Summary
Este protocolo describe una plataforma de cultivo celular basada en membranas reconfigurable que integra el formato de pozo abierto con capacidades de flujo de fluidos. Esta plataforma es compatible con los protocolos estándar y permite transiciones reversibles entre los modos de cultivo microfluídico y de pozo abierto, adaptándose a las necesidades de los laboratorios de ingeniería y biociencias.
Abstract
Los sistemas microfisiológicos son plataformas de cultivo celular miniaturizadas que se utilizan para imitar la estructura y la función de los tejidos humanos en un entorno de laboratorio. Sin embargo, estas plataformas no han obtenido una adopción generalizada en los laboratorios de biociencias, donde los enfoques basados en membranas de pozo abierto sirven como el estándar de oro para imitar las barreras tisulares, a pesar de carecer de capacidades de flujo de fluidos. Este problema se puede atribuir principalmente a la incompatibilidad de los sistemas microfisiológicos existentes con los protocolos y herramientas estándar desarrollados para los sistemas de pozos abiertos.
Aquí, presentamos un protocolo para crear una plataforma reconfigurable basada en membranas con una estructura de pozo abierto, capacidad de mejora de flujo y compatibilidad con protocolos convencionales. Este sistema utiliza un enfoque de ensamblaje magnético que permite la conmutación reversible entre los modos de pozo abierto y microfluídico. Con este enfoque, los usuarios tienen la flexibilidad de comenzar un experimento en el formato de pozo abierto utilizando protocolos estándar y agregar o eliminar capacidades de flujo según sea necesario. Para demostrar el uso práctico de este sistema y su compatibilidad con las técnicas estándar, se estableció una monocapa de células endoteliales en un formato de pocillo abierto. El sistema se reconfiguró para introducir el flujo de fluidos y luego se cambió al formato de pozo abierto para realizar la inmunotinción y la extracción de ARN. Debido a su compatibilidad con los protocolos convencionales de pozos abiertos y su capacidad de mejora del flujo, se espera que este diseño reconfigurable sea adoptado tanto por los laboratorios de ingeniería como por los de biociencias.
Introduction
Las barreras vasculares sirven como una interfaz crítica que separa el compartimento sanguíneo del tejido circundante. Desempeñan un papel fundamental en la preservación de la homeostasis al atraer células inmunitarias, controlar la permeabilidad molecular y proteger contra la intrusión de patógenos en el tejido 1,2. Se han desarrollado modelos de cultivo in vitro para imitar el microambiente in vivo, lo que permite realizar investigaciones sistemáticas sobre los factores y condiciones que afectan las propiedades de barrera tanto en estados sanos como enfermos 3,4.
El enfoque más utilizado para estos modelos de cultivo es la configuración de "pozo abierto"5 similar a Transwell, en la que una membrana de cultivo porosa y grabada separa los compartimentos llenos de medios (Figura 1A). En este formato, las células se pueden sembrar a ambos lados de la membrana, y se ha desarrollado una amplia gama de protocolos experimentales. Sin embargo, estos sistemas tienen una capacidad limitada para proporcionar los flujos de fluidos esenciales para apoyar la maduración de la barrera e imitar la circulación de las células inmunitarias observadas in vivo 5,6. En consecuencia, no pueden ser utilizados para estudios que requieran flujos dinámicos que introduzcan dosis de fármacos, estimulación mecánica o tensiones de cizallamiento inducidas por fluidos 6,7,8.
Para superar las limitaciones de los sistemas de pozos abiertos, se han desarrollado plataformas microfluídicas que combinan membranas de cultivo porosas con canales fluídicos direccionables individualmente9. Estas plataformas ofrecen un control preciso sobre el enrutamiento de fluidos, la perfusión y la introducción de compuestos químicos, estimulación de cizallamiento controlada y capacidades de adición celular dinámica 7,10,11,12,13. A pesar de las capacidades avanzadas proporcionadas por las plataformas microfluídicas, no han sido ampliamente adoptadas en los laboratorios de biociencias debido a los complejos protocolos microfluídicos y su incompatibilidad con los flujos de trabajo experimentales establecidos 4,10,14.
