Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine rekonfigurierbare membranbasierte Zellkulturplattform, die das Open-Well-Format mit Flüssigkeitsflussfunktionen integriert. Diese Plattform ist mit Standardprotokollen kompatibel und ermöglicht reversible Übergänge zwischen Open-Well- und mikrofluidischen Kulturmodi, um den Anforderungen von Ingenieur- und Biowissenschaftslabors gerecht zu werden.
Abstract
Mikrophysiologische Systeme sind miniaturisierte Zellkulturplattformen, die verwendet werden, um die Struktur und Funktion menschlicher Gewebe in einer Laborumgebung nachzuahmen. Diese Plattformen haben jedoch keine breite Akzeptanz in biowissenschaftlichen Labors gefunden, wo membranbasierte Ansätze mit offenen Bohrlöchern als Goldstandard für die Nachahmung von Gewebebarrieren dienen, obwohl sie keine Flüssigkeitsflussfähigkeiten haben. Dieses Problem kann in erster Linie auf die Inkompatibilität bestehender mikrophysiologischer Systeme mit Standardprotokollen und -werkzeugen zurückgeführt werden, die für Open-Well-Systeme entwickelt wurden.
Hier stellen wir ein Protokoll zur Erstellung einer rekonfigurierbaren membranbasierten Plattform mit einer Open-Well-Struktur, Durchflussverbesserungsfähigkeit und Kompatibilität mit herkömmlichen Protokollen vor. Dieses System verwendet einen magnetischen Montageansatz, der ein reversibles Umschalten zwischen Open-Well- und Mikrofluidik-Modus ermöglicht. Mit diesem Ansatz haben Benutzer die Flexibilität, ein Experiment im Open-Well-Format mit Standardprotokollen zu beginnen und bei Bedarf Durchflussfunktionen hinzuzufügen oder zu entfernen. Um die praktische Anwendung dieses Systems und seine Kompatibilität mit Standardtechniken zu demonstrieren, wurde eine Endothelzell-Monoschicht in einem Open-Well-Format etabliert. Das System wurde neu konfiguriert, um einen Flüssigkeitsfluss einzuführen, und dann auf das Open-Well-Format umgestellt, um Immunfärbung und RNA-Extraktion durchzuführen. Aufgrund seiner Kompatibilität mit herkömmlichen Open-Well-Protokollen und der Fähigkeit zur Flussverbesserung wird erwartet, dass dieses rekonfigurierbare Design sowohl von technischen als auch von biowissenschaftlichen Labors übernommen wird.
Introduction
Gefäßbarrieren dienen als kritische Schnittstelle, die das Blutkompartiment vom umgebenden Gewebe trennt. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Erhaltung der Homöostase, indem sie Immunzellen anziehen, die molekulare Permeabilität kontrollieren und das Eindringen von Krankheitserregern in das Gewebe verhindern 1,2. In-vitro-Kulturmodelle wurden entwickelt, um die In-vivo-Mikroumgebung nachzuahmen und systematische Untersuchungen der Faktoren und Bedingungen zu ermöglichen, die die Barriereeigenschaften sowohl im gesunden als auch im kranken Zustand beeinflussen 3,4.
Der am weitesten verbreitete Ansatz für solche Kulturmodelle ist die Transwell-ähnliche "Open-Well"-Konfiguration5, bei der eine poröse, spurgeätzte Kulturmembran mediengefüllte Kompartimente trennt (Abbildung 1A). In diesem Format können Zellen auf beiden Seiten der Membran ausgesät werden, und es wurde eine breite Palette von experimentellen Protokollen entwickelt. Diese Systeme sind jedoch nur begrenzt in ihrer Fähigkeit, die Flüssigkeitsströme bereitzustellen, die für die Unterstützung der Barrierereifung und die Nachahmung der Immunzellzirkulation in vivo unerlässlich sind 5,6. Folglich können sie nicht für Studien verwendet werden, die dynamische Strömungen erfordern, die Arzneimitteldosen, mechanische Stimulation oder flüssigkeitsinduzierte Scherspannungen einführen 6,7,8.
Um die Einschränkungen von Open-Well-Systemen zu überwinden, wurden mikrofluidische Plattformen entwickelt, die poröse Kulturmembranen mit individuell adressierbaren fluidischen Kanälen kombinieren9. Diese Plattformen bieten eine präzise Kontrolle über das Routing von Flüssigkeiten, die Perfusion und das Einbringen chemischer Verbindungen, eine kontrollierte Scherstimulation und dynamische Zelladditionsfunktionen 7,10,11,12,13. Trotz der fortschrittlichen Fähigkeiten, die mikrofluidische Plattformen bieten, haben sie aufgrund komplexer mikrofluidischer Protokolle und ihrer Inkompatibilität mit etablierten experimentellen Arbeitsabläufen keine weit verbreitete Akzeptanz in biowissenschaftlichen Laborsgefunden 4,10,14.
