Summary
Ce protocole décrit une plate-forme de culture cellulaire reconfigurable à base de membranes qui intègre le format à puits ouvert avec des capacités d’écoulement de fluide. Cette plateforme est compatible avec les protocoles standard et permet des transitions réversibles entre les modes de culture à puits ouvert et microfluidique, répondant aux besoins des laboratoires d’ingénierie et de biosciences.
Abstract
Les systèmes microphysiologiques sont des plateformes de culture cellulaire miniaturisées utilisées pour imiter la structure et la fonction des tissus humains en laboratoire. Cependant, ces plateformes n’ont pas été largement adoptées dans les laboratoires de biosciences où les approches membranaires à puits ouverts servent de référence pour imiter les barrières tissulaires, malgré l’absence de capacités d’écoulement des fluides. Ce problème peut être principalement attribué à l’incompatibilité des systèmes microphysiologiques existants avec les protocoles et outils standard développés pour les systèmes à puits ouverts.
Ici, nous présentons un protocole pour créer une plate-forme membranaire reconfigurable avec une structure à puits ouverts, une capacité d’amélioration de l’écoulement et une compatibilité avec les protocoles conventionnels. Ce système utilise une approche d’assemblage magnétique qui permet une commutation réversible entre les modes puits ouverts et microfluidique. Grâce à cette approche, les utilisateurs ont la possibilité de commencer une expérience dans le format de puits ouvert en utilisant des protocoles standard et d’ajouter ou de supprimer des capacités d’écoulement selon les besoins. Pour démontrer l’utilisation pratique de ce système et sa compatibilité avec les techniques standard, une monocouche de cellules endothéliales a été établie dans un format à puits ouvert. Le système a été reconfiguré pour introduire un flux de fluide, puis est passé au format à puits ouvert pour effectuer l’immunomarquage et l’extraction de l’ARN. En raison de sa compatibilité avec les protocoles conventionnels à puits ouverts et de sa capacité d’amélioration de l’écoulement, cette conception reconfigurable devrait être adoptée par les laboratoires d’ingénierie et de biosciences.
Introduction
Les barrières vasculaires servent d’interface critique qui sépare le compartiment sanguin des tissus environnants. Ils jouent un rôle essentiel dans la préservation de l’homéostasie en attirant les cellules immunitaires, en contrôlant la perméabilité moléculaire et en protégeant contre l’intrusion d’agents pathogènes dans les tissus 1,2. Des modèles de culture in vitro ont été développés pour imiter le microenvironnement in vivo, permettant des études systématiques sur les facteurs et les conditions qui ont un impact sur les propriétés de barrière à l’état sain et malade 3,4.
L’approche la plus largement utilisée pour de tels modèles de culture est la configuration « à puits ouvert »de type Transwell 5, où une membrane de culture poreuse et gravée sépare les compartiments remplis de milieux (Figure 1A). Dans ce format, les cellules peuvent être ensemencées de chaque côté de la membrane, et un large éventail de protocoles expérimentaux a été développé. Cependant, ces systèmes sont limités dans leur capacité à fournir les flux de fluides essentiels pour soutenir la maturation de la barrière et imiter la circulation des cellules immunitaires observée in vivo 5,6. Par conséquent, ils ne peuvent pas être utilisés pour des études nécessitant des écoulements dynamiques qui introduisent des doses de médicaments, une stimulation mécanique ou des contraintes de cisaillement induites par un fluide 6,7,8.
Pour surmonter les limites des systèmes à puits ouverts, des plateformes microfluidiques combinant des membranes de culture poreuses avec des canaux fluidiques adressables individuellement ont été développées9. Ces plates-formes offrent un contrôle précis de l’acheminement des fluides, de la perfusion et de l’introduction de composés chimiques, une stimulation contrôlée par cisaillement et des capacités d’ajout dynamique de cellules 7,10,11,12,13. Malgré les capacités avancées fournies par les plateformes microfluidiques, elles n’ont pas été largement adoptées dans les laboratoires de biosciences en raison de protocoles microfluidiques complexes et de leur incompatibilité avec les flux de travail expérimentaux établis 4,10,14.
