Modellierung von Liganden in Karten aus der Elektronenkryomikroskopie

Summary

Dieses Protokoll stellt die Werkzeuge vor, die für die Modellierung von niedermolekularen Liganden in KryoEM-Karten von Makromolekülen zur Verfügung stehen.

Abstract

Die Entschlüsselung der Protein-Liganden-Wechselwirkungen in einem makromolekularen Komplex ist entscheidend für das Verständnis des molekularen Mechanismus, der zugrunde liegenden biologischen Prozesse und der Arzneimittelentwicklung. In den letzten Jahren hat sich die kryogene Probenelektronenmikroskopie (KryoEM) zu einer leistungsfähigen Technik entwickelt, um die Strukturen von Makromolekülen zu bestimmen und die Art der Ligandenbindung mit nahezu atomarer Auflösung zu untersuchen. Die Identifizierung und Modellierung von Nicht-Protein-Molekülen in KryoEM-Karten ist aufgrund der anisotropen Auflösung über das interessierende Molekül und des inhärenten Rauschens in den Daten oft eine Herausforderung. In diesem Artikel werden die Leser mit verschiedenen Softwares und Methoden vertraut gemacht, die derzeit zur Identifizierung von Liganden, zur Modellerstellung und zur Verfeinerung atomarer Koordinaten unter Verwendung ausgewählter Makromoleküle verwendet werden. Eine der einfachsten Möglichkeiten, das Vorhandensein eines Liganden zu identifizieren, wie am Enzym Enolase dargestellt, besteht darin, die beiden Karten zu subtrahieren, die mit und ohne Liganden erhalten wurden. Die zusätzliche Dichte des Liganden wird wahrscheinlich auch bei einem höheren Schwellenwert in der Differenzkarte hervorstechen. Es gibt Fälle, wie im Fall des metabotrope Glutamatrezeptors mGlu₅ gezeigt, in denen solche einfachen Differenzkarten nicht erstellt werden können. Die kürzlich vorgestellte Methode zur Ableitung der Fo-Fc-Omit-Map kann als Werkzeug zur Validierung und Demonstration des Vorhandenseins des Liganden dienen. Schließlich wird am Beispiel der gut untersuchten β-Galactosidase der Effekt der Auflösung auf die Modellierung der Liganden und Lösungsmittelmoleküle in KryoEM-Karten analysiert und ein Ausblick darauf gegeben, wie KryoEM in der Wirkstoffforschung eingesetzt werden kann.

Introduction

Zellen erfüllen ihre Funktionen, indem sie unzählige chemische Reaktionen gleichzeitig und unabhängig voneinander durchführen, die jeweils akribisch reguliert werden, um ihr Überleben und ihre Anpassungsfähigkeit als Reaktion auf Umwelteinflüsse zu gewährleisten. Dies wird durch die molekulare Erkennung erreicht, die es Biomolekülen, insbesondere Proteinen, ermöglicht, mit anderen Makromolekülen sowie kleinen Molekülen oder Liganden transiente oder stabile Komplexe zu bilden¹. Daher sind Protein-Liganden-Wechselwirkungen grundlegend für alle Prozesse in der Biologie, einschließlich der Regulation der Proteinexpression und -aktivität, der Erkennung von Substraten und Cofaktoren durch Enzyme sowie der Art und Weise, wie Zellen Signale wahrnehmen und weiterleiten ^1,2. Ein besseres Verständnis der kinetischen, thermodynamischen und strukturellen Eigenschaften des Protein-Liganden-Komplexes enthüllt die molekularen Grundlagen der Ligandeninteraktion und erleichtert auch ein rationales Wirkstoffdesign, indem die Wirkstoffinteraktion und Spezifität optimiert werden. Ein wirtschaftlicher und schnellerer Ansatz zur Untersuchung der Protein-Liganden-Wechselwirkung ist die Verwendung von molekularem Docking, einer computergestützten Methode, die virtuell eine Vielzahl kleiner Moleküle durchleuchtet und den Bindungsmodus und die Affinität dieser Liganden zu Zielproteinen vorhersagt³. Experimentelle Beweise aus hochauflösenden Strukturen, die durch Röntgenbeugung (XRD), Kernspinresonanz (NMR) oder Elektronenkryomikroskopie (KryoEM) bestimmt wurden, liefern jedoch den wesentlichen Beweis für solche Vorhersagen und helfen bei der Entwicklung neuerer und wirksamerer Aktivatoren oder Inhibitoren für ein bestimmtes Ziel. In diesem Artikel wird die Abkürzung "KryoEM" verwendet, da die Technik allgemein genannt wird. Es gibt jedoch eine anhaltende Debatte über die Wahl der richtigen Nomenklatur, und kürzlich wurde der Begriff Kryo-Gen-Probe Electron Microscopy (KryoEM) vorgeschlagen, um anzuzeigen, dass die Probe bei kryogener Temperatur ist und mit Elektronen abgebildet^{wird 4}. In ähnlicher Weise wurden die von der KryoEM abgeleiteten Karten als Elektronenpotential, elektrostatisches Potential oder Coulomb-Potential bezeichnet, und der Einfachheit halber verwenden wir hier die KryoEM-Karten 5,6,7,8,9,10.