Um die Lücke zwischen diesen Technologien zu schließen, stellen wir ein Protokoll vor, das ein magnetisch rekonfigurierbares, modulbasiertes System verwendet. Dieses System kann je nach den spezifischen Anforderungen des Experiments einfach zwischen Open-Well- und Mikrofluidik-Modus umgeschaltet werden. Die Plattform verfügt über ein Open-Well-Gerät, bekannt als m-μSiM (modulares mikrophysiologisches System, das durch eine Siliziummembran ermöglicht wird), mit einer 100 nm dicken Kulturmembran (Nanomembran). Diese Nanomembran besitzt eine hohe Porosität (15 %) und glasartige Transparenz, wie in Abbildung 1B dargestellt. Es trennt physikalisch das obere Kompartiment von einem unteren Kanal und ermöglicht so den molekularen Transport über physiologische Längenskalen15. Im Gegensatz zu herkömmlichen spurgeätzten Membranen, die bekannte Herausforderungen bei der Bildgebung lebender Zellen mit Hellfeld-Bildgebung haben, ermöglichen die günstigen optischen und physikalischen Eigenschaften der Nanomembran eine klare Visualisierung von Zellen auf beiden Seiten der Membranoberfläche 15,16,17.
Das vorliegende Protokoll skizziert die Herstellung von spezialisierten Seeding- und Flow-Modulen und erklärt die magnetische Rekonfiguration der Plattform. Es zeigt, wie die Plattform eingesetzt werden kann, um Endothelbarrieren sowohl unter statischen als auch unter dynamischen Bedingungen zu etablieren. Diese Demonstration zeigt, dass sich Endothelzellen entlang der Flussrichtung ausrichten, wobei die scherempfindlichen Genziele unter Scherstimulation hochreguliert werden.
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Protocol
Dieses Design kann in verschiedenen Modi verwendet werden, basierend auf experimentellen Anforderungen und den Vorlieben des Endbenutzers. Konsultieren Sie vor jedem Experiment das in Abbildung 2 dargestellte Entscheidungsflussdiagramm, um die erforderlichen Schritte und Module für das Protokoll zu bestimmen. Wenn der Benutzer beispielsweise beabsichtigt, das Open-Well-Format während eines Experiments beizubehalten, um es direkt mit dem Transwell-System zu vergleichen, ist die Strukturierungsschablone für die Zellaussaat nicht erforderlich. Das Kernmodul ist im Handel erhältlich (siehe Materialtabelle), und die ultradünne Nanomembran kann aus einer Bibliothek von Materialien mit unterschiedlicher Porosität und Porengröße ausgewählt werden, um den experimentellen Anforderungen gerecht zu werden.
1. Herstellung der Musterschablone
HINWEIS: Die Strukturierungsschablone dient dazu, Zellen ausschließlich auf dem porösen Bereich des Membranchips zu positionieren und zu verhindern, dass sich Zellen auf der umgebenden Siliziumschicht absetzen, wo sie möglicherweise beschädigt werden könnten, nachdem das Durchflussmodulhinzugefügt wurde 16 (siehe Abbildung 3). Eine Beschädigung der Monoschicht kann die Integrität der Barriere beeinträchtigen und die Versuchsergebnisse beeinträchtigen. Die Schablone ist in einer offenen, statischen Kultur unnötig, da keine Gefahr einer Beschädigung besteht.
- Kaufen, bearbeiten oder drucken Sie eine Form in 3D mit dem Design in der ergänzenden Codierungsdatei 1 (Abbildung 4A).
HINWEIS: Die Schablonenwände sind verjüngt, um die Medienkapazität zu erhöhen und Blaseneinschlüsse im Vergleich zu geraden Elementen mit hohem Seitenverhältnis zu minimieren. - Befestigen Sie eine 130 μm Haftklebefolie (PSA) mit einer Kaltwalze auf einer 3,2 mm Acrylplatte (siehe Materialtabelle).
- Laserschneiden Sie die Acrylplatte gemäß dem Design in der ergänzenden Codierungsdatei 2 , um eine Reihe von Hohlräumen zu erstellen (Abbildung 4B).
- Ziehen Sie die Schutzschicht von der PSA-Folie ab und befestigen Sie die Acrylplatte an der Form.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das lasergeschnittene Blech mit der Form ausgerichtet ist, sodass die Formmerkmale in der Kavität zentriert sind (Abbildung 4C). Die Genauigkeit der Zellpositionierung auf der Membran hängt von diesem Schritt ab. - Mischen Sie das PDMS-Prepolymer gründlich (mit einem Base-Katalysator-Verhältnis von 10:1) (siehe Materialtabelle) und entgasen Sie es in einer Vakuumkammer, bis keine sichtbaren Blasen mehr vorhanden sind (5-15 min).