Pour combler le fossé entre ces technologies, nous présentons un protocole qui utilise un système modulaire magnétiquement reconfigurable. Ce système peut être facilement commuté entre les modes puits ouvert et microfluidique en fonction des besoins spécifiques de l’expérience. La plateforme comprend un dispositif à puits ouvert, connu sous le nom de m-μSiM (système microphysiologique modulaire activé par une membrane de silicium), avec une membrane de culture de 100 nm d’épaisseur (nanomembrane). Cette nanomembrane possède une porosité élevée (15 %) et une transparence semblable à celle du verre, comme illustré à la figure 1B. Il sépare physiquement le compartiment supérieur d’un canal inférieur, permettant le transport moléculaire à travers des échelles de longueur physiologiques15. Contrairement aux membranes conventionnelles gravées par trace, qui présentent des défis connus pour l’imagerie des cellules vivantes avec l’imagerie en fond clair, les propriétés optiques et physiques favorables de la nanomembrane permettent une visualisation claire des cellules de chaque côté de la surface de la membrane 15,16,17.
Le présent protocole décrit la fabrication de modules d’ensemencement et d’écoulement spécialisés et explique la reconfiguration magnétique de la plate-forme. Il montre comment la plateforme peut être utilisée pour établir des barrières endothéliales dans des conditions statiques et dynamiques. Cette démonstration révèle que les cellules endothéliales s’alignent dans le sens du flux, avec une régulation à la hausse des cibles génétiques sensibles au cisaillement sous stimulation par cisaillement.
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Protocol
Cette conception peut être utilisée dans différents modes en fonction des exigences expérimentales et des préférences de l’utilisateur final. Avant chaque expérience, consultez l’organigramme de décision présenté à la figure 2 pour déterminer les étapes et les modules nécessaires au protocole. Par exemple, si l’utilisateur a l’intention de conserver le format à puits ouvert tout au long d’une expérience pour le comparer directement avec le système de type Transwell, le gabarit de motif n’est pas nécessaire pour l’ensemencement cellulaire. Le module de base est disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux), et la nanomembrane ultramince peut être sélectionnée parmi une bibliothèque de matériaux avec différentes porosités et tailles de pores pour répondre aux besoins expérimentaux.
1. Fabrication du pochoir à motifs
REMARQUE : Le pochoir de motif sert à positionner les cellules exclusivement sur la région poreuse de la puce à membrane, empêchant les cellules de se déposer sur la couche de silicium environnante où elles pourraient potentiellement subir des dommages après l’ajout du module de flux16 (voir Figure 3). Les dommages à la monocouche peuvent nuire à l’intégrité de la barrière et compromettre les résultats expérimentaux. Le pochoir n’est pas nécessaire dans une culture ouverte et statique, car il n’y a aucun risque de dommages.
- Achetez, usinez ou imprimez en 3D un moule à l’aide de la conception fournie dans le fichier de codage supplémentaire 1 (Figure 4A).
REMARQUE : Les parois du pochoir sont effilées pour augmenter la capacité du support et minimiser le piégeage des bulles par rapport aux caractéristiques à paroi droite à rapport d’aspect élevé. - Fixez un film adhésif sensible à la pression (PSA) de 130 μm sur une feuille acrylique de 3,2 mm à l’aide d’un rouleau froid (voir le tableau des matériaux).
- Découpez la feuille d’acrylique au laser selon le modèle fourni dans le fichier de codage supplémentaire 2 pour créer un ensemble de cavités (figure 4B).
- Décollez la couche protectrice du film PSA et fixez la feuille acrylique au moule.
REMARQUE : Assurez-vous que la feuille découpée au laser est alignée avec le moule afin que les caractéristiques du moule soient centrées dans la cavité (Figure 4C). La précision du positionnement des cellules sur la membrane dépend de cette étape. - Bien mélanger le prépolymère PDMS (en utilisant un rapport base/catalyseur de 10 :1) (voir tableau des matériaux) et le dégazer dans une chambre à vide jusqu’à ce qu’il ne reste plus de bulles visibles (5-15 min).
