Zellfreie DNA-Extraktion von Glaskörper- und Kammerwasserproben zur Diagnose und Überwachung des vitreoretinalen Lymphoms
Summary
Hier wird ein Verfahren zur Extraktion zellfreier DNA aus Glaskörper und Kammerwasser etabliert, um molekulare Studien zur Diagnose des vitreoretinalen Lymphoms durchzuführen. Die Methode bietet die Möglichkeit, gleichzeitig DNA aus der zellulären Komponente der Probe zu extrahieren oder für zusätzliche Tests zu reservieren.
Abstract
Das vitreoretinale Lymphom (VRL) ist ein aggressives Lymphom, das oft als primäres diffuses großzelliges B-Zell-Lymphom des Zentralnervensystems kategorisiert wird. Um VRL zu diagnostizieren, werden Proben wie Glaskörper und neuerdings auch Kammerwasser gesammelt. Diagnostische Tests auf VRL an diesen Proben umfassen Zytologie, Durchflusszytometrie und molekulare Tests. Sowohl die Zytopathologie als auch die Durchflusszytometrie sowie molekulare Tests mit zellulärer DNA erfordern jedoch intakte ganze Zellen. Die Herausforderung liegt in der Tatsache, dass Glaskörper und Kammerwasser typischerweise eine geringe Zellularität aufweisen und viele Zellen während der Sammlung, Lagerung und Verarbeitung zerstört werden. Darüber hinaus stellen diese Proben aufgrund der hohen Viskosität des Glaskörpers und des geringen Volumens sowohl des Glaskörpers als auch des Kammerwassers zusätzliche Schwierigkeiten für die molekulare Untersuchung dar. In dieser Studie wird eine Methode zur Extraktion zellfreier DNA aus glasartigen und wässrigen Proben vorgeschlagen. Dieser Ansatz ergänzt die Extraktion zellulärer DNA oder ermöglicht es, die zelluläre Komponente dieser Proben für andere diagnostische Methoden, einschließlich Zytologie und Durchflusszytometrie, zu nutzen.
Introduction
Das vitreoretinale Lymphom (VRL) ist ein aggressives Lymphom, das mit einem diffusen großzelligen B-Zell-Lymphom des primären Zentralnervensystems assoziiertist 1,2,3. VRL verläuft aufgrund ihrer Beteiligung am zentralen Nervensystem in der Regel tödlich 1,2. Obwohl selten1,4, zeigt sich VRL häufig mit Symptomen, die der posterioren Uveitis und anderen vitreoretinalen Erkrankungen ähneln 4,5. Folglich benötigen Patienten mit Uveitis-Symptomen eine Diagnose, um eine VRL entweder zu bestätigen oder auszuschließen.
Kürzlich wurden Konsenskriterien für die Diagnose von VRL veröffentlicht, die eine Kombination aus klinischer Untersuchung und Laborbefunden beinhalten6. Zu den Proben, die häufig zur Diagnose von VRL verwendet werden, gehören Glaskörper und in jüngerer Zeit Kammerwasser7. Der Glaskörper wird durch ein chirurgisches Verfahren namens Pars-plana-Vitrektomie gewonnen, das den Zugang zum hinteren Augenabschnitt ermöglicht8.
In dem vorgestellten Protokoll wurden sowohl Kammerwasser- als auch Glaskörperproben für die zelluläre und cfDNA-Extraktion gesammelt. Nach der Anästhesie der Patienten und der Platzierung von Trokaren ca. 4 mm vom Hornhautlimbus entfernt wurde eine Kammerwasserprobe von ca. 100-200 μl mit einer 1-ml-Tuberkulinspritze am Hornhautlimbus entnommen. Bei pseudophaken Patienten wurde unverdünnter Glaskörper durch Zuführen steriler Luft in die Infusion erhalten, wodurch eine größere Menge unverdünnten Glaskörpers (bis zu 3,5 ml) entnommen werden konnte. Bei phaken Patienten wurden etwa 500 bis 1000 μl unverdünnter Glaskörper entfernt, bevor eine Infusion mit ausgewogener Salzlösung eingeschaltet wurde. In einigen Fällen wurde sekundär verdünnter Glaskörper (500 bis 2.000 μl) gesammelt, indem die Infusion auf Flüssigkeit umgestellt und der Vitrektor in den Glaskörperrand gelegt wurde, um diese Probe zu erhalten. Die am stärksten verdünnte Glaskörperfraktion wurde gesammelt, indem der Kassettenbeutel (ergänzende Abbildung 1) am Ende der Operation aufbewahrt wurde. Sobald dieser Beutel die Pathologieabteilung erreichte, wurde verdünnter Glaskörper gewonnen, indem Flüssigkeit aus diesem Beutel in konische Röhrchen für die anschließende DNA-Extraktion abgelassen wurde.
Die Zytopathologie der Glaskörperflüssigkeit wird oft als Goldstandard angesehen9. Mehrere Studien haben jedoch gezeigt, dass die Sensitivität aufgrund der Verarbeitung und der minimalen Zellularität begrenzt ist10,11,12. Die Durchflusszytometrie kann bei der Identifizierung klonaler B-Zellen helfen, kann aber auch durch eine geringe Zellularität und die Fragilität großer Lymphomzellen eingeschränkt sein13,14,15. Sowohl für die Zytopathologie als auch für die Durchflusszytometrie werden intakte ganze Zellen benötigt. Viele dieser Zellen werden bei der Sammlung, Lagerung und Verarbeitung zerstört. Wenn molekulare Tests mit DNA durchgeführt werden, die aus intakten Zellen extrahiert wurde (zelluläre DNA), leiden sie unter derselben Einschränkung. Darüber hinaus reduziert die Teilung der begrenzten Glasprobe für alle diese Tests die Menge an Material, die für jeden Test zur Verfügung steht.
Zellfreie DNA (cfDNA) stellt eine weitere DNA-Quelle dar, die keine intakten Zellen benötigt. cfDNA aus Glaskörperproben wurde für den Nachweis von VRL 16,17 sowie Aderhautmelanom18 verwendet. In diesem Protokoll wird zelluläre und zellfreie DNA aus Glaskörper und wässriger Flüssigkeit extrahiert, um VRL nachzuweisen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vitreoretinale Lymphom (VRL) ist ein aggressives großzelliges B-Zell-Lymphom 1,2,3, dessen Symptome andere vitreoretinale Erkrankungen nachahmen können 4,5. Die molekulare Untersuchung von Glaskörper und in jüngster Zeit auch von Kammerwasser ist zu einer entscheidenden Methode geworden, um die Diagnose einer VRL zu stellen oder auszuschließen. Diese Flüssigkei…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Timothy Daniels, MLS(ASCP), MB, QLS, und Helmut Weigelin, MLS(ASCP) waren maßgeblich an der Etablierung dieser Extraktionsmethode in unserem Labor beteiligt.
Materials
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrator-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene Cell Lysis Solution | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene DNA Hydration Solution | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Urine Kit | Zymo Research | D3061 | Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns |
| Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
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