- Gießen Sie das PDMS langsam in die Formhohlräume und richten Sie es mit einer flachen Kante aus.
HINWEIS: Um Blaseneinschlüsse zu vermeiden, gießen Sie das PDMS langsam in jeden Hohlraum. Wenn nach dem Gießen Blasen vorhanden sind, stellen Sie die Form in die Vakuumkammer und entgasen Sie sie erneut. - Das PDMS auf einer Kochplatte bei 70 °C 1 h aushärten und anschließend auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
- Ziehen Sie die Schablonen mit einer Pinzette mit flacher Spitze aus den Formhohlräumen.
2. Herstellung des Strömungsmoduls
HINWEIS: Das Durchflussmodul hat eine ähnliche Grundfläche wie die kleeförmige Vertiefung des Kernmoduls und enthält einen geformten Mikrokanal (Breite = 1,5 mm, Höhe = 0,2 mm, Länge = 5 mm). Die Kleeform hilft bei der Ausrichtung des Kanals über dem porösen Kulturbereich (Abbildung 5).
- Verwenden Sie Standard-Softlithographietechniken18 , um eine Silikonform mit Merkmalen zu erstellen, die durch die in der ergänzenden Codierungsdatei 3 (Figur 4D) bereitgestellte Konstruktion definiert sind.
- Befestigen Sie eine 130 μm PSA-Folie auf einer 3,2 mm dicken Acrylplatte.
- Laserschneiden Sie die Acrylplatte basierend auf dem in der ergänzenden Codierungsdatei 4 angegebenen Design, um eine Reihe kleeförmiger Hohlräume zu erstellen (Abbildung 4E).
HINWEIS: Die Höhe des Hohlraums bestimmt die Höhe des Durchflussmoduls, das etwas höher (um 0-0,1 mm) als die Höhe des Kernmodulschachts sein muss, um eine ordnungsgemäße Abdichtung zu gewährleisten. - Entfernen Sie die Schutzschicht von der PSA-Folie und befestigen Sie dann das lasergeschnittene Blech an der Silikonform, indem Sie die dreieckigen Ausrichtungsmarkierungen auf der Silikonform mit denen auf dem lasergeschnittenen Blech ausrichten.
HINWEIS: Stellen Sie ähnlich wie in Schritt 1.4 sicher, dass die lasergeschnittene Acrylplatte mit der Silikonform ausgerichtet ist, sodass die Formmerkmale in jedem Hohlraum zentriert sind (Abbildung 4F). Dieser Schritt bestimmt die Position des Mikrokanals relativ zum Footprint. - Gießen Sie das entgaste PDMS langsam auf die Formhohlräume und richten Sie es mit einer flachen Kante aus.
Anmerkungen: Wenn nach dem Gießen Blasen vorhanden sind, entgasen Sie die Form, bis die Blasen entfernt sind. - Stellen Sie die Form auf eine Kochplatte und backen Sie das PDMS bei 70 °C für 1 h, dann lassen Sie die Form auf Raumtemperatur abkühlen.
- Entfernen Sie die Strömungsmodule vorsichtig mit einer Pinzette mit flacher Spitze aus den Formhohlräumen.
- Richten Sie das Durchflussmodul so aus, dass die Mikrokanalmerkmale nach oben zeigen, und positionieren Sie die Kerneinlass- und -auslassöffnungen mit einem Biopsiestempel am Ende des Kanals (siehe Materialtabelle).
3. Herstellung von unteren und oberen Acrylgehäusen
HINWEIS: Das Kernmodul passt in das untere Gehäuse. Die Anziehung zwischen eingebetteten Magneten in den Gehäusen komprimiert und dichtet das Strömungsmodul zum Kernmodul ab (Abbildung 6).
- Laserschneiden Sie eine 2 mm dicke Acrylplatte mit dem in der ergänzenden Codierungsdatei 5 bereitgestellten Design, um das obere Gehäuse mit Löchern für den Magneteinsatz zu erstellen.
- Befestigen Sie eine 130 μm PSA-Folie auf einer 3,5 mm Acrylplatte.
- Laserschneiden Sie die Acrylplatte basierend auf dem in der ergänzenden Codierungsdatei 6 angegebenen Design, um das untere Gehäuse mit Löchern für den Magneteinsatz zu erstellen.
HINWEIS: Die Dicke des unteren Gehäuses ist ein kritischer Parameter und muss mit der Gesamtdicke des Kernmoduls übereinstimmen, um Leckagen während des Durchflusses zu vermeiden. - Entfernen Sie die PSA-Schutzschicht und befestigen Sie das untere Gehäuse an einem Glasdeckglas.