- Versez lentement le PDMS dans les cavités du moule, en le nivelant avec un bord plat.
REMARQUE : Pour éviter le piégeage des bulles, versez lentement le PDMS dans chaque cavité. Si des bulles sont présentes après le versement, placez le moule dans la chambre à vide et dégazez-le à nouveau. - Faites durcir le PDMS sur une plaque chauffante à 70 °C pendant 1 h, puis laissez-le refroidir à température ambiante.
- Extraire les pochoirs des cavités du moule à l’aide d’une pince à épiler à bout plat.
2. Fabrication du module d’écoulement
REMARQUE : Le module d’écoulement partage une empreinte similaire à celle du puits en forme de trèfle du module central et comprend un microcanal moulé (largeur = 1,5 mm, hauteur = 0,2 mm, longueur = 5 mm). La forme du trèfle aide à aligner le canal sur la région de culture poreuse (figure 5).
- Utiliser des techniques standard de lithographie douce18 pour créer un moule en silicium avec des caractéristiques définies par la conception fournie dans le fichier de codage supplémentaire 3 (figure 4D).
- Fixez un film PSA de 130 μm sur une feuille acrylique de 3,2 mm d’épaisseur.
- Découpez la feuille d’acrylique au laser en vous basant sur le dessin donné dans le fichier de codage supplémentaire 4 pour créer un ensemble de cavités en forme de trèfle (figure 4E).
REMARQUE : La hauteur de la cavité détermine la hauteur du module d’écoulement, qui doit être légèrement plus haute (de 0 à 0,1 mm) que la hauteur du puits du module central pour assurer une bonne étanchéité. - Retirez la couche protectrice du film PSA, puis fixez la feuille découpée au laser sur le moule en silicone en alignant les marques d’alignement triangulaires sur le moule en silicone avec celles de la feuille découpée au laser.
REMARQUE : Comme à l’étape 1.4, assurez-vous que la feuille acrylique découpée au laser est alignée avec le moule en silicone afin que les caractéristiques du moule soient centrées dans chaque cavité (Figure 4F). Cette étape détermine la position du microcanal par rapport à l’empreinte. - Versez lentement le PDMS dégazé sur les cavités du moule et nivelez-le avec un bord plat.
REMARQUE : Si des bulles sont présentes après avoir versé, dégazez le moule jusqu’à ce que les bulles soient éliminées. - Placez le moule sur une plaque chauffante et faites cuire le PDMS à 70 °C pendant 1 h, puis laissez refroidir le moule à température ambiante.
- Retirez délicatement les modules d’écoulement des cavités du moule à l’aide d’une pince à épiler à bout plat.
- Orientez le module d’écoulement avec les caractéristiques du microcanal vers le haut et positionnez les orifices d’entrée et de sortie du noyau à l’extrémité du canal à l’aide d’un poinçon de biopsie (voir le tableau des matériaux).
3. Fabrication de boîtiers acryliques inférieurs et supérieurs
REMARQUE : Le module central s’insère dans le boîtier inférieur. L’attraction entre les aimants intégrés dans les boîtiers comprime et scelle le module d’écoulement au module central (Figure 6).
- Découper au laser une feuille d’acrylique de 2 mm en utilisant le dessin fourni dans le fichier de codage supplémentaire 5 pour créer le boîtier supérieur avec des trous pour l’insertion de l’aimant.
- Fixez un film PSA de 130 μm sur une feuille acrylique de 3,5 mm.
- Découper au laser la feuille acrylique selon le dessin donné dans le fichier de codage supplémentaire 6 pour créer le boîtier inférieur avec des trous pour l’insertion de l’aimant.
REMARQUE : L’épaisseur du boîtier inférieur est un paramètre critique et doit correspondre à l’épaisseur totale du module central pour éviter les fuites pendant l’écoulement. - Retirez la couche protectrice PSA et fixez le boîtier inférieur à une lamelle en verre.
- Enfoncez à la presse des aimants en néodyme nickelé de 4,75 mm (voir tableau des matériaux) dans les trous découpés au laser des boîtiers.