Para cerrar la brecha entre estas tecnologías, presentamos un protocolo que emplea un sistema basado en módulos reconfigurable magnéticamente. Este sistema se puede cambiar fácilmente entre los modos de pozo abierto y microfluídico en función de las necesidades específicas del experimento. La plataforma cuenta con un dispositivo de pozo abierto, conocido como m-μSiM (sistema microfisiológico modular habilitado por una membrana de silicio), con una membrana de cultivo de 100 nm de espesor (nanomembrana). Esta nanomembrana posee una alta porosidad (15%) y una transparencia similar a la del vidrio, como se ilustra en la Figura 1B. Separa físicamente el compartimento superior de un canal inferior, lo que permite el transporte molecular a través de escalas de longitud fisiológicas15. A diferencia de las membranas convencionales grabadas con trazas, que tienen desafíos conocidos en la obtención de imágenes de células vivas con imágenes de campo claro, las propiedades ópticas y físicas favorables de la nanomembrana permiten una visualización clara de las células a ambos lados de la superficie de la membrana 15,16,17.
El presente protocolo describe la fabricación de módulos especializados de siembra y flujo y explica la reconfiguración magnética de la plataforma. Demuestra cómo se puede emplear la plataforma para establecer barreras endoteliales tanto en condiciones estáticas como dinámicas. Esta demostración revela que las células endoteliales se alinean a lo largo de la dirección del flujo, con una regulación positiva de las dianas genéticas sensibles al cizallamiento bajo la estimulación del cizallamiento.
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Protocol
Este diseño se puede utilizar en varios modos en función de los requisitos experimentales y las preferencias del usuario final. Antes de cada experimento, consulte el diagrama de flujo de decisión presentado en la Figura 2 para determinar los pasos y módulos necesarios para el protocolo. Por ejemplo, si el usuario tiene la intención de mantener el formato de pocillo abierto a lo largo de un experimento para compararlo directamente con el sistema de tipo Transwell, la galería de símbolos de patrón no es necesaria para la siembra de células. El módulo central está disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales), y la nanomembrana ultrafina se puede seleccionar de una biblioteca de materiales con diferentes porosidad y tamaños de poro para adaptarse a las necesidades experimentales.
1. Fabricación de la plantilla de patrón
NOTA: La plantilla de patrones sirve para colocar las células exclusivamente en la región porosa del chip de membrana, evitando que las células se asienten en la capa de silicio circundante donde podrían experimentar daños después de agregar el módulo de flujo16 (consulte la Figura 3). El daño a la monocapa puede afectar negativamente la integridad de la barrera y comprometer los resultados experimentales. La plantilla no es necesaria en un cultivo abierto y estático, ya que no hay riesgo de daños.
- Compre, mecanize o imprima en 3D un molde utilizando el diseño proporcionado en el Archivo de codificación suplementario 1 (Figura 4A).
NOTA: Las paredes de la galería de símbolos son cónicas para aumentar la capacidad de los medios y minimizar el atrapamiento de burbujas en comparación con las características de paredes rectas de alta relación de aspecto. - Fije una película adhesiva sensible a la presión (PSA) de 130 μm a una lámina acrílica de 3,2 mm con un rodillo frío (consulte la tabla de materiales).
- Corte con láser la lámina acrílica de acuerdo con el diseño proporcionado en el Archivo de codificación suplementario 2 para crear una matriz de cavidades (Figura 4B).
- Retire la capa protectora de la película PSA y adhiera la lámina acrílica al molde.