- 4,75 mm vernickelte Neodym-Magnete (siehe Materialtabelle) in die lasergeschnittenen Löcher der Gehäuse einpressen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Magnete im unteren und oberen Gehäuse mit entgegengesetzter Polarität platziert sind, um die magnetische Anziehung zu gewährleisten (Abbildung 6).
4. Herstellung des Strömungskreislaufs
HINWEIS: Der geschlossene Durchflusskreislauf enthält zwei Probensammelfläschchen als Reservoire (Abbildung 7). Das Einlassreservoir verfügt über einen Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Filter, damit sich die Zellmedien mit der CO2 - Konzentration im Inkubator ausgleichen können.
- Verwenden Sie einen 1-mm-Biopsiestanzer, um zwei Löcher in die Kappe eines Probenentnahmefläschchens zu bohren.
- Verwenden Sie Biopsiestempel, um zwei Löcher (1 mm und 4 mm) in die Kappe eines separaten Probenentnahmefläschchens zu bohren, und erzeugen Sie ein 1 mm großes Loch im unteren Teil dieses Fläschchens.
- In jedes der 1 mm Löcher 20 G Dosierspitzen stecken und mit Heißkleber verschließen.
- Setzen Sie einen 0,22 μm PVDF-Filter (siehe Materialtabelle) in das 4 mm Loch ein und verschließen Sie ihn mit Heißkleber.
- Laserschneiden Sie eine 1,5 mm dicke Acrylplatte mit dem in der ergänzenden Codierungsdatei 7 bereitgestellten Design, um eine Probenhaltebühne zu erstellen.
- Positionieren Sie die Behälter auf der Acrylbühne.
- Verbinden Sie die Dosierspitzen mit Mikro-Durchflussschläuchen (siehe Materialtabelle).
- Verbinden Sie die Röhrchen mit 21-G-Dosierspitzen mit dem Einlass und Auslass des Durchflussmoduls.
- Verwenden Sie eine Schlauchpumpe (siehe Materialtabelle) für die Durchflusszirkulation.
HINWEIS: Auf Wunsch können auch Spritzen- oder Pneumatikpumpen verwendet werden, um den Durchfluss einzuführen. Die Durchflussrate sollte auf der Grundlage der experimentellen Anforderungen bestimmt werden. Eine umfassende Tabelle, die von einem experimentell validierten COMSOL-Modell abgeleitet wurde, ist in der ergänzenden Tabelle 1 enthalten, um die Benutzer bei der Auswahl der erforderlichen Durchflussrate zu unterstützen, um die gewünschte Scherspannung an der Zellmonoschicht16 zu erreichen.
5. Zellaussaat
HINWEIS: Ähnlich wie bei herkömmlichen Membraneinsätzen können auf der Nanomembran verschiedene Zelltypen kultiviert werden. Ein sekundärer Zelltyp kann auch auf der anderen Seite der Membran im unteren Kanal15 cokultiviert werden.
- Beschichten Sie die Membran 1 h lang mit 5 μg/cm2 Fibronektin (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur, um die Zelladhäsion zu verbessern.
HINWEIS: Der gewählte Zelltyp kann die erforderliche Beschichtung und Zelldichte beeinflussen. Das hier beschriebene Verfahren gilt für humane Nabelschnurvenendothelzellen (HUVECs, siehe Materialtabelle). - Saugen Sie die Beschichtungslösung mit einer P200-Pipette an und legen Sie eine Musterschablone in die Vertiefung des Kernmoduls.
- Fügen Sie dem Well und dem unteren Kanal des Geräts Zellmedien hinzu.
- HUVECs mit einer Dichte von 40.000 Zellen/cm2 in die Vertiefung säen.
HINWEIS: HUVECs mit dieser Dichte bilden typischerweise nach 24 Stunden Inkubation eine konfluente Monoschicht16,19. - Stellen Sie das Gerät in eine Petrischale. Geben Sie eine konische 15-ml-Röhrchenkappe mit DI-Wasser in die Petrischale, um die lokale Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.
- Übertragen Sie die Petrischale in den Inkubator.
HINWEIS: Die Zellmedien im oberen und unteren Kanal des Geräts sollten alle 24 Stunden gewechselt werden. Um das Medium im unteren Kanal zu wechseln, spritzen Sie vorsichtig frisches Medium in einen der Anschlüsse, um das alte Medium vom anderen Port zu verdrängen.
6. Rekonfiguration in den mikrofluidischen Modus
- Sterilisieren Sie das obere Gehäuse, das untere Gehäuse, das Durchflussmodul, die Reservoirs, die Röhrchen und die Dosierspitzen, indem Sie sie vor der Montage 30 Minuten lang in eine UV-Sterilisationskammer legen. 70% Ethanol umwälzen und dann steriles PBS im Durchflusskreislauf sterilisieren.