Obwohl die XRD die Goldstandardtechnik bei der hochauflösenden Strukturbestimmung von Protein-Liganden-Komplexen war, hat die KryoEM nach der Auflösungsrevolution¹¹ an Dynamik gewonnen, wie der Anstieg der Coulomb-Potentialkarten oder KryoEM-Karten zeigt, die in den letzten Jahren in der Electron Microscopy Database (EMDB)^12,13 hinterlegt wurden¹⁴. Aufgrund von Fortschritten in der Probenvorbereitung, der Bildgebung und den Datenverarbeitungsmethoden stieg die Anzahl der Proteindatenbanken (PDB)¹⁴ mit KryoEM zwischen 2010 und 2020 von 0,7 % auf 17 %, wobei etwa 50 % der im Jahr 2020 gemeldeten Strukturen mit einer Auflösung von 3,5 Å oder besser bestimmt wurden^15,16. Die KryoEM wurde von der Strukturbiologie, einschließlich der pharmazeutischen Industrie, schnell übernommen, da sie die Untersuchung flexibler und nichtkristalliner biologischer Makromoleküle, insbesondere von Membranproteinen und Multiproteinkomplexen, mit nahezu atomarer Auflösung ermöglicht, den Prozess der Kristallisation überwindet und gut beugende Kristalle erhält, die für die hochauflösende Strukturbestimmung durch XRD erforderlich sind.

Eine genaue Modellierung des Liganden in der KryoEM-Karte ist von größter Bedeutung, da er als Bauplan des Protein-Liganden-Komplexes auf molekularer Ebene dient. Es gibt mehrere automatisierte Ligandenbildungswerkzeuge, die in der Röntgenkristallographie verwendet werden und von der Form und Topologie der Ligandendichte abhängen, um den Liganden in die Elektronendichte 17,18,19,20 einzupassen oder aufzubauen. Wenn die Auflösung jedoch kleiner als 3 Å ist, führen diese Ansätze tendenziell zu weniger wünschenswerten Ergebnissen, da die topologischen Merkmale, von denen sie für die Erkennung und Erstellung abhängen, weniger definiert sind. In vielen Fällen haben sich diese Methoden als unwirksam erwiesen, wenn es darum geht, Liganden genau in KryoEM-Karten zu modellieren, da diese Karten im niedrigen bis mittleren Auflösungsbereich bestimmt wurden, typischerweise zwischen 3,5 Å und 5 Ź⁷.

Der erste Schritt bei der 3D-Strukturbestimmung eines Protein-Liganden-Komplexes durch KryoEM besteht entweder darin, den Liganden mit dem Protein zu co-reinigen (wenn der Ligand eine hohe Bindungsaffinität zum Protein aufweist) oder die Inkubation der Proteinlösung mit dem Liganden für eine bestimmte Zeit vor der Gittervorbereitung. Anschließend wird ein kleines Probenvolumen auf ein plasmagereinigtes, löchriges TEM-Gitter aufgebracht, gefolgt von einem Schockfrosten in flüssigem Ethan und schließlich einer Bildgebung mit einem Kryo-TEM. Die 2D-Projektionsbilder von Hunderttausenden bis Millionen einzelner Teilchen werden gemittelt, um eine 3-dimensionale (3D) Coulomb-Potentialkarte des Makromoleküls zu rekonstruieren. Die Identifizierung und Modellierung von Liganden und Lösungsmittelmolekülen in diesen Karten stellt in vielen Fällen eine große Herausforderung dar, da die anisotrope Auflösung über die gesamte Karte (d. h. die Auflösung ist im gesamten Makromolekül nicht einheitlich), die Flexibilität in der Region, in der der Ligand gebunden ist, und das Rauschen in den Daten zu beachten ist. Viele der Modellierungs-, Verfeinerungs- und Visualisierungswerkzeuge, die für die XRD entwickelt wurden, werden nun für den Einsatz in der KryoEM für die gleichen Zwecke angepasst 18,19,20,21. In diesem Artikel wird ein Überblick über verschiedene Methoden und Software gegeben, die derzeit zur Identifizierung von Liganden, zum Aufbau von Modellen und zur Verfeinerung der aus der KryoEM abgeleiteten Koordinaten verwendet werden. Es wurde ein Schritt-für-Schritt-Protokoll erstellt, um die Prozesse bei der Modellierung von Liganden unter Verwendung spezifischer Protein-Liganden-Komplexe mit unterschiedlicher Auflösung und Komplexität zu veranschaulichen.