NOTA: Asegúrese de que la lámina cortada con láser esté alineada con el molde de modo que las características del molde estén centradas dentro de la cavidad (Figura 4C). La precisión del posicionamiento de las células en la membrana depende de este paso. - Mezcle bien el prepolímero PDMS (usando una proporción de base a catalizador de 10:1) (consulte la Tabla de materiales) y desgasifique en una cámara de vacío hasta que no queden burbujas visibles (5-15 min).
- Vierta lentamente el PDMS en las cavidades del molde, nivelándolo con un borde plano.
NOTA: Para evitar que las burbujas queden atrapadas, vierta el PDMS en cada cavidad lentamente. Si hay burbujas después de verter, coloque el molde en la cámara de vacío y desgasifique nuevamente. - Cura el PDMS en una placa calefactora a 70 °C durante 1 h y, a continuación, deja que se enfríe a temperatura ambiente.
- Extrae las plantillas de las cavidades del molde con unas pinzas de punta plana.
2. Fabricación del módulo de flujo
NOTA: El módulo de flujo comparte una huella similar con el pozo en forma de trébol del módulo central e incluye un microcanal moldeado (ancho = 1,5 mm, alto = 0,2 mm, largo = 5 mm). La forma de trébol ayuda a alinear el canal sobre la región de cultivo porosa (Figura 5).
- Utilice las técnicas estándar de litografía blanda18 para crear un molde de silicio con características definidas por el diseño proporcionado en el Archivo de codificación suplementario 3 (Figura 4D).
- Coloque una película de PSA de 130 μm en una lámina acrílica de 3,2 mm de grosor.
- Corte con láser la lámina acrílica según el diseño dado en el Archivo de codificación suplementario 4 para crear una matriz de cavidades en forma de trébol (Figura 4E).
NOTA: La altura de la cavidad determina la altura del módulo de flujo, que debe ser ligeramente más alta (0-0,1 mm) que la altura del pozo del módulo central para garantizar un sellado adecuado. - Retire la capa protectora de la película PSA y luego adhiera la lámina cortada con láser al molde de silicona alineando las marcas de alineación triangulares en el molde de silicona con las de la lámina cortada con láser.
NOTA: Al igual que en el paso 1.4, asegúrese de que la lámina acrílica cortada con láser esté alineada con el molde de silicona para que las características del molde estén centradas dentro de cada cavidad (Figura 4F). Este paso determina la posición del microcanal en relación con la huella. - Vierta lentamente el PDMS desgasificado en las cavidades del molde y nivele con un borde plano.
NOTA: Si hay burbujas después de verter, desgasifique el molde hasta que se eliminen las burbujas. - Coloque el molde en una placa calefactora y hornee el PDMS a 70 °C durante 1 h, luego deje que el molde se enfríe a temperatura ambiente.
- Retire con cuidado los módulos de flujo de las cavidades del molde con unas pinzas de punta plana.
- Oriente el módulo de flujo con las características del microcanal hacia arriba y coloque los puertos de entrada y salida del núcleo al final del canal con un punzón de biopsia (consulte la Tabla de materiales).
3. Fabricación de carcasas acrílicas inferiores y superiores
NOTA: El módulo central encaja en la carcasa inferior. La atracción entre los imanes incrustados en las carcasas comprime y sella el módulo de flujo al módulo central (Figura 6).
- Corte con láser una lámina acrílica de 2 mm utilizando el diseño proporcionado en el Archivo de codificación suplementario 5 para crear la carcasa superior con orificios para la inserción del imán.
- Coloque una película de PSA de 130 μm en una lámina acrílica de 3,5 mm.
- Corte con láser la lámina acrílica según el diseño dado en el Archivo de codificación suplementario 6 para crear la carcasa inferior con orificios para la inserción del imán.
NOTA: El grosor de la carcasa inferior es un parámetro crítico y debe coincidir con el grosor total del módulo central para evitar fugas durante el flujo. - Retire la capa protectora PSA y fije la carcasa inferior a un cubreobjetos de vidrio.
- Encaje a presión imanes de neodimio niquelado de 4,75 mm (consulte la tabla de materiales) en los orificios cortados con láser de las carcasas.