- Füllen Sie die Reservoirs und Röhrchen mit Endothelzellwachstumsmedien (siehe Materialtabelle).
- Setzen Sie das untere Gehäuse auf den Probentisch. Setzen Sie das Open-Well-Core-Modul in das untere Gehäuse ein.
- Saugen Sie Zellmedien aus der Vertiefung des Moduls an. Setzen Sie das Durchflussmodul in die Vertiefung ein.
- Platzieren Sie das obere Gehäuse, um das Durchflussmodul abzudichten, in der Vertiefung des Kernmoduls. Schließen Sie die Einlass- und Auslassdosierspitzen an die Anschlüsse des Durchflussmoduls an.
- Starten Sie die Schlauchpumpe, um den Flüssigkeitsfluss in das System einzuleiten.
7. Durchführung von Downstream-Analysen im Open-Well-Format nach der Durchflusseinführung
HINWEIS: Die Kulturzeit hängt hier von den experimentellen Zielen ab. Benutzer können nachgelagerte Analysen (z. B. Immunzytochemie, RNA-Extraktion) je nach Wunsch entweder im Open-Well- oder im Mikrofluidik-Format durchführen. Wenn beispielsweise ein Open-Well-Format bevorzugt wird, sollte das System neu konfiguriert werden, um Assays auf der Grundlage von Standardprotokollendurchzuführen 16,19.
- Stoppen Sie die Pumpe, wenn die gewünschte Zeit für die Scherflussexposition erreicht ist. Entfernen Sie die Einlass- und Auslassdosierspitzen.
- Entfernen Sie das obere Gehäuse. Entfernen Sie das Durchflussmodul vorsichtig mit einer Pinzette aus der Vertiefung.
- Geben Sie 100 μl Zellmedien in die Vertiefung. Führen Sie die gewünschten Assays auf der Grundlage von Standardprotokollen durch.
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Representative Results
Das Open-Well-Core-Modul wird zunächst in einem bestimmten Hohlraum positioniert, der durch ein niedrigeres Gehäuse und ein Deckglas entsteht, wie in Abbildung 6A dargestellt. Anschließend wird das Durchflussmodul, das einen Mikrokanal und Zugangsöffnungen umfasst, in die Vertiefung des Kernmoduls eingesetzt. Das Strömungsmodul ist aufgrund der magnetischen Anziehungskraft zwischen Magneten, die in das untere und obere Gehäuse eingebettet sind, wie in Abbildung 6B dargestellt, sicher gegen die Silizium-Trägerschicht der Membran abgedichtet. Um die Wirksamkeit dieses magnetischen Verriegelungsmechanismus zu bewerten, wurde ein Berstdrucktest durchgeführt, der zeigte, dass das System Dead-End-Drücken von bis zu 38,8 ± 2,4 kPa standhält. Diese Drucktoleranz übertrifft die typischen Betriebsdrücke in Zellkulturanwendungen erheblich. Darüber hinaus bleibt das System bei Durchflussraten von bis zu 4000 μl/min leckagefrei, was einer Scherspannung von 74 dyn/cm2 im Kulturbereich16 entspricht.
Bei der Entwicklung einer Plattform, die zwischen Open-Well- und Mikrofluidik-Modus umschalten kann, muss der Ansatz der Zellaussaat sorgfältig berücksichtigt werden, der für herkömmliche statische Open-Well-Plattformen in der Regel kein Problem darstellt16. Eine Schädigung der Monoschicht um die Kanalgrenze könnte zu Komplikationen bei den experimentellen Ergebnissen führen20. Um dieses Problem zu lösen, wurde eine abnehmbare Schablone entwickelt, die in die offene Vertiefung des Kernmoduls passt und ein bestimmtes Fenster bietet, in dem sich Zellen bevorzugt auf der Membranoberfläche ansiedeln können (Abbildung 3). Sobald die Zellmonoschicht strukturiert ist und Konfluenz erreicht, hat der Benutzer die Flexibilität, das Experiment im Open-Well-Format fortzusetzen oder die Plattform in den mikrofluidischen Modus zu versetzen, um die Zellmonoschicht physiologischer Scherspannung auszusetzen (Abbildung 3). Der magnetische Verriegelungsmechanismus bietet die Möglichkeit, je nach Bedarf einfach zwischen dem Open-Well- und dem Mikrofluidik-Format zu wechseln. Beispielsweise kann das Gerät nach einer Strömungsstimulation auf das Open-Well-Format zurückgesetzt werden, was dem Benutzer die Flexibilität bietet, eine Vielzahl von Assays (wie Immunfärbung, RNA-Extraktion und molekulare Permeabilitätsmessungen) unter Verwendung von Standard-Versuchsprotokollendurchzuführen 15,16.
