol (DMSO) sütun 1'de ve pozitif kontrol (FMK9A) sütun 24'te bulunur. (B) Aynı plaka içindeki negatif kontrol (DMSO) kuyularından ortalama hücre sayısına veri normalizasyonundan sonra temsili hücre canlılığı yüzdesi. Proliferasyon yeşil renkle ve toksisite kırmızı renkle gösterilir, sarı hücre canlılığında önemli bir değişiklik olmadığını gösterir. Negatif kontrol (DMSO) sütun 1'de ve pozitif kontrol (FMK9A) sütun 24'te bulunur. (C) Bileşiklerin oran değerine göre dağılımı. Her nokta bir bileşiği temsil eder. Oran, ATG4B aktivitesinin hücre canlılığına bölünmesiyle hesaplandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, ATG4B inhibitörlerinin tanımlanması için hücre bazlı bir raportör gen testini tanımlar. Birincil isabetlerin tanımlanması, β-aktin ve dNGLUC arasında LC3B'nin tam uzunlukta açık okuma çerçevesini eksprese eden hücrelerin işlenmesi üzerine lusiferaz aktivitesine dayanır. Bu testin bazı avantajları, hücreleri parçalamadan dNGLUC'u tespit edebildiği için hassas, oldukça kantitatif ve noninvaziv olmasıdır. Bu makale, kararlı bir hücre hattı ve birincil tarama oluşturmak için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Protokolde birkaç kritik adım var.
İlk olarak, burada açıklanan protokol, yüksek transfeksiyon etkinliği ve yüksek proliferasyon yeteneği sunan PANC1 hücre hattını kullandı. Bu tarama yöntemi diğer hücre hatları kullanılarak gerçekleştirilebilir, ancak transdüksiyon etkinliği bir hücre hattından diğerine değişebilir. İkinci olarak, raportörün ekspresyon seviyeleri zamanla azalabileceğinden, geçiş numaraları beşten yüksek olan donmuş stoklardan elde edilen kararlı hücre popülasyonlarıyla çalışmaktan kaçınılmalıdır. Üçüncüsü, farklı deneylerde maksimum ve tutarlı bir lusiferaz sinyali elde etmek için her testten önce yeni bir hücre partisi kullanmak önemlidir. Dördüncüsü, hücreleri manuel olarak veya bir yığın dağıtıcı kullanarak tohumlarken, plaka boyunca homojen bir hücre yoğunluğu elde etmek için hücre süspansiyonunun sürekli karıştırılması gerekir. Beşincisi, süpernatanı kuyudan toplarken, kuyunun dibindeki hücre tek tabakasını bozmadan süpernatanı aspire etmek için uçların kuyuların içinde uygun bir derinlikte konumlandırılması önemlidir. Son olarak, substrat çalışma çözeltisi tahlil gününde hazırlanmalıdır. Coelenterazine ışığa çok duyarlıdır ve oksidasyona maruz kalır ve hazırlandıktan sonra hızlı substrat bozunmasına dair bazı raporlar vardır.
ATG4B inhibisyonunun veya aktivasyonunun sonucunu araştırmak için bir dizi hücre bazlı tahlil mevcuttur, ancak ATG4B'nin hücresel aktivitesinin incelenmesi sınırlı kalmaktadır4. Bu yöntem noninvazivdir, oldukça hassastır, sağlamdır ve aktivitesi dNGLUC salınımına neden olduğu için doğrudan ATG4B aktivitesine bağlıdır. Açıklanan protokol basittir ve 10x 384 oyuklu plakaları taramak için sadece kısa bir süre gerektirir. Yöntemin bir diğer avantajı, dNGLUC oldukça stabil olduğundan ve serumdan ex vivo olarak ölçülebildiğinden, in vivo olarak ATG4B aktivitesini izlemek için kullanılabilmesidir.
Bu raporlayıcıyı küçük molekül ve siRNA kütüphanelerini taramak ve ATG4B aktivitesinin yeni düzenleyicilerini tanımlamak için başarıyla kullanmış olsak da, bu protokolde dikkate alınması gereken birkaç sınırlama vardır. İlk olarak, tarif edilen hücre bazlı tahlil, ATG4B aktivitesindeki değişiklikleri dolaylı olarak yansıtan ve ATG4B aktivitesinin hem inhibitörlerinin hem de aktivatörlerinin saptanmasını sağlayan bir raportör okumasına dayanır. Bu nedenle, isabetler, özgüllüklerinin ve etkinliklerinin doğrulanması için daha fazla değerlendirmeye tabi tutulmalıdır. Ayrıca, inhibitörler, LC3'ün hücrelerdeki veya diğer otofaji ile ilgili proteinlerin uzamsal dağılımını düzenleme kapasiteleri açısından daha fazla değerlendirilmelidir. İkincisi, bu tahlil, basit kullanımı ve veri analizi nedeniyle daha küçük ölçekli bir tahlile kolayca değiştirilebilse de, substrat ilavesi ve müteakip lüminesans ölçümü için bir dereceye kadar otomasyon gerektirir. Üçüncüsü, dNGLUC salınımının mekanizması moleküler düzeyde tam olarak anlaşılmadığından, salgılama yolunun elementlerine müdahale eden bileşikler sonuçları etkileyebilir. Son olarak, hücre canlılığı, hücre içi lusiferaz aktivitesi ile de belirlenebilir. Hücre sayılarının belirlenmesinin hücre içi lusiferaz değerlerinin belirlenmesinden daha az invaziv olduğunu ve daha düşük değişkenlikle sonuçlandığını bulmamıza rağmen, hücre sayılarının belirlenmesi, görüntüleme ekipmanı, veri analiz yazılımı ve veri depolama açısından zorluklar sundukları için daha küçük araştırma laboratuvarları için kullanımlarını sınırlar. Genel olarak, geliştirilen hücre bazlı raportör gen testi, ATG4B inhibitörlerinin tanımlanmasını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, MRC-UCL Üniversite Birimi Hibe Ref MC_U12266B, MRC Demans Platformu Hibesi İngiltere MR/M02492X/1, Pankreas Kanseri Birleşik Krallık (hibe referansı 2018RIF_15) ve UCL Terapötik Hızlandırma Destek programına yönelik Birleşik Krallık Tıbbi Araştırma Konseyi çekirdek finansmanı tarafından desteklenmiştir, MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054'ün finansmanıyla desteklenmiştir. ActinLC3dNGLUC'u (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) kodlayan plazmit, Dr. Robin Ketteler'den (Berlin Tıp Fakültesi İnsan Tıbbı Bölümü) elde edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
References
- Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
- Fu, Y., et al.
- Towers, C. G., Thorburn, A.
- Agrotis, A., Ketteler, R. On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns. Cells. 9 (1), 53 (2019).
- Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A.
- Kimmelman, A. C., White, E.
- Tran, E., et al. Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).
- Pengo, N., et al. Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148 (2018).
- Kauffman, K. J., et al. Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases. Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).
- Tanida, I., Sou, Y. -S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3. The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).
- Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells. Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).
- Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).
- Ketteler, R., Tooze, S. A.
- Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy. Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).
- Fernández, ÁF., López-Otín, C. The functional and pathologic relevance of autophagy proteases. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).
- Maruyama, T., Noda, N. N. Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition. The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).
- Ketteler, R., Seed, B. Quantitation of autophagy by luciferase release assay. Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).
- Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -W., Seed, B. A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage. Genome Biology. 9 (4), 64 (2008).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15, 14 (2014).
- Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors. Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).