NOTA: Asegúrese de que los imanes en las carcasas inferior y superior estén colocados con polaridad opuesta para garantizar la atracción magnética (Figura 6).
4. Fabricación del circuito de flujo
NOTA: El circuito de flujo de circuito cerrado contiene dos viales de recolección de muestras como depósitos (Figura 7). El depósito de entrada tiene un filtro de difluoruro de polivinilideno (PVDF) para permitir que el medio celular se equilibre con la concentración deCO2 en la incubadora.
- Utilice un punzón de biopsia de 1 mm para crear dos orificios en la tapa de un vial de recolección de muestras.
- Utilice punzones de biopsia para crear dos orificios (1 mm y 4 mm) en la tapa de un vial de recolección de muestras separado y cree un orificio de 1 mm en la parte inferior de este vial.
- Inserte puntas dispensadoras de 20 G en cada uno de los orificios de 1 mm y séllelos con pegamento caliente.
- Coloque un filtro de PVDF de 0,22 μm (consulte la tabla de materiales) en el orificio de 4 mm y séllelo con pegamento caliente.
- Corte con láser una lámina acrílica de 1,5 mm utilizando el diseño proporcionado en el archivo de codificación suplementario 7 para crear una etapa de retención de muestras.
- Coloque los depósitos en la platina acrílica.
- Conecte las puntas dispensadoras con tubos de microflujo (consulte la Tabla de materiales).
- Conecte los tubos a la entrada y salida del módulo de flujo utilizando puntas dispensadoras de 21 G.
- Utilice una bomba peristáltica (consulte la Tabla de materiales) para la circulación del flujo.
NOTA: También se pueden usar jeringas o bombas neumáticas para introducir flujo si se desea. El caudal debe determinarse en función de las necesidades experimentales. En la Tabla Suplementaria 1 se proporciona una tabla completa, derivada de un modelo COMSOL validado experimentalmente, para ayudar a los usuarios a seleccionar el caudal necesario para lograr el esfuerzo cortante deseado en la monocapa de celda16.
5. Siembra celular
NOTA: Al igual que los insertos de membrana convencionales, se pueden cultivar diferentes tipos de células en la nanomembrana. Un tipo de célula secundaria también puede ser co-cultivado en el otro lado de la membrana en el canal inferior15.
- Recubrir la membrana con 5 μg/cm2 de fibronectina (ver Tabla de Materiales) a temperatura ambiente durante 1 h para mejorar la adhesión celular.
NOTA: El tipo de celda elegido puede influir en el recubrimiento requerido y la densidad de celda. El procedimiento descrito aquí es para células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC, ver Tabla de Materiales). - Aspire la solución de recubrimiento con una pipeta P200 y coloque una plantilla de patrones en el pozo del módulo central.
- Agregue medios celulares al pocillo y al canal inferior del dispositivo.
- Siembre HUVECs a una densidad de 40.000 células/cm2 en el pozo.
NOTA: Los HUVECs a esta densidad suelen formar una monocapa confluente después de 24 h de incubación 16,19. - Coloque el dispositivo en una placa de Petri. Agregue una tapa de tubo cónico de 15 ml con agua desionizada a la placa de Petri para mantener la humedad local.
- Transfiera la placa de Petri a la incubadora.
NOTA: Los medios celulares en el pocillo superior y el canal inferior del dispositivo deben cambiarse cada 24 horas. Para cambiar el medio en el canal inferior, inyecte suavemente el medio nuevo en uno de los puertos para desplazar el medio antiguo del otro puerto.
6. Reconfiguración al modo microfluídico
- Esterilice la carcasa superior, la carcasa inferior, el módulo de flujo, los depósitos, los tubos y las puntas dispensadoras colocándolos en una cámara de esterilización UV durante 30 minutos antes del montaje. Haga circular etanol al 70% y luego PBS estéril en el circuito de flujo.