Der erste Schritt bei der Modellierung von Liganden in KryoEM-Karten umfasst die Identifizierung der Ligandendichte (Nicht-Protein) in der Karte. Wenn die Ligandenbindung keine Konformationsänderung im Protein induziert, dann hebt die Berechnung einer einfachen Differenzkarte zwischen dem Protein-Liganden-Komplex und dem Apo-Protein im Wesentlichen die Regionen mit zusätzlicher Dichte hervor, was auf das Vorhandensein des Liganden hindeutet. Solche Unterschiede können sofort beobachtet werden, da nur zwei Karten benötigt werden, und sogar Zwischenkarten während des Prozesses der 3D-Verfeinerung können verwendet werden, um zu überprüfen, ob der Ligand vorhanden ist. Wenn die Auflösung hoch genug ist (<3,0 Å), kann die Differenzkarte auch Einblicke in die Position von Wassermolekülen sowie von Ionen geben, die mit dem Liganden und den Proteinresten interagieren.

In Ermangelung der Apo-Protein-Karte ist es nun möglich, Servalcat²² zu verwenden, das als eigenständiges Tool verfügbar ist und im Rahmen der Refmac-Verfeinerung auch in die CCP-EM-Software-Suite ^23,24 und in CCP4 8.0 Release^25,26 integriert wurde. Servalcat ermöglicht die Berechnung einer FSC-gewichteten Differenzkarte (Fo-Fc) unter Verwendung der ungeschärften Halbkarten und des Apoproteinmodells als Eingabe. Die Fo-Fc-Auslassungskarte stellt die Diskrepanz zwischen der experimentellen Karte (Fo) und der vom Modell abgeleiteten Karte (Fc) dar. In Ermangelung eines Liganden im Modell deutet eine positive Dichte in einer Fo-Fc-Karte, die sich mit der experimentellen EM-Karte überschneidet, typischerweise auf das Vorhandensein des Liganden hin. Hier wird davon ausgegangen, dass die Proteinkette gut in die Karte eingepasst ist, und die verbleibende positive Dichte gibt an, wo sich der Ligand befindet. Es ist jedoch wichtig, akribisch zu untersuchen, ob die positive Dichte auf Modellierungsungenauigkeiten zurückzuführen ist, wie z. B. das falsche Rotamer einer Proteinseitenkette.

Der zweite Schritt besteht darin, aus den verfügbaren chemischen Informationen eine kartesische Koordinatendatei des Liganden mit wohldefinierter Geometrie zu erhalten oder zu erstellen. Standardliganden (z. B. ATP und NADP⁺), die bereits in der CCP4-Monomerbibliothek verfügbar sind, können zur Verfeinerung verwendet werden, indem die Koordinaten- und Geometriedateien über ihren Monomer-Zugangscode abgerufen werden. Für unbekannte oder nicht standardmäßige Liganden stehen jedoch verschiedene Werkzeuge zur Verfügung, um die Geometriedateien zu erstellen. Einige der Beispiele sind der eLBOW²⁷ - (Electronic Ligand Builder and Optimization Workbench) in Phenix²⁸, Lidia - ein eingebautes Tool in Coot²⁹, JLigand/ACEDRG^30,31, CCP-EM^23,24, Ligprep³² - ein Modul von Glide innerhalb der Schrödinger-Suite. Die Ligandenkoordinatendatei wird dann in die Dichte eingepasst, wobei sowohl die experimentelle KryoEM-Karte als auch die Differenzkarte in Coot verwendet werden. Darauf folgt die Realraumverfeinerung in Phenix²⁸ bzw. die reziproke Verfeinerung in Refmac³³. Voraussetzung ist eine Linux-Workstation oder ein Laptop, der mit einer guten Grafikkarte und der oben genannten Software ausgestattet ist. Die meisten dieser Programme sind in verschiedenen Suiten enthalten. CCP-EM²⁴ und Phenix²⁸ sind für akademische Benutzer frei verfügbar und enthalten eine Vielzahl von Tools, die in diesem Artikel verwendet werden, darunter Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine usw. In ähnlicher Weise bieten Chimera³⁷ und ChimeraX³⁸ kostenlose Lizenzen für akademische Benutzer.