REMARQUE : Assurez-vous que les aimants des boîtiers inférieur et supérieur sont placés avec une polarité opposée pour assurer l’attraction magnétique (Figure 6).
4. Fabrication du circuit d’écoulement
REMARQUE : Le circuit d’écoulement en boucle fermée contient deux flacons de prélèvement d’échantillons comme réservoirs (Figure 7). Le réservoir d’entrée est équipé d’un filtre au difluorure de polyvinylidène (PVDF) pour permettre au média cellulaire de s’équilibrer avec la concentration de CO2 dans l’incubateur.
- Utilisez un poinçon de biopsie de 1 mm pour créer deux trous dans le bouchon d’un flacon de prélèvement d’échantillon.
- Utilisez des poinçons de biopsie pour créer deux trous (1 mm et 4 mm) dans le bouchon d’un flacon de prélèvement d’échantillon séparé et créez un trou de 1 mm dans la partie inférieure de ce flacon.
- Insérez des pointes de distribution de 20 g dans chacun des trous de 1 mm et scellez-les avec de la colle chaude.
- Placez un filtre PVDF de 0,22 μm (voir tableau des matériaux) dans le trou de 4 mm et scellez-le avec de la colle chaude.
- Découper au laser une feuille d’acrylique de 1,5 mm en utilisant le dessin fourni dans le fichier de codage supplémentaire 7 pour créer une étape de maintien de l’échantillon.
- Positionnez les réservoirs sur la platine acrylique.
- Connectez les pointes de distribution à l’aide de tubes à micro-flux (voir tableau des matériaux).
- Reliez les tubes à l’entrée et à la sortie du module de débit à l’aide d’embouts de distribution de 21 G.
- Utilisez une pompe péristaltique (voir le tableau des matériaux) pour la circulation du débit.
REMARQUE : Des pompes à seringue ou pneumatiques peuvent également être utilisées pour introduire le débit si vous le souhaitez. Le débit doit être déterminé en fonction des besoins expérimentaux. Un tableau complet, dérivé d’un modèle COMSOL validé expérimentalement, est fourni dans le tableau supplémentaire 1 pour aider les utilisateurs à sélectionner le débit nécessaire pour obtenir la contrainte de cisaillement souhaitée au niveau de la monocouchede cellule 16.
5. Ensemencement cellulaire
REMARQUE : Semblable aux inserts de membrane conventionnels, différents types de cellules peuvent être cultivés sur la nanomembrane. Un type de cellule secondaire peut également être co-cultivé de l’autre côté de la membrane dans le canal inférieur15.
- Enduire la membrane de 5 μg/cm2 de fibronectine (voir le tableau des matériaux) à température ambiante pendant 1 h pour améliorer la fixation des cellules.
REMARQUE : Le type de cellule choisi peut influencer le revêtement et la densité cellulaire requis. La procédure décrite ici concerne les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC, voir Tableau des matériaux). - Aspirez la solution d’enrobage à l’aide d’une pipette P200 et placez un pochoir de motif dans le puits du module central.
- Ajoutez des supports cellulaires au puits et au canal inférieur de l’appareil.
- Semez des HUVEC à une densité de 40 000 cellules/cm2 dans le puits.
NOTE : Les HUVEC à cette densité forment généralement une monocouche confluente après 24 h d’incubation16,19. - Placez l’appareil dans une boîte de Pétri. Ajouter un bouchon de tube conique de 15 mL avec de l’eau DI dans la boîte de Pétri pour maintenir l’humidité locale.
- Transférez la boîte de Pétri dans l’incubateur.
REMARQUE : Les supports cellulaires dans le puits supérieur et le canal inférieur de l’appareil doivent être changés toutes les 24 heures. Pour changer le support dans le canal inférieur, injectez doucement un nouveau support dans l’un des ports pour déplacer l’ancien support de l’autre port.
6. Reconfiguration en mode microfluidique
- Stérilisez le boîtier supérieur, le boîtier inférieur, le module de débit, les réservoirs, les tubes et les embouts de distribution en les plaçant dans une chambre de stérilisation UV pendant 30 minutes avant l’assemblage. Faire circuler de l’éthanol à 70% puis du PBS stérile dans le circuit d’écoulement.