- Llene los depósitos y tubos con medios de crecimiento de células endoteliales (consulte la tabla de materiales).
- Coloque la carcasa inferior en la platina de muestra. Inserte el módulo de núcleo de pozo abierto en la carcasa inferior.
- Aspire los medios celulares del pocillo del módulo. Coloque el módulo de flujo en el pozo.
- Coloque la carcasa superior para sellar el módulo de flujo en el pozo del módulo central. Conecte las puntas dispensadoras de entrada y salida a los puertos del módulo de flujo.
- Ponga en marcha la bomba peristáltica para introducir el flujo de fluido en el sistema.
7. Realización de análisis aguas abajo en formato de pozo abierto después de la introducción del flujo
NOTA: El tiempo de cultivo aquí depende de los objetivos experimentales. Los usuarios pueden realizar análisis posteriores (por ejemplo, inmunocitoquímica, extracción de ARN) en los formatos de pozo abierto o microfluídicos según sus preferencias. Por ejemplo, si se prefiere un formato de pocillo abierto, el sistema debe reconfigurarse para realizar ensayos basados en protocolos estándar16,19.
- Detenga la bomba cuando se alcance el tiempo deseado para la exposición al flujo de cizallamiento. Retire las puntas dispensadoras de entrada y salida.
- Retire la carcasa superior. Retire suavemente el módulo de flujo del pozo con unas pinzas.
- Agregue 100 μL de medio celular al pocillo. Realice los ensayos deseados basados en protocolos estándar.
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Representative Results
El módulo de núcleo de pozo abierto se coloca inicialmente dentro de una cavidad específica creada por una carcasa inferior y un cubreobjetos, como se ilustra en la Figura 6A. Posteriormente, el módulo de flujo, que incluye un microcanal y puertos de acceso, se inserta en el pozo del módulo central. El módulo de flujo está sellado de forma segura contra la capa de soporte de silicio de la membrana debido a la fuerza de atracción magnética entre los imanes incrustados en las carcasas inferior y superior, como se muestra en la Figura 6B. Para evaluar la eficacia de este mecanismo de enclavamiento magnético, se realizó una prueba de presión de rotura, demostrando que el sistema puede soportar presiones sin salida de hasta 38,8 ± 2,4 kPa. Esta tolerancia a la presión supera significativamente las presiones de funcionamiento típicas que se encuentran en las aplicaciones de cultivo celular. Además, el sistema permanece libre de fugas cuando se somete a caudales de hasta 4000 μL/min, lo que equivale a un esfuerzo cortante de 74 dinas/cm2 en la región de cultivo16.
Al desarrollar una plataforma que pueda cambiar entre los modos de pozo abierto y microfluídico, se debe considerar cuidadosamente el enfoque de siembra celular, que no suele ser una preocupación para las plataformas estáticas convencionales de pozo abierto16. El daño a la monocapa alrededor del límite del canal podría introducir complicaciones en los resultados experimentales20. Para abordar este problema, se diseñó una plantilla extraíble que encaja dentro del pozo abierto del módulo central y proporciona una ventana específica para que las células se asienten preferentemente en la superficie de la membrana (Figura 3). Una vez que la monocapa celular está modelada y alcanza la confluencia, el usuario tiene la flexibilidad de continuar el experimento en el formato de pozo abierto o reconfigurar la plataforma en modo microfluídico para exponer la monocapa celular a un esfuerzo cortante fisiológico (Figura 3). El mecanismo de enclavamiento magnético proporciona la capacidad de cambiar fácilmente entre los formatos de pozo abierto y microfluídico según sea necesario. Por ejemplo, el dispositivo puede revertirse al formato de pocillo abierto después de una estimulación de flujo, lo que ofrece a los usuarios la flexibilidad de realizar una variedad de ensayos (como inmunotinción, extracción de ARN y mediciones de permeabilidad molecular) utilizando protocolos experimentales estándar15,16.