In der physiologischen Umgebung des menschlichen Körpers ist die Gefäßbarriere strömungsinduzierten Scherspannungen ausgesetzt, die als wichtiger biophysikalischer Hinweis dienen, der die Struktur und Funktion der Barriere beeinflusst 5,21,22. Daher ist die Zugabe von Flüssigkeitsströmungen in mikrophysiologischen Systemen eine Schlüsselvoraussetzung. Um die Vielseitigkeit der Plattform zu demonstrieren, wurde ein HUVEC-Monolayer in einem Open-Well-Format unter Verwendung von Standardprotokollen etabliert. Nach 24 Stunden statischer Kultur wurde die Plattform in den mikrofluidischen Modus versetzt, um die Zellmonoschicht 24 Stunden lang einer Scherspannung von 10,7 dyn/cm2 auszusetzen. Die Ergebnisse zeigten, dass Zellen, die unter Fluss kultiviert wurden, entlang der Flussrichtung ausgerichtet waren, während Zellen, die ohne Fluss kultiviert wurden, zufällig orientiert blieben (Abbildung 8A, B). Nach der Scherstimulation wurde die Plattform auf das Open-Well-Format umkonfiguriert, um RNA unter Verwendung von Standardprotokollen zu extrahieren. Die Ergebnisse zeigten, dass die Exposition von Zellen gegenüber Scherstress zu einer Hochregulierung des Kruppel-ähnlichen Faktors 2 (KLF2) und der endothelialen Stickstoffmonoxidsynthase (eNOS) führte, die kritische Rollen wie antithrombotische und atheroprotektive Funktionen in gesunden Blutgefäßen erfüllen23,24 (Abbildung 8C).
Abbildung 1: Vergleich von in vitro Gefäßbarrieremodellen. Schematische Darstellung von (A) konventionellen Transwell-ähnlichen Einsätzen und (B) dem Open-Well-m-μSiM. Hellfeldbilder einer konfluenten HUVEC-Monoschicht verdeutlichen den Unterschied in der Hellfeld-Abbildungsqualität zwischen einer spurgeätzten Membran und einer ultradünnen Nanomembran. Maßstabsleisten = 100 μm. Adaptiert von Mansouri et al.16. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Flussdiagramm für die Entscheidungsfindung. Ein Flussdiagramm, das auf experimentellen Anforderungen und nachgelagerten Analysepräferenzen basiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Experimenteller Arbeitsablauf der Plattform. (A) Um Zellen direkt auf der porösen Membran zu positionieren, wird eine herausnehmbare Strukturierungsschablone in die Vertiefung des Kernmoduls eingeführt (der Einsatz zeigt gemusterte Zellen, gelbe Linien zeigen Mikrokanalgrenzen). (B) Die Schablone kann für statische Zellkulturen im Gerät aufbewahrt oder entfernt werden. (C) Um die Plattform in den mikrofluidischen Modus zu versetzen, wird die Schablone durch das Durchflussmodul ersetzt. Aufgrund des magnetischen Dichtungsmechanismus ist die Konfiguration reversibel; Gehäuse und das Durchflussmodul können entfernt werden, um in den Open-Well-Modus zu wechseln. Maßstabsleiste = 200 μm. Adaptiert von Mansouri et al.16. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Schematische Darstellung der Formen. (A) Die Schablonenform. (B) Lasergeschnittene Acrylplatte. (C) zusammengebaute Ansicht der Schablonenform. (D) Fließmodul-Form. (E) Lasergeschnittene Acrylplatte. (F) Zusammengebaute Ansicht des Durchflussmoduls. Dreiecksförmige Merkmale sind Ausrichtungsmarkierungen, um das Anbringen von Acrylplatten an den Formen zu erleichtern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Schematische Darstellung des kleeförmigen Strömungsmoduls. (A) Die Kontaktschnittstelle zwischen dem Strömungsmodul und dem Membranchip. Die Einlass- und Auslassöffnungen für den Flüssigkeitsfluss sind rosa dargestellt. (B) 3D-Bild des PDMS-Flow-Moduls. Adaptiert von Mansouri et al.16. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Magnetische Baugruppe für die Geräterekonfiguration. (A) Schematische Demonstration von Komponenten für die Geräterekonfiguration in den mikrofluidischen Modus. Eingebettete Magnete mit entgegengesetzten Polen induzieren eine Anziehungskraft für die Abdichtung. (B) Querschnittsansicht des rekonfigurierten Geräts, das den Gefäßkanal in rosa und das Gewebekompartiment in grün zeigt. Adaptiert von Mansouri et al.16. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Zusammengebaute Ansicht des Strömungskreislaufs. Der Kreislauf besteht aus einer Schlauchpumpe, zwei Reservoirs zur Versorgung von Zellmedien und zur Dämpfung von Schwankungen, Schläuchen und einem Acryltisch, um die Komponenten an Ort und Stelle zu halten. Adaptiert von Mansouri et al.16. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Vergleich von HUVECs, die im Open-Well- und mikrofluidischen Modus kultiviert wurden. Die Zellen wurden ausgesät und 24 Stunden lang in offenen Vertiefungen kultiviert, um eine konfluente Monoschicht zu bilden. Während der folgenden 24 Stunden wurde eine Gruppe von Geräten in den mikrofluidischen Modus umkonfiguriert. (A) Zellen, die unter Fluss (10,7 dynes.cm-2 Scherspannung) kultiviert wurden, die entlang der Strömungsrichtung ausgerichtet sind (der Einschub zeigt Aktin und Zellkerne in grün bzw. blau). (B) Zellen, die ohne Fluss im Open-Well-Format kultiviert wurden, zeigten keine Ausrichtung. Die Länge der Balken in Radardiagrammen zeigt die Anzahl der Zellen in der entsprechenden Richtung. (C) Zellen, die unter Fluss kultiviert wurden, zeigten eine höhere Hochregulation der KLF2- und eNOS-Gene im Vergleich zur No-Flow-Bedingung (**p < 0,01, n = 3, Mittelwert ± SD). Maßstabsleisten = 100 μm. Adaptiert von Mansouri et al.16. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Tabelle 1: Scherspannung auf der Nanomembranoberfläche bei unterschiedlichen Durchflussraten. Diese Tabelle enthält Informationen über Scherspannungswerte auf der Nanomembranoberfläche bei verschiedenen Durchflussraten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Codierungsdatei 1: CAD-Modell der Schablonenform. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Codierungsdatei 2: CAD-Modell von lasergeschnittenen Kavitäten für die Schablonenform. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Codierungsdatei 3: CAD-Modell des Durchflussmoduls. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Codierungsdatei 4: CAD-Modell von lasergeschnittenen Kavitäten für das Durchflussmodulwerkzeug. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Codierungsdatei 5: CAD-Modell des oberen Gehäuses. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Codierungsdatei 6: CAD-Modell des unteren Gehäuses. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Codierungsdatei 7: CAD-Modell des Acryltisches. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Ziel dieses Protokolls ist es, eine praktische Methode zu entwickeln, um Durchflussfähigkeiten in eine Open-Well-Plattform mit einer ultradünnen Nanomembran zu integrieren. Bei diesem Design wird ein magnetischer Verriegelungsansatz verwendet, der es ermöglicht, während der Experimente zwischen Open-Well- und Fluidic-Modus zu wechseln und die Vorteile beider Ansätze zu kombinieren. Im Gegensatz zu herkömmlichen dauerhaft verklebten Plattformen ermöglicht die magnetische Verriegelung die Demontage der Plattform an geeigneten Stellen während des experimentellen Arbeitsablaufs 16,25,26,27. Auf dieser Plattform werden die Zellen ausgesiedelt und die Barriere im bekannten Open-Well-Format aufgebaut, und dann wird das System durch einfaches Hinzufügen eines Durchflussmoduls und magnetisches Abdichten in einen fluidischen Modus umkonfiguriert. Diese Rekonfiguration bietet zwei wesentliche Vorteile: Erstens ermöglicht sie die Simulation physiologischer Bedingungen, indem die Zellmonoschicht flüssigkeitsinduzierter Scherspannung ausgesetzt wird; Zweitens erleichtert es die Einführung von sekundären Komponenten wie Immunzellen unter Strömungsbedingungen16. Die magnetische Verriegelungsfunktion bietet eine werkzeuglose Montagemethode, die bei Bedarf den Wechsel zwischen Open-Well- und Mikrofluidik-Formaten ermöglicht. Folglich können nachgelagerte Analysen, wie Immunzytochemie und RNA-Extraktion, im bekannten Open-Well-Format mit Standardtechniken oder nach Wunsch mit mikrofluidischen Techniken durchgeführt werden16.
Die magnetische Abdichtung ist ein kritischer Parameter des Designs, der die Rekonfigurierbarkeit der Plattform ermöglicht, und daher sind mehrere Überlegungen für ihre genaue Funktion erforderlich: (1) Die Höhe des unteren Gehäuses muss mit der Höhe des Kernmoduls übereinstimmen (Toleranz: ±0,1 mm), um das Modul richtig zu umschließen. (2) Die Höhe des Durchflussmoduls muss etwas höher sein als die Vertiefung des Kernmoduls (0-0,1 mm). (3) Dieses Design ist an eine Vielzahl von Materialien anpassbar und erfordert nicht, dass das Durchflussmodul aus elastomeren Materialien besteht. Entscheidend ist die Einarbeitung eines weichen, dichtungsartigen Materials an der Schnittstelle zwischen Strömungsmodul und Membranchip, um eine zuverlässige Abdichtung zu gewährleisten. (4) Der Durchmesser der lasergeschnittenen Kavitäten in den Gehäusen für Einpressmagnete muss auf der Grundlage des verwendeten Geräts optimiert werden28. Magnete können sich lösen und zu Strömungsleckagen führen, wenn der Hohlraumdurchmesser zu groß ist, oder Gehäuse können beim Einsetzen des Magneten reißen, wenn die Hohlräume zu klein sind. Durch die Befolgung der oben genannten Überlegungen kann der hier vorgestellte Ansatz der magnetischen Assemblierung angewendet werden, um andere Open-Well-Systeme in den mikrofluidischen Modus zu versetzen.