- Remplissez les réservoirs et les tubes avec un milieu de croissance des cellules endothéliales (voir le tableau des matériaux).
- Placez le boîtier inférieur sur la platine d’échantillonnage. Insérez le module à noyau à puits ouvert dans le boîtier inférieur.
- Aspirer le milieu cellulaire du puits du module. Placez le module d’écoulement dans le puits.
- Placez le boîtier supérieur pour bien sceller le module de débit dans le module central. Connectez les pointes de distribution d’entrée et de sortie aux ports du module de débit.
- Démarrez la pompe péristaltique pour introduire un écoulement de fluide dans le système.
7. Effectuer une analyse en aval sous forme de puits ouvert après l’introduction de l’écoulement
NOTE : Le temps de culture dépend ici des objectifs expérimentaux. Les utilisateurs peuvent effectuer des analyses en aval (par exemple, immunocytochimie, extraction d’ARN) dans des formats à puits ouvert ou microfluidiques selon leurs préférences. Par exemple, si un format à puits ouvert est préféré, le système doit être reconfiguré pour effectuer des analyses basées sur des protocoles standard 16,19.
- Arrêtez la pompe lorsque le temps souhaité pour l’exposition au flux de cisaillement est atteint. Retirez les embouts de distribution d’entrée et de sortie.
- Retirez le boîtier supérieur. Retirez délicatement le module d’écoulement du puits à l’aide d’une pince à épiler.
- Ajouter 100 μL de milieu cellulaire dans le puits. Effectuer les tests souhaités en fonction des protocoles standard.
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Representative Results
Le module central à puits ouvert est initialement positionné dans une cavité spécifique créée par un boîtier inférieur et une lamelle, comme illustré à la figure 6A. Ensuite, le module de flux, qui comprend un microcanal et des ports d’accès, est inséré dans le puits du module central. Le module d’écoulement est solidement scellé contre la couche de support en silicium de la membrane en raison de la force d’attraction magnétique entre les aimants intégrés dans les boîtiers inférieur et supérieur, comme illustré à la figure 6B. Pour évaluer l’efficacité de ce mécanisme de verrouillage magnétique, un test de pression d’éclatement a été effectué, démontrant que le système peut résister à des pressions d’impasse allant jusqu’à 38,8 ± 2,4 kPa. Cette tolérance à la pression dépasse considérablement les pressions de fonctionnement typiques rencontrées dans les applications de culture cellulaire. De plus, le système reste exempt de fuites lorsqu’il est soumis à des débits allant jusqu’à 4000 μL/min, ce qui équivaut à une contrainte de cisaillement de 74 dynes/cm2 dans la région de culture16.
Lors du développement d’une plate-forme capable de basculer entre les modes à puits ouvert et microfluidique, une attention particulière doit être accordée à l’approche d’ensemencement cellulaire, qui n’est généralement pas une préoccupation pour les plates-formes statiques à puits ouvertsconventionnelles 16. L’endommagement de la monocouche autour de la limite du canal pourrait introduire des complications dans les résultats expérimentaux20. Pour résoudre ce problème, un pochoir amovible a été conçu qui s’insère dans le puits ouvert du module central et fournit une fenêtre spécifique pour que les cellules se déposent préférentiellement à la surface de la membrane (Figure 3). Une fois que la monocouche cellulaire est structurée et atteint la confluence, l’utilisateur a la possibilité de poursuivre l’expérience dans le format à puits ouvert ou de reconfigurer la plate-forme en mode microfluidique pour exposer la monocouche cellulaire à une contrainte de cisaillement physiologique (Figure 3). Le mécanisme de verrouillage magnétique permet de basculer facilement entre les formats à puits ouvert et microfluidique selon les besoins. Par exemple, le dispositif peut être rétabli au format à puits ouvert après une stimulation de flux, offrant aux utilisateurs la possibilité d’effectuer une variété de tests (tels que l’immunomarquage, l’extraction d’ARN et les mesures de perméabilité moléculaire) en utilisant des protocoles expérimentaux standard15,16.
Dans le cadre physiologique du corps humain, la barrière vasculaire est exposée à un stress de cisaillement induit par l’écoulement, qui sert de signal biophysique clé qui affecte la structure et la fonction de la barrière 5,21,22. Ainsi, l’ajout d’un écoulement de fluide dans les systèmes microphysiologiques est une exigence clé. Pour démontrer la polyvalence de la plate-forme, une monocouche HUVEC a été établie dans un format à puits ouvert en utilisant des protocoles standard. Après 24 h de culture statique, la plateforme a été reconfigurée en mode microfluidique pour exposer la monocouche cellulaire à une contrainte de cisaillement de 10,7 dynes/cm2 pendant 24 h. Les résultats ont indiqué que les cellules cultivées sous flux étaient alignées le long de la direction du flux tandis que les cellules cultivées sans flux restaient orientées de manière aléatoire (Figure 8A,B). Après la stimulation par cisaillement, la plateforme a été reconfigurée au format à puits ouvert pour extraire l’ARN en utilisant des protocoles standard. Les résultats ont indiqué que l’exposition des cellules au stress de cisaillement entraînait la régulation positive du facteur 2 de type Kruppel (KLF2) et de l’oxyde nitrique synthase endothélial (eNOS), qui jouent des rôles essentiels tels que les fonctions anti-thrombotiques et athéroprotectrices dans les vaisseaux sanguins sains23,24 (Figure 8C).
Figure 1 : Comparaison de modèles de barrière vasculaire in vitro. Illustration schématique de (A) inserts conventionnels de type Transwell et (B) le m-μSiM à puits ouvert. Les images en fond clair d’une monocouche HUVEC confluente mettent en évidence la différence de qualité d’imagerie en fond clair entre une membrane gravée par trace et une nanomembrane ultrafine. Barres d’échelle = 100 μm. Adapté de Mansouri et al.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Organigramme de la prise de décision. Un organigramme basé sur les besoins expérimentaux et les préférences d’analyse en aval. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Flux de travail expérimental de la plateforme. (A) Pour positionner directement les cellules sur la membrane poreuse, un pochoir de motif amovible est inséré dans le puits du module central (l’encart montre les cellules à motifs, les lignes jaunes présentent les limites des microcanaux). (B) Le pochoir peut être conservé ou retiré dans l’appareil pour la culture cellulaire statique. (C) Pour reconfigurer la plate-forme en mode microfluidique, le pochoir est remplacé par le module de flux. Grâce au mécanisme d’étanchéité magnétique, la configuration est réversible ; Les boîtiers et le module de flux peuvent être retirés pour passer en mode puits ouvert. Barre d’échelle = 200 μm. Adapté de Mansouri et al.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Illustration schématique des moules. (A) Le moule au pochoir. (B) Feuille acrylique découpée au laser. (C) vue assemblée du moule au pochoir. (D) Moule de module d’écoulement. (E) Feuille acrylique découpée au laser. (F) Vue assemblée du moule du module d’écoulement. Les caractéristiques en forme de triangle sont des marques d’alignement pour faciliter la fixation des feuilles acryliques aux moules. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Schéma du module d’écoulement en forme de trèfle. (A) L’interface de contact entre le module d’écoulement et la puce à membrane. Les orifices d’entrée et de sortie pour l’écoulement du fluide sont indiqués en rose. (B) Image 3D du module d’écoulement PDMS. Adapté de Mansouri et al.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Assemblage magnétique pour la reconfiguration du dispositif. (A) Démonstration schématique des composants pour la reconfiguration du dispositif en mode microfluidique. Des aimants intégrés avec des pôles opposés induisent une attraction pour l’étanchéité. (B) Vue en coupe transversale du dispositif reconfiguré montrant le canal vasculaire en rose et le compartiment tissulaire en vert. Adapté de Mansouri et al.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Vue assemblée du circuit d’écoulement. Le circuit se compose d’une pompe péristaltique, de deux réservoirs pour l’alimentation des fluides cellulaires et des fluctuations d’amortissement, de tubes et d’une platine en acrylique pour maintenir les composants en place. Adapté de Mansouri et al.