En el entorno fisiológico del cuerpo humano, la barrera vascular está expuesta a un esfuerzo cortante inducido por el flujo, que sirve como una señal biofísica clave que afecta la estructura y función de la barrera 5,21,22. Por lo tanto, la adición de flujo de fluidos en los sistemas microfisiológicos es un requisito clave. Para demostrar la versatilidad de la plataforma, se estableció una monocapa HUVEC en un formato de pozo abierto utilizando protocolos estándar. Después de 24 h de cultivo estático, la plataforma se reconfiguró en modo microfluídico para exponer la monocapa celular a un esfuerzo cortante de 10,7 dinas/cm2 durante 24 h. Los resultados indicaron que las células cultivadas bajo flujo se alinearon a lo largo de la dirección del flujo, mientras que las células cultivadas sin flujo permanecieron orientadas aleatoriamente (Figura 8A, B). Después de la estimulación por cizallamiento, la plataforma se reconfiguró al formato de pozo abierto para extraer ARN utilizando protocolos estándar. Los resultados indicaron que la exposición de las células al estrés cortante dio lugar a la regulación positiva del factor 2 similar a Kruppel (KLF2) y de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS), que cumplen funciones críticas como funciones antitrombóticas y ateroprotectoras en vasos sanguíneos sanos23,24 (Figura 8C).
Figura 1: Comparación de modelos de barrera vascular in vitro . Ilustración esquemática de (A) insertos convencionales tipo Transwell y (B) el pozo abierto m-μSiM. Las imágenes de campo claro de una monocapa HUVEC confluente resaltan la diferencia en la calidad de imagen de campo claro entre una membrana grabada y una nanomembrana ultrafina. Barras de escala = 100 μm. Adaptado de Mansouri et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diagrama de flujo para la toma de decisiones. Un diagrama de flujo basado en las necesidades experimentales y las preferencias de análisis posteriores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Flujo de trabajo experimental de la plataforma. (A) Para colocar directamente las células en la membrana porosa, se inserta una plantilla de patrón extraíble en el pocillo del módulo central (el recuadro muestra las células con patrones, las líneas amarillas exhiben los límites de los microcanales). (B) La plantilla se puede mantener o quitar en el dispositivo para el cultivo celular estático. (C) Para reconfigurar la plataforma en modo microfluídico, la plantilla se reemplaza con el módulo de flujo. Debido al mecanismo de sellado magnético, la configuración es reversible; Las carcasas y el módulo de flujo se pueden quitar para cambiar al modo de pozo abierto. Barra de escala = 200 μm. Adaptado de Mansouri et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ilustración esquemática de los moldes. (A) El molde de plantilla. (B) Lámina acrílica cortada con láser. (C) vista ensamblada del molde de plantilla. (D) Molde del módulo de flujo. (E) Lámina acrílica cortada con láser. (F) Vista ensamblada del molde del módulo de flujo. Las características en forma de triángulo son marcas de alineación para facilitar la fijación de láminas acrílicas a los moldes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Esquema del módulo de flujo en forma de trébol. (A) La interfaz de contacto entre el módulo de flujo y el chip de membrana. Los puertos de entrada y salida para el flujo de fluido se muestran en rosa. (B) Imagen 3D del módulo de flujo PDMS. Adaptado de Mansouri et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Conjunto magnético para la reconfiguración del dispositivo. (A) Demostración esquemática de los componentes para la reconfiguración del dispositivo en modo microfluídico. Los imanes incrustados con polos opuestos inducen la atracción por el sellado. (B) Vista transversal del dispositivo reconfigurado que muestra el canal vascular en rosa y el compartimento del tejido en verde. Adaptado de Mansouri et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Vista ensamblada del circuito de flujo. El circuito consta de una bomba peristáltica, dos depósitos para suministrar medios celulares y amortiguar las fluctuaciones, tubos y una etapa acrílica para mantener los componentes en su lugar. Adaptado de Mansouri et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Comparación de HUVECs cultivados en modo de pozo abierto y microfluídico. Las células se sembraron y cultivaron en pozo abierto durante 24 h para establecer una monocapa confluente. Durante el período de 24 horas siguiente, un conjunto de dispositivos se reconfiguró en modo microfluídico. (A) Células cultivadas bajo flujo (10,7 dynes.cm-2 de esfuerzo