Vitreoretinal Lenfoma Tanı ve İzlemi için Vitreus ve Sulu Mizah Örneklerinin Hücresiz DNA Ekstraksiyonu
Summary
Vitreoretinal lenfoma teşhisi için moleküler çalışmalar yapmak üzere vitreus ve sulu mizahtan hücresiz DNA ekstrakte etmek için bir prosedür burada oluşturulmuştur. Yöntem, numunenin hücresel bileşeninden DNA’yı eşzamanlı olarak çıkarma veya yardımcı test için ayırma yeteneği sunar.
Abstract
Vitreoretinal lenfoma (VRL), sıklıkla primer santral sinir sistemi diffüz büyük B hücreli lenfoma olarak sınıflandırılan agresif bir lenfomayı temsil eder. VRL’yi teşhis etmek için vitreus mizahı ve daha yakın zamanda sulu mizah gibi örnekler toplanır. Bu örneklerde VRL için tanı testleri sitoloji, akış sitometrisi ve moleküler testleri içerir. Bununla birlikte, hem sitopatoloji hem de akış sitometrisi, hücresel DNA kullanılarak yapılan moleküler testlerle birlikte, sağlam bütün hücreler gerektirir. Buradaki zorluk, camsı ve sulu mizahın tipik olarak düşük hücreselliğe sahip olması ve toplama, depolama ve işleme sırasında birçok hücrenin tahrip olması gerçeğinde yatmaktadır. Ayrıca, bu numuneler, vitreus mizahının yüksek viskozitesi ve hem vitreus hem de sulu mizahın düşük hacmi nedeniyle moleküler testler için ek zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bu çalışma, camsı ve sulu örneklerden hücresiz DNA’nın ekstraksiyonu için bir yöntem önermektedir. Bu yaklaşım, hücresel DNA’nın ekstraksiyonunu tamamlar veya bu örneklerin hücresel bileşeninin sitoloji ve akış sitometrisi dahil olmak üzere diğer tanı yöntemleri için kullanılmasına izin verir.
Introduction
Vitreoretinal lenfoma (VRL), primer santral sinir sistemi diffüz büyük B hücreli lenfoma 1,2,3 ile ilişkili agresif bir lenfomadır. VRL, merkezi sinir sisteminekatılımı nedeniyle tipik olarak ölümcüldür 1,2. Nadir görülmeklebirlikte 1,4, VRL sıklıkla posterior üveit ve diğer vitreoretinal hastalıklara benzer semptomlarla kendini gösterir 4,5. Sonuç olarak, üveit semptomları sergileyen hastalar, VRL’yi doğrulamak veya ekarte etmek için bir tanıya ihtiyaç duyarlar.
Son zamanlarda, klinik muayene ve laboratuvar bulgularının bir kombinasyonunu içeren VRL tanısı için konsensüs kriterleri yayınlanmıştır6. VRL’yi teşhis etmek için yaygın olarak kullanılan örnekler arasında vitreus mizahı ve daha yakın zamanda sulu mizah7 bulunur. Vitreus mizahı, pars plana vitrektomi adı verilen ve gözün arka segmentine erişim sağlayan cerrahi bir prosedürle elde edilir8.
Sunulan protokolde, hücresel ve cfDNA ekstraksiyonu için hem sulu mizah hem de vitreus mizah örnekleri toplandı. Hastalar uyuşturulduktan ve kornea limbusundan yaklaşık 4 mm uzağa trokarlar yerleştirildikten sonra, kornea limpusuna 1 mL tüberkülin şırıngası kullanılarak yaklaşık 100-200 μL’lik sulu mizah örneği elde edildi. Psödofakik hastalar için, infüzyona steril hava verilerek seyreltilmemiş vitreus elde edildi ve daha fazla miktarda seyreltilmemiş vitreus (3.5 mL’ye kadar) toplandı. Fakik hastalarda, dengeli tuz çözeltisi infüzyonu açılmadan önce yaklaşık 500 ila 1000 μL seyreltilmemiş vitreus çıkarıldı. Bazı durumlarda, infüzyonu sıvıya çevirerek ve bu numuneyi elde etmek için vitrektörü vitreus eteğine yerleştirerek ikincil olarak seyreltilmiş vitreus (500 ila 2.000 μL) toplandı. En seyrek vitreus fraksiyonu ameliyat sonunda kaset torbası korunarak toplandı (Ek Şekil 1). Bu torba patoloji bölümüne ulaştığında, daha sonra DNA ekstraksiyonu için bu torbadan sıvının konik tüplere boşaltılmasından seyreltik vitreus elde edildi.
Vitreus sıvısının sitopatolojisi genellikle altın standart olarak kabul edilir9. Bununla birlikte, birkaç çalışma, işleme ve minimum hücresellik nedeniyle sınırlı hassasiyet göstermiştir10,11,12. Akış sitometrisi, klonal B hücrelerinin tanımlanmasına yardımcı olabilir, ancak aynı zamanda düşük hücresellik ve büyük lenfoma hücrelerinin kırılganlığı ile de sınırlandırılabilir13,14,15. Hem sitopatoloji hem de akış sitometrisi, sağlam tüm hücreler gerektirir. Bu hücrelerin çoğu toplama, depolama ve işleme sırasında yok edilir. Moleküler test, bozulmamış hücrelerden (hücresel DNA) ekstrakte edilen DNA kullanılarak yapıldığında, aynı sınırlamadan muzdariptir. Ek olarak, tüm bu testler için sınırlı vitreus örneğinin bölünmesi, her test için mevcut malzeme miktarını azaltır.