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Comparaison des HUVEC cultivés en mode puits ouvert et microfluidique. Les cellules ont été ensemencées et cultivées dans un puits ouvert pendant 24 heures pour établir une monocouche confluente. Au cours de la période de 24 h qui a suivi, un ensemble d’appareils a été reconfiguré en mode microfluidique. (A) Cellules cultivées sous écoulement (contrainte de cisaillement de 10,7 dynes.cm-2) alignées le long de la direction de l’écoulement (l’encart montre l’actine et les noyaux des cellules en vert et en bleu, respectivement). (B) Les cellules cultivées sans écoulement dans un format à puits ouvert n’ont montré aucun alignement. La longueur des barres dans les tracés radar indique le nombre de cellules dans la direction correspondante. (C) Les cellules cultivées sous flux ont montré une régulation positive plus élevée des gènes KLF2 et eNOS par rapport à la condition sans flux (**p < 0,01, n = 3, moyenne ± écart-type). Barres d’échelle = 100 μm. Adapté de Mansouri et al.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau supplémentaire 1 : Contrainte de cisaillement sur la surface de la nanomembrane à différents débits. Ce tableau fournit des informations sur les valeurs de contrainte de cisaillement sur la surface de la nanomembrane à différents débits. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier de codage supplémentaire 1 : Modèle CAO du moule à pochoir. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier de codage supplémentaire 2 : Modèle CAO de cavités découpées au laser pour le moule à pochoir. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier de codage supplémentaire 3 : Modèle CAO du module de flux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier de codage supplémentaire 4 : Modèle CAO de cavités découpées au laser pour le moule du module d’écoulement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier de codage supplémentaire 5 : Modèle CAO du boîtier supérieur. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier de codage supplémentaire 6 : Modèle CAO du boîtier inférieur. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier de codage supplémentaire 7 : Modèle CAO de la platine acrylique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
L’objectif de ce protocole est de développer une méthode pratique pour intégrer les capacités d’écoulement dans une plate-forme à puits ouvert dotée d’une nanomembrane ultrafine. Dans cette conception, une approche de verrouillage magnétique est utilisée, permettant de basculer entre les modes puits ouvert et fluidique pendant les expériences et combinant les avantages des deux approches. Contrairement aux plates-formes conventionnelles à liaison permanente, le verrouillage magnétique permet de démonter la plate-forme à des endroits pratiques pendant le flux de travail expérimental 16,25,26,27. Dans cette plate-forme, les cellules sont ensemencées et la barrière est établie dans le format familier à puits ouvert, puis le système est reconfiguré en mode fluidique en ajoutant simplement un module d’écoulement et en le scellant magnétiquement. Cette reconfiguration offre deux avantages clés : premièrement, elle permet de simuler les conditions physiologiques en exposant la monocouche cellulaire à une contrainte de cisaillement induite par un fluide ; Deuxièmement, il facilite l’introduction de composants secondaires comme les cellules immunitaires dans des conditions d’écoulement16. La fonction de verrouillage magnétique offre une méthode d’assemblage sans outil, permettant de basculer à la demande entre les formats à puits ouvert et microfluidique. Par conséquent, les analyses en aval, telles que l’immunocytochimie et l’extraction d’ARN, peuvent être effectuées dans le format familier à puits ouvert en utilisant des techniques standard ou en utilisant des techniques microfluidiques selon les besoins16.
L’étanchéité magnétique est un paramètre essentiel de la conception qui permet la reconfigurabilité de la plate-forme, et par conséquent, plusieurs considérations sont nécessaires pour son fonctionnement précis : (1) La hauteur du boîtier inférieur doit correspondre à la hauteur du module central (tolérance : ±0,1 mm) pour enfermer correctement le module. (2) La hauteur du module d’écoulement doit être légèrement supérieure à celle du puits du module central (0-0,1 mm). (3) Cette conception est adaptable à une large gamme de matériaux et n’exige pas que le module d’écoulement soit construit à partir de matériaux élastomères. L’élément crucial est d’incorporer un matériau souple semblable à un joint à l’interface entre le module de débit et la puce à membrane pour établir une étanchéité fiable. (4) Le diamètre des cavités découpées au laser dans les boîtiers des aimants à sertir est optimisé en fonction de l’instrument utilisé28. Les aimants peuvent se détacher et entraîner des fuites d’écoulement si le diamètre de la cavité est trop grand, ou les boîtiers peuvent se fissurer lors de l’insertion de l’aimant si les cavités sont trop petites. En suivant les considérations susmentionnées, l’approche d’assemblage magnétique présentée ici peut être appliquée pour reconfigurer d’autres systèmes à puits ouverts en mode microfluidique.