cortante) alineadas a lo largo de la dirección del flujo (el recuadro muestra la actina y los núcleos de las células en verde y azul, respectivamente). (B) Las células cultivadas sin flujo en formato de pocillo abierto no mostraron alineación. La longitud de las barras en los gráficos de radar muestra el número de celdas en la dirección correspondiente. (C) Las células cultivadas bajo flujo mostraron una mayor regulación positiva de los genes KLF2 y eNOS en comparación con la condición sin flujo (**p < 0,01, n = 3, media ± DE). Barras de escala = 100 μm. Adaptado de Mansouri et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla complementaria 1: Esfuerzo cortante en la superficie de la nanomembrana a diferentes caudales. Esta tabla proporciona información sobre los valores de esfuerzo cortante en la superficie de la nanomembrana a varios caudales. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de codificación suplementario 1: Modelo CAD del molde de plantilla. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de codificación suplementario 2: Modelo CAD de cavidades cortadas con láser para el molde de plantilla. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de codificación suplementario 3: Modelo CAD del módulo de flujo. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de codificación suplementario 4: Modelo CAD de cavidades cortadas con láser para el molde del módulo de flujo. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de codificación suplementario 5: Modelo CAD de la carcasa superior. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de codificación suplementario 6: Modelo CAD de la carcasa inferior. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de codificación suplementario 7: Modelo CAD de la platina acrílica. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El objetivo de este protocolo es desarrollar un método práctico para incorporar capacidades de flujo en una plataforma de pozo abierto con una nanomembrana ultrafina. En este diseño, se utiliza un enfoque de enclavamiento magnético, lo que permite cambiar entre los modos de pozo abierto y fluídico durante los experimentos y combinar las ventajas de ambos enfoques. A diferencia de las plataformas convencionales unidas permanentemente, el cierre magnético permite desmontar la plataforma en puntos convenientes durante el flujo de trabajo experimental 16,25,26,27. En esta plataforma, las células se siembran y la barrera se establece en el formato familiar de pozo abierto, y luego el sistema se reconfigura a un modo fluídico simplemente agregando un módulo de flujo y sellándolo magnéticamente. Esta reconfiguración ofrece dos beneficios clave: en primer lugar, permite la simulación de condiciones fisiológicas al exponer la monocapa celular a un esfuerzo cortante inducido por fluidos; En segundo lugar, facilita la introducción de componentes secundarios como las células inmunitarias en condiciones de flujo16. La función de enclavamiento magnético ofrece un método de ensamblaje sin herramientas, lo que permite cambiar bajo demanda entre formatos de pozo abierto y microfluídico. En consecuencia, los análisis posteriores, como la inmunocitoquímica y la extracción de ARN, pueden realizarse en el conocido formato de pozo abierto utilizando técnicas estándar o utilizando técnicas microfluídicas según se desee16.
El sellado magnético es un parámetro crítico del diseño que permite la reconfigurabilidad de la plataforma y, por lo tanto, se requieren varias consideraciones para su funcionamiento preciso: (1) La altura de la carcasa inferior debe coincidir con la altura del módulo central (tolerancia: ±0,1 mm) para encerrar el módulo correctamente. (2) La altura del módulo de flujo debe ser ligeramente más alta que el pozo del módulo central (0-0,1 mm). (3) Este diseño es adaptable a una amplia gama de materiales y no exige que el módulo de flujo se construya con materiales elastoméricos. El elemento crucial es incorporar un material blando, similar a una junta, en la interfaz entre el módulo de flujo y el chip de membrana para establecer un sello confiable. (4) El diámetro de las cavidades cortadas con láser en las carcasas de los imanes de ajuste a presión debe optimizarse en función del instrumento utilizado28. Los imanes pueden desprenderse y provocar fugas de flujo si el diámetro de la cavidad es demasiado grande, o las carcasas pueden agrietarse durante la inserción del imán si las cavidades son demasiado pequeñas. Siguiendo las consideraciones antes mencionadas, el enfoque de ensamblaje magnético presentado aquí se puede aplicar para reconfigurar otros sistemas de pozos abiertos en modo microfluídico.
Para tener la capacidad de reconfiguración, es necesario utilizar una plantilla de patrones que permita un posicionamiento preciso de las células en la superficie de la membrana. La plantilla garantiza que no haya células fuera de la región de cultivo porosa (es decir, en la región de soporte de silicio), que puedan dañarse al insertar el módulo de flujo. Este aspecto se vuelve particularmente crucial en los modelos de cocultivo porque las células sembradas inadvertidamente en lugares no deseados no pueden participar activamente en el desarrollo del tejido de barrera. No obstante, estas células mal colocadas generalmente se recuperan durante el proceso de lisis y pueden introducir sesgos en los estudios de expresión génica que investigan las interacciones entre las células a través de la membrana20. La siembra celular de pozo abierto utilizando la plantilla mejora la eficiencia de la siembra al mitigar las pérdidas celulares a lo largo de la ruta del flujo, que son inherentes a las plataformas microfluídicas convencionales 4,16. Esta plataforma también es capaz de incorporar múltiples tipos de células y materiales ECM 15,16,17. Por ejemplo, se puede inyectar un hidrogel cargado de células en el canal inferior del dispositivo para imitar el compartimento del tejido mientras se establece un endotelio en la parte superior de la membrana.
Aunque los módulos y componentes magnéticos se pueden reutilizar, mantener un sellado eficaz en varios usos puede ser un problema debido a que los imanes se aflojan en la carcasa y disminuyen la fuerza de sellado. Este problema se puede mitigar fabricando nuevos módulos laminados para cada experimento o produciendo componentes en masa mediante técnicas de moldeo por inyección o impresión 3D una vez que se hayan establecido los diseños. En el método descrito en este protocolo, el módulo de flujo se coloca manualmente en el módulo central y la capacidad de multiplexación y automatización del sistema es limitada. Para mejorar el rendimiento experimental, el módulo de flujo y la carcasa superior se pueden integrar en un módulo funcional que contiene canales de enrutamiento internos y conexiones de tubería estandarizadas que perfunden simultáneamente varios módulos en paralelo.
Los componentes del módulo de núcleo de pozo abierto se producen en masa y están disponibles comercialmente. Otros componentes del sistema, como el módulo de flujo, las carcasas y la plantilla de patrones, también se pueden fabricar a gran escala. Además, la reconfigurabilidad de la plataforma permite la adición de sensores y actuadores (por ejemplo, módulo de resistencia eléctrica transendotelial, módulo de electroporación) para estimulación y mediciones en tiempo real. En general, esta plataforma combina enfoques convencionales y microfluídicos para ayudar a respaldar el uso generalizado fuera de los laboratorios de ingeniería.
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Disclosures
J.L.M. es cofundador de SiMPore, Inc. y tiene una participación accionaria en la empresa. SiMPore está comercializando las tecnologías ultrafinas basadas en silicio, incluidas las membranas utilizadas en este estudio.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada en parte por el Instituto Nacional de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) bajo los números de adjudicación R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 y la subvención CBET de la NSF 2150798. Los autores agradecen a RIT Machine Shop por la fabricación de moldes de aluminio. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
| 1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
| 1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
| 21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
| 3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
| 3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
| AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
| Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
| Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
| Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
| Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
| Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
| Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
| Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
| PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
| Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
| SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
| Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
| Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
| TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
| Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
| uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
| uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |
References
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