Um die Rekonfigurationsfähigkeit zu erhalten, ist es notwendig, eine Strukturierungsschablone zu verwenden, die eine präzise Positionierung der Zellen auf der Membranoberfläche ermöglicht. Die Schablone stellt sicher, dass sich keine Zellen außerhalb des porösen Kulturbereichs (d. h. auf dem Siliziumstützbereich) befinden, die beim Einsetzen des Durchflussmoduls beschädigt werden können. Dieser Aspekt ist besonders in Co-Kulturmodellen von entscheidender Bedeutung, da Zellen, die versehentlich an unbeabsichtigten Stellen ausgesät werden, nicht aktiv an der Entwicklung des Barrieregewebes teilnehmen können. Nichtsdestotrotz werden diese fehlplatzierten Zellen in der Regel während des Lyseprozesses entnommen und können möglicherweise zu Verzerrungen in Genexpressionsstudien führen, die Interaktionen zwischen Zellen über die Membran hinweg untersuchen20. Die Open-Well-Zellaussaat mit der Schablone verbessert die Aussaateffizienz, indem sie Zellverluste entlang des Flusswegs mindert, die herkömmlichen mikrofluidischen Plattformen inhärent sind 4,16. Diese Plattform ist auch in der Lage, mehrere Zelltypen und ECM-Materialien 15,16,17 zu integrieren. Zum Beispiel kann ein zellbeladenes Hydrogel in den unteren Kanal des Geräts injiziert werden, um das Gewebekompartiment nachzuahmen, während ein Endothel auf der Membran aufgebaut wird.
Obwohl die Magnetmodule und -komponenten wiederverwendet werden können, kann die Aufrechterhaltung einer effektiven Abdichtung über mehrere Anwendungen hinweg ein Problem sein, da sich die Magnete im Gehäuse lösen und die Dichtungskraft verringern. Dieses Problem kann durch die Herstellung neuer laminierter Module für jedes Experiment oder die Massenproduktion von Komponenten mit Spritzguss- oder 3D-Drucktechniken gemildert werden, sobald die Entwürfe festgelegt sind. Bei dem in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wird das Durchflussmodul manuell in das Kernmodul eingesetzt, und die Multiplexing- und Automatisierungsfähigkeit des Systems ist begrenzt. Um den experimentellen Durchsatz zu verbessern, können Durchflussmodul und oberes Gehäuse in ein Funktionsmodul integriert werden, das interne Führungskanäle und standardisierte Schlauchverbindungen enthält, die mehrere Module gleichzeitig parallel durchbluten.
Komponenten des Open-Well-Core-Moduls werden in Massenproduktion hergestellt und sind kommerziell erhältlich. Andere Komponenten des Systems, wie das Durchflussmodul, die Gehäuse und die Strukturierungsschablone, können ebenfalls in großem Maßstab hergestellt werden. Darüber hinaus ermöglicht die Rekonfigurierbarkeit der Plattform das Hinzufügen von Sensoren und Aktoren (z. B. transendotheliales elektrisches Widerstandsmodul, Elektroporationsmodul) für Echtzeitstimulation und -messungen. Insgesamt kombiniert diese Plattform konventionelle und mikrofluidische Ansätze, um den weit verbreiteten Einsatz außerhalb von Ingenieurlabors zu unterstützen.
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Disclosures
J.L.M. ist Mitbegründer von SiMPore, Inc. und hält eine Beteiligung an dem Unternehmen. SiMPore kommerzialisiert die ultradünnen siliziumbasierten Technologien, einschließlich der in dieser Studie verwendeten Membranen.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde teilweise vom National Institute of Health unter den Fördernummern R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 und NSF-Zuschuss CBET 2150798 finanziert. Die Autoren danken dem RIT Machine Shop für die Herstellung von Aluminiumformen. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wieder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
| 1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
| 1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
| 21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
| 3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
| 3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
| AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
| Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
| Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
| Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
| Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
| Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
| Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
| Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
| PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
| Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
| SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
| Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
| Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
| TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
| Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
| uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
| uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |
References
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