Pour avoir la capacité de reconfiguration, il est nécessaire d’utiliser un pochoir de motif qui permet un positionnement précis des cellules sur la surface de la membrane. Le pochoir garantit qu’aucune cellule ne se trouve en dehors de la région de culture poreuse (c’est-à-dire sur la région de support en silicium), qui peut être endommagée lors de l’insertion du module de flux. Cet aspect devient particulièrement crucial dans les modèles de co-culture car les cellules ensemencées par inadvertance dans des endroits non prévus ne peuvent pas participer activement au développement du tissu barrière. Néanmoins, ces cellules mal placées sont généralement récupérées pendant le processus de lyse et peuvent potentiellement introduire un biais dans les études d’expression génique qui étudient les interactions entre les cellules à travers la membrane20. L’ensemencement cellulaire à puits ouvert à l’aide du pochoir améliore l’efficacité de l’ensemencement en atténuant les pertes de cellules le long de la voie d’écoulement, qui sont inhérentes aux plates-formes microfluidiques conventionnelles 4,16. Cette plate-forme est également capable d’incorporer plusieurs types de cellules et de matériaux ECM 15,16,17. Par exemple, un hydrogel chargé de cellules peut être injecté dans le canal inférieur de l’appareil pour imiter le compartiment tissulaire pendant qu’un endothélium est établi au-dessus de la membrane.
Bien que les modules et composants magnétiques puissent être réutilisés, le maintien d’une étanchéité efficace sur plusieurs utilisations peut être un problème en raison du desserrage des aimants dans le boîtier et de la diminution de la force d’étanchéité. Ce problème peut être atténué en fabriquant de nouveaux modules laminés pour chaque expérience ou en produisant en série des composants à l’aide de techniques de moulage par injection ou d’impression 3D une fois les conceptions établies. Dans la méthode décrite dans ce protocole, le module de flux est placé manuellement dans le module central et la capacité de multiplexage et d’automatisation du système est limitée. Pour améliorer le débit expérimental, le module d’écoulement et le boîtier supérieur peuvent être intégrés dans un module fonctionnel contenant des canaux de routage internes et des raccords de tubes standardisés qui perfusent simultanément plusieurs modules en parallèle.
Les composants du module central à puits ouvert sont produits en série et disponibles dans le commerce. D’autres composants du système, tels que le module d’écoulement, les boîtiers et le pochoir de motif, peuvent également être fabriqués à grande échelle. De plus, la reconfigurabilité de la plate-forme permet l’ajout de capteurs et d’actionneurs (par exemple, module de résistance électrique transendothéliale, module d’électroporation) pour la stimulation et les mesures en temps réel. Dans l’ensemble, cette plateforme combine des approches conventionnelles et microfluidiques pour aider à soutenir une utilisation généralisée en dehors des laboratoires d’ingénierie.
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Disclosures
J.L.M. est cofondateur de SiMPore, Inc. et détient une participation dans la société. SiMPore commercialise les technologies à base de silicium ultramince, y compris les membranes utilisées dans cette étude.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée en partie par le National Institute of Health dans le cadre des subventions R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 et de la subvention CBET 2150798 de la NSF. Les auteurs remercient l’atelier d’usinage RIT pour la fabrication de moules en aluminium. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
| 1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
| 1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
| 21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
| 3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
| 3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
| AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
| Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
| Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
| Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
| Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
| Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
| Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
| Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
| PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
| Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
| SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
| Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
| Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
| TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
| Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
| uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
| uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |
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