Protocol

1. Modellierung von Phosphoenolpyruvat (PEP) in Enolase aus Mycobacterium tuberculosis

1. Identifizierung der Ligandendichte in der KryoEM-Karte des PEP-Enolase-Komplexes
   1. Laden Sie die ungeschärften Halbkarten (emd_30988_additional_1.map und emd_30988_additional_2.map) von Apo-Enolase aus den zusätzlichen Daten in EMDB herunter (siehe Materialtabelle).
   2. Öffnen Sie ChimeraX (siehe Materialtabelle). Öffnen Sie die Halbkarten von apo-enolase, indem Sie in der Symbolleiste auf Öffnen klicken und die Dateinamen auswählen. Geben Sie vop add #1 #2 in die Befehlszeile ein, um die beiden halben Maps zu kombinieren und die unscharfe Apo-Enolase-Karte zu erhalten.
      HINWEIS: #1 und #2 bezeichnen die beiden halben Karten für das apo-enolasische Enzym, wie in Schritt 1.1.1 erwähnt.
   3. Benennen Sie die kombinierte Map (ChimeraX-Map-ID: #3) um, indem Sie rename #3 Apo-enolase-unsharpened-map eingeben. Färbt die Karte in der Modellgruppe grau ein. Die Karte zeigt, dass Enolase in der Lösung mit D4-Symmetrie oktamer ist.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.1 bis 1.1.3 mit den folgenden Halbzuordnungen emd_30989_additional_1.map (Zuordnungs-ID: 4) und emd_30989_additional_2.map (Zuordnungs-ID: 5), um PEP-enolase-unsharpened-map (Zuordnungs-ID: #6) zu erhalten.
   5. Um eine Differenzkarte zu berechnen, passen Sie zunächst die beiden Maps (PEP-enolase und apo-enolase unsharpened maps aus Schritt 1.1.3 und Schritt 1.1.4) aneinander aneinander, indem Sie in ChimeraX im Map-Panel (Symbolleiste) auf Fit (map in map) klicken.
      HINWEIS: Zwischen den beiden Maps wird keine Normalisierung durchgeführt. In einigen Fällen kann eine Normalisierung erforderlich sein, um die Karten auf denselben Maßstab zu bringen.
   6. Subtrahieren Sie die PEP-enolase-Karte von der apo-enolase-Map, indem Sie vop subtract #6 #3 in die Befehlszeile eingeben.
      HINWEIS: #6 = PEP-enolasische ungeschärfte Karte, #3 = Apo-enolase ungeschärfte Karte.
   7. Färbe die subtrahierte Karte (Karten-ID:7) grün ein, was die positive Dichte angibt (gemäß der Konvention in der Röntgenkristallographie)³⁹.
   8. Laden Sie die Koordinaten von M. tuberculosis octameric enolase (PDB: 7e4x) aus der Protein Data Bank (PDB) herunter, klicken Sie in der Symbolleiste auf Öffnen und wählen Sie den Dateinamen aus.
   9. Benennen Sie das Modell in 7e4x.pdb um, indem Sie rename #8 Apo_enolase.pdb in die Befehlszeile eingeben. #8 bezeichnet die Apo_enolase.pdb in ChimeraX.
   10. Wählen Sie das Modell in der Modellgruppe aus. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Rechte Maus. Klicken Sie auf Molekül verschieben, um das Modell in der Nähe der PEP-Enolase-Karte (#6) zu positionieren und das Modell in Bezug auf die Karte auszurichten. Passen Sie dieses Modell in die PEP-enolase-unsharpened-map ein, indem Sie fit #8 in #6 in der Befehlszeile eingeben. Hier ist die Karte mit 6 und das Modell mit 8 nummeriert.
       HINWEIS: In einigen Fällen reicht die lokale Anpassung in ChimeraX möglicherweise nicht aus, um das Modell auszurichten. In diesen Fällen kann ein zusätzlicher Schritt der globalen Anpassung (DockinMap, siehe Materialtabelle) in Phenix durchgeführt werden.
   11. Speichern Sie das angepasste Modell, indem Sie save Apo-enolase.pdb #8 in die Befehlszeile eingeben.
