استخراج الحمض النووي الخالي من الخلايا لعينات الفكاهة الزجاجية والمائية لتشخيص ومراقبة سرطان الغدد الليمفاوية في الشبكية والجسم الزجاجي
Summary
تم إنشاء إجراء لاستخراج الحمض النووي الخالي من الخلايا من الفكاهة الزجاجية والمائية لإجراء دراسات جزيئية لتشخيص سرطان الغدد الليمفاوية في الشبكية والجسم الزجاجي. توفر الطريقة القدرة على استخراج الحمض النووي بشكل متزامن من المكون الخلوي للعينة أو حجزه للاختبار الإضافي.
Abstract
يمثل سرطان الغدد الليمفاوية الشبكية والجسم الزجاجي (VRL) سرطان الغدد الليمفاوية العدواني ، وغالبا ما يصنف على أنه سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية الكبيرة المنتشرة في الجهاز العصبي المركزي الأساسي. لتشخيص VRL ، يتم جمع عينات مثل الفكاهة الزجاجية ، ومؤخرا ، الفكاهة المائية. يشمل الاختبار التشخيصي ل VRL على هذه العينات علم الخلايا وقياس التدفق الخلوي والاختبار الجزيئي. ومع ذلك ، فإن كل من علم الأمراض الخلوي وقياس التدفق الخلوي ، إلى جانب الاختبار الجزيئي باستخدام الحمض النووي الخلوي ، يستلزم خلايا كاملة سليمة. يكمن التحدي في حقيقة أن الفكاهة الزجاجية والمائية عادة ما يكون لها خلوية منخفضة ، ويتم تدمير العديد من الخلايا أثناء الجمع والتخزين والمعالجة. علاوة على ذلك ، تشكل هذه العينات صعوبات إضافية للاختبار الجزيئي بسبب اللزوجة العالية للفكاهة الزجاجية وانخفاض حجم كل من الفكاهة الزجاجية والمائية. تقترح هذه الدراسة طريقة لاستخراج الحمض النووي الخالي من الخلايا من العينات الزجاجية والمائية. يكمل هذا النهج استخراج الحمض النووي الخلوي أو يسمح باستخدام المكون الخلوي لهذه العينات في طرق التشخيص الأخرى ، بما في ذلك علم الخلايا وقياس التدفق الخلوي.
Introduction
سرطان الغدد الليمفاوية الشبكية والجسم الزجاجي (VRL) هو سرطان الغدد الليمفاوية العدواني المرتبط بسرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية الكبيرة المنتشرة في الجهاز العصبي المركزيالأولي 1،2،3. عادة ما يكون VRL قاتلا بسبب تورطه في الجهاز العصبي المركزي 1,2. على الرغم من ندرته1,4 ، إلا أن VRL غالبا ما يظهر بأعراض مشابهة لالتهاب القزحية الخلفي وأمراض الشبكية والجسم الزجاجي الأخرى 4,5. وبالتالي ، فإن المرضى الذين تظهر عليهم أعراض التهاب القزحية يحتاجون إلى تشخيص إما لتأكيد أو استبعاد VRL.
في الآونة الأخيرة ، تم نشر معايير الإجماع لتشخيص VRL ، والتي تنطوي على مزيج من الفحص السريري والنتائج المختبرية6. تشمل العينات المستخدمة عادة لتشخيص VRL الفكاهة الزجاجية ، ومؤخرا ، الفكاهة المائية7. يتم الحصول على الفكاهة الزجاجية من خلال إجراء جراحي يسمى pars plana vitrectomy ، والذي يسمح بالوصول إلى الجزء الخلفي من العين8.
في البروتوكول المقدم ، تم جمع كل من عينات الفكاهة المائية والخلط الزجاجي لاستخراج الخلايا و cfDNA. بعد تخدير المرضى ووضع المبازل على بعد حوالي 4 مم من ليمبوس القرنية ، تم الحصول على عينة من الخلط المائي من حوالي 100-200 ميكرولتر باستخدام حقنة 1 مل من السل في ليمبوس القرنية. بالنسبة للمرضى الكاذبين ، تم الحصول على الجسم الزجاجي غير المخفف عن طريق إدخال الهواء المعقم في التسريب ، مما يتيح جمع كمية أكبر من الجسم الزجاجي غير المخفف (حتى 3.5 مل). في المرضى الذين يعانون من phakic ، تمت إزالة ما يقرب من 500 إلى 1000 ميكرولتر من الجسم الزجاجي غير المخفف قبل تشغيل ضخ محلول الملح المتوازن. في بعض الحالات ، تم جمع الجسم الزجاجي المخفف بشكل ثانوي (500 إلى 2000 ميكرولتر) عن طريق تحويل التسريب إلى سائل ووضع الزجاجي داخل التنورة الزجاجية للحصول على هذه العينة. تم جمع الجزء الزجاجي الأكثر تخفيفا عن طريق الحفاظ على كيس الكاسيت (الشكل التكميلي 1) في نهاية الجراحة. بمجرد وصول هذه الحقيبة إلى قسم علم الأمراض ، تم الحصول على الجسم الزجاجي المخفف من تصريف السوائل من هذا الكيس إلى أنابيب مخروطية لاستخراج الحمض النووي لاحقا.
غالبا ما يعتبر علم الأمراض الخلوي للسائل الزجاجي المعيار الذهبي9. ومع ذلك ، فقد أظهرت العديد من الدراسات حساسية محدودة بسبب المعالجة والحد الأدنى من الخلوية10،11،12. يمكن أن يساعد قياس التدفق الخلوي في تحديد الخلايا البائية النسيلية ولكن يمكن أيضا أن يكون محدودا بسبب انخفاض الخلوية وهشاشة خلايا سرطان الغدد الليمفاوية الكبيرة13،14،15. يتطلب كل من علم الأمراض الخلوي وقياس التدفق الخلوي خلايا كاملة سليمة. يتم تدمير العديد من هذه الخلايا أثناء الجمع والتخزين والمعالجة. عندما يتم إجراء الاختبار الجزيئي باستخدام الحمض النووي المستخرج من الخلايا السليمة (الحمض النووي الخلوي) ، فإنه يعاني من نفس القيد. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تقسيم العينة الزجاجية المحدودة لجميع هذه الاختبارات يقلل من كمية المواد المتاحة لكل اختبار.
يمثل الحمض النووي الخالي من الخلايا (cfDNA) مصدرا آخر للحمض النووي لا يتطلب خلايا سليمة. تم استخدام cfDNA من العينات الزجاجية للكشف عن VRL 16,17 وكذلك سرطان الجلد العنبي18. في هذا البروتوكول ، يتم استخراج الحمض النووي الخلوي والخالي من الخلايا من السائل الزجاجي والمائي للكشف عن VRL.
Protocol
Representative Results
Discussion
سرطان الغدد الليمفاوية الشبكية والجسم الزجاجي (VRL) هو سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية الكبيرةالعدوانية 1،2،3 التي يمكن أن تحاكي أعراضها أمراض الشبكية والجسم الزجاجي الأخرى 4,5. أصبح الاختبار الجزيئي …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان لتيموثي دانيلز ، MLS (ASCP) ، MB ، QLS ، وهيلموت ويجلين ، MLS (ASCP) دور فعال في إنشاء طريقة الاستخراج هذه داخل مختبرنا.
Materials
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrator-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene Cell Lysis Solution | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene DNA Hydration Solution | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Urine Kit | Zymo Research | D3061 | Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns |
| Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
Riferimenti
- Chan, C. C., et al. Primary vitreoretinal lymphoma: a report from an International Primary Central Nervous System Lymphoma Collaborative Group symposium. Oncologist. 16 (11), 1589-1599 (2011).
- Sagoo, M. S., et al. Primary intraocular lymphomas. Clinical & Experimental Ophthalmology. 59 (5), 503-516 (2014).
- Coupland, S. E., Damato, B. Understanding intraocular lymphomas. Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (6), 564-578 (2008).
- Cassoux, N., et al. Ocular and central nervous system lymphoma: clinical features and diagnosis. Ocular Immunology and Inflammation. 8 (4), 243-250 (2000).
- Read, R. W., Zamir, E., Rao, N. A. Neoplastic masquerade syndrome. Survey Ophthalmology. 47, 81-124 (2002).
- Carbonell, D., et al. Consensus recommendations for the diagnosis of vitreoretinal lymphoma. Ocular Immunology and Inflammation. 23 (3), 507-520 (2021).
- Demirci, H., et al. Aqueous humor-derived MYD88 L265P mutation analysis in vitreoretinal lymphoma: a potential less invasive method for diagnosis and treatment response assessment. Ophthalmology Retina. 7 (2), 189-195 (2023).
- Machemer, R., Buettner, H., Norton, E. W., Parel, J. M. Vitrectomy: a pars plana approach. Transactions – American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1971).
- Vogel, M. H., Font, R. L., Zimmerman, L. E., Levine, R. A. Reticulum cell sarcoma of the retina and uvea. Report of sex cases and review of the literature. American Journal of Ophthalmology. 66 (2), 205-215 (1968).
- Kimura, K., Usui, Y., Goto, H. Japanese intraocular lymphoma study group. clinical features and diagnostic significance of the intraocular fluid of 217 patients with intraocular lymphoma. Japanese Journal of Ophthalmology. 56 (4), 383-389 (2012).
- Davis, J. L., Miller, D. M., Ruiz, P. Diagnostic testing of vitrectomy specimens. American Journal of Ophthalmology. 140 (5), 822-829 (2005).
- Char, D. H., Ljung, B. M., Miller, T., Phillips, T. Primary intraocular lymphoma (ocular reticulum cell sarcoma) diagnosis and management. Ophthalmology. 95 (5), 625-630 (1988).
- Tanaka, R., et al. More accurate diagnosis of vitreoretinal lymphoma using a combination of diagnostic test results: a prospective observational study. Ocular Immunology and Inflammation. 30 (6), 1354-1360 (2022).
- Missotten, T., et al. Multicolor flow cytometric immunophenotyping is a valuable tool for detection of intraocular lymphoma. Ophthalmology. 120 (5), 991-996 (2013).
- Bertram, H. C., Check, I. J., Milano, M. A. Immunophenotyping large B-cell lymphomas. Flow cytometric pitfalls and pathologic correlation. American Journal of Clinical Pathology. 116 (2), 191-203 (2001).
- Bonzheim, I., et al. The molecular hallmarks of primary and secondary vitreoretinal lymphoma. Blood Advances. 6 (5), 1598-1607 (2022).
- Shi, H., et al. Clinical relevance of the high prevalence of MYD88 L265P mutated vitreoretinal lymphoma identified by droplet digital polymerase chain reaction. Ocular Immunology and Inflammation. 29 (3), 448-455 (2021).
- Bustamante, P., et al. Circulating tumor DNA tracking through driver mutations as a liquid biopsy-based marker for uveal melanoma. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 40 (1), 196 (2021).