Hücresiz DNA (cfDNA), bozulmamış hücrelere ihtiyaç duymayan başka bir DNA kaynağını temsil eder. Vitreus örneklerinden alınan cfDNA, VRL 16,17 ve uveal melanom 18’in tespiti için kullanılmıştır. Bu protokolde, VRL’yi tespit etmek için vitröz ve sulu sıvıdan hücresel ve hücresiz DNA ekstrakte edilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vitreoretinal lenfoma (VRL), semptomları diğer vitreoretinal hastalıkları taklit edebilen agresif büyük bir B hücreli lenfomadır1,2,3 4,5. Vitreusun ve daha yakın zamanda aköz mizahın moleküler testi, VRL tanısı koymak veya ekarte etmek için kritik bir yöntem haline gelmiştir. Bununla birlikte, bu sıvılar hacim olarak çok düşüktür ve genellikle d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Timothy Daniels, MLS (ASCP), MB, QLS ve Helmut Weigelin, MLS (ASCP) laboratuvarımızda bu ekstraksiyon yönteminin kurulmasında etkili oldular.
Materials
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrator-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene Cell Lysis Solution | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene DNA Hydration Solution | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Urine Kit | Zymo Research | D3061 | Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns |
| Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
Riferimenti
- Chan, C. C., et al. Primary vitreoretinal lymphoma: a report from an International Primary Central Nervous System Lymphoma Collaborative Group symposium. Oncologist. 16 (11), 1589-1599 (2011).
- Sagoo, M. S., et al. Primary intraocular lymphomas. Clinical & Experimental Ophthalmology. 59 (5), 503-516 (2014).
- Coupland, S. E., Damato, B. Understanding intraocular lymphomas. Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (6), 564-578 (2008).
- Cassoux, N., et al. Ocular and central nervous system lymphoma: clinical features and diagnosis. Ocular Immunology and Inflammation. 8 (4), 243-250 (2000).
- Read, R. W., Zamir, E., Rao, N. A. Neoplastic masquerade syndrome. Survey Ophthalmology. 47, 81-124 (2002).
- Carbonell, D., et al. Consensus recommendations for the diagnosis of vitreoretinal lymphoma. Ocular Immunology and Inflammation. 23 (3), 507-520 (2021).
- Demirci, H., et al. Aqueous humor-derived MYD88 L265P mutation analysis in vitreoretinal lymphoma: a potential less invasive method for diagnosis and treatment response assessment. Ophthalmology Retina. 7 (2), 189-195 (2023).
- Machemer, R., Buettner, H., Norton, E. W., Parel, J. M. Vitrectomy: a pars plana approach. Transactions – American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1971).
- Vogel, M. H., Font, R. L., Zimmerman, L. E., Levine, R. A. Reticulum cell sarcoma of the retina and uvea. Report of sex cases and review of the literature. American Journal of Ophthalmology. 66 (2), 205-215 (1968).
- Kimura, K., Usui, Y., Goto, H. Japanese intraocular lymphoma study group. clinical features and diagnostic significance of the intraocular fluid of 217 patients with intraocular lymphoma. Japanese Journal of Ophthalmology. 56 (4), 383-389 (2012).
- Davis, J. L., Miller, D. M., Ruiz, P. Diagnostic testing of vitrectomy specimens. American Journal of Ophthalmology. 140 (5), 822-829 (2005).
- Char, D. H., Ljung, B. M., Miller, T., Phillips, T. Primary intraocular lymphoma (ocular reticulum cell sarcoma) diagnosis and management. Ophthalmology. 95 (5), 625-630 (1988).
- Tanaka, R., et al. More accurate diagnosis of vitreoretinal lymphoma using a combination of diagnostic test results: a prospective observational study. Ocular Immunology and Inflammation. 30 (6), 1354-1360 (2022).
- Missotten, T., et al. Multicolor flow cytometric immunophenotyping is a valuable tool for detection of intraocular lymphoma. Ophthalmology. 120 (5), 991-996 (2013).
- Bertram, H. C., Check, I. J., Milano, M. A. Immunophenotyping large B-cell lymphomas. Flow cytometric pitfalls and pathologic correlation. American Journal of Clinical Pathology. 116 (2), 191-203 (2001).
- Bonzheim, I., et al. The molecular hallmarks of primary and secondary vitreoretinal lymphoma. Blood Advances. 6 (5), 1598-1607 (2022).
- Shi, H., et al. Clinical relevance of the high prevalence of MYD88 L265P mutated vitreoretinal lymphoma identified by droplet digital polymerase chain reaction. Ocular Immunology and Inflammation. 29 (3), 448-455 (2021).
- Bustamante, P., et al. Circulating tumor DNA tracking through driver mutations as a liquid biopsy-based marker for uveal melanoma. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 40 (1), 196 (2021).