2. Modellierung und Verfeinerung von PEP in der B-Faktor geschärften KryoEM-Karte des PEP-Enolase-Komplexes
   1. Öffnen Sie "coot" (siehe Materialtabelle) vom Terminal aus, indem Sie ./Coot & eingeben.
   2. Zeigen Sie "Apo-enolase.pdb" an, indem Sie auf Datei klicken > Koordinaten Apo-enolase.pdb öffnen. Die Koordinatendatei wird durch Bindungen (Farbe nach Atom) dargestellt.
   3. Laden Sie die PEP-gebundene Enolase sharpened map herunter, d.h. emd_30989.map von EMDB. Zeigen Sie dasselbe an, indem Sie auf Datei klicken > Karte öffnen > emd_30989.map . Stellen Sie den Schwellenwert auf 7,00 σ ein, indem Sie mit der mittleren Maustaste scrollen.
   4. Suchen Sie nach nicht modellierten Blobs, indem Sie auf > Nicht modellierten Blobs überprüfen > auf Blobs suchen klicken.
   5. Lokalisieren Sie die nicht modellierte Ligandendichte in der Nähe der Reste des aktiven Zentrums, Ser 42, Lys-386 und Arg-364 des Enolasemodells.
   6. Holen Sie sich die PEP-Monomer-Modelldatei aus der Coot-Monomer-Bibliothek, indem Sie auf Datei > Get Monomer klicken und PEP als 3-Buchstaben-Code eingeben.
   7. Verschieben Sie das PEP-Molekül auf die Dichte, indem Sie die Option Drehen/Verschieben- Zone/Kette/Molekül im Menü der Seitenleiste verwenden. Verwenden Sie die Realspace-Verfeinerung in Coot, um das PEP-Molekül in die Dichte einzupassen, indem Sie im Menü der Seitenleiste auf Real Space Refine Zone klicken. Führen Sie den angepassten Liganden mit der Apo-enolase.pdb zusammen, indem Sie die Option merge molecule auf der Registerkarte "Bearbeiten " verwenden. Speichern Sie das Modell unter dem Namen PEP-Enolase.pdb.
      HINWEIS: Man kann auch die Option Ligand> Jiggle-Fit Ligand verwenden, um den Liganden ebenfalls anzupassen.
   8. Um Liganden zu den restlichen Monomeren in der Koordinatendatei hinzuzufügen, klicken Sie auf Berechnen > NCS-Tools > NCS-Liganden. Ein separates Fenster mit dem Namen "NCS-bezogene Liganden suchen" wird angezeigt. Wählen Sie für die Option Protein mit NCS die Koordinatendatei Apo-enolase.pdb und die Ketten-ID A als NCS-Masterkette aus.
      1. Wählen Sie für das Molekül, das den Liganden enthält, die Datei Apo-enolase.pdb als Koordinatendatei und die Ketten-ID, J und die Restnummer 1 bis 1 aus. Klicken Sie auf Kandidatenstellen suchen. Es erscheint ein Fenster mit dem Namen "Angepasste Liganden" mit einer Liste der Kandidatenpositionen. Bewerten Sie die Passung, indem Sie auf die einzelnen Kandidatenliganden klicken, und analysieren Sie die Anpassung visuell.
         HINWEIS: In Servalcat/Refmac kann nur ein Monomermodell bereitgestellt werden, und die bei der Rekonstruktion verwendete Symmetrie kann angegeben werden, um ein erweitertes Modell zu erhalten.
   9. Eine zusätzliche Dichte für die Lösungsmittelmoleküle wurde auch in der Nähe des Liganden beobachtet. Hochauflösende Kristallstrukturen von Enolase aus verschiedenen Homologen deuten auf das Vorhandensein von zwei Mg²⁺ Ionen^40,41 hin, die wahrscheinlich die negative Ladung des Reaktionszwischenprodukts stabilisieren. Modellieren Sie zwei Mg²⁺-Ionen in der Dichte des aktiven Zentrums, indem Sie auf Atom platzieren am Zeiger klicken und MG aus der Liste Zeigeratomtyp auswählen.
      HINWEIS: Die Bindungsgeometrie und der Abstand können als Leitfaden für die Auswahl des Metallions verwendet werden. Im Fall von Mg²⁺ , das an Sauerstoffatome in Proteinresten gebunden ist, variiert der Bindungsabstand zwischen 2,1 Å und 2,4 Å bei einer oktaedrischen Geometrie. Bei Karten mit niedriger Auflösung ist die Koordinationssphäre jedoch oft unvollständig, und auch die Entfernung kann aufgrund von Einschränkungen in der Auflösung variieren.
   10. Schritt 1.2.8 wird wiederholt, um die Mg²⁺ -Ionen in die symmetriebezogenen Monomere aufzunehmen.
   11. Speichern Sie das Modell, indem Sie auf Datei > Koordinaten speichern > > Dateinamen auswählen klicken und Enolase+PEP+Mg.pdb eingeben.
   12. Öffnen Sie die Phenix-GUI (siehe Materialtabelle). Führen Sie einen realen Speichereinschränkungsauftrag mit Enolase+PEP+Mg.pdb und emd_30989.map als Eingabemodell bzw. Karte unter Verwendung von Standardparametern aus. Dieser Schritt wird iterativ mit Coot durchgeführt, um eine gute Anpassung des Kartenmodells und eine gute Geometrie zu erreichen.
       HINWEIS: Die unscharfe Differenzkarte wird verwendet, um das Vorhandensein eines Liganden zu demonstrieren, z. B. in einer Abbildung. Zu Modellierungszwecken wurde die geschärfte Karte mit dem B-Faktor verwendet, die empfohlen wird. Die geschärfte Karte mit dem B-Faktor kann auch zur Berechnung der Differenzkarte zu Demonstrationszwecken verwendet werden, im Gegensatz zur ungeschärften Karte. Wenn die Auflösung jedoch in dem Bereich, in dem der Ligand gebunden ist, niedriger ist, zeigt der einzelne B-Faktor, der zum Schärfen der gesamten Karte verwendet wird, die Ligandendichte möglicherweise nicht deutlich an.
3. Visualisierung und Figurengenerierung des modellierten Liganden
   1. Öffnen Sie das verfeinerte Enolase+PEP+Mg-Modell aus dem endgültigen Phenix-Verfeinerungsauftrag in PyMOL⁴² (siehe Materialtabelle), indem Sie auf Datei > Öffnen klicken und den Dateinamen auswählen.
   2. Laden Sie die emd-30989.map (PEP-bound sharpened map), indem Sie auf Datei > Öffnen klicken und den Dateinamen auswählen.
   3. Benennen Sie die Map in PEP-sharpened um, indem Sie auf Aktionen > Umbenennen gegen das emd_30989 Objekt klicken und PEP-sharpened eingeben.
      HINWEIS: In den meisten Fällen, z. B. in enolase, werden die Maps beim Öffnen in pymol normalisiert, da die Option zum Normalisieren von Maps in pymol standardmäßig aktiviert ist. Da KryoEM-Karten auf einem größeren Kasten zentriert sind, umfasst die Normalisierung alles in dem Kasten. So kann die Normalisierung vor dem Öffnen in pymol ausgeschaltet werden.
   4. Wählen Sie die Liganden aus, indem Sie auf Anzeige > Sequenz klicken.
   5. Geben Sie isomesh mesh_ligands, PEP-sharpened, 6.0, sele, carve=3.0 in die Befehlszeile ein und drücken Sie die Eingabetaste.
   6. Färben Sie das mesh_ligand blau, indem Sie auf das letzte Feld C neben dem mesh_ligand Objekt klicken.
   7. Zeigen Sie die Reste des aktiven Zentrums, Ser-42, Asp-241, Glu-283, Asp-310, Arg-364 und Lys-386, die mit PEP und Mg²⁺ in der Stick- bzw. Kugeldarstellung und dem Enzym Enolase in der Karikaturdarstellung interagieren.
   8. Raytrace, indem Sie ray 3600, 3600 eingeben, um Bilder in Publikationsqualität zu generieren und als PNG-Datei zu speichern, indem Sie auf Datei > Speichern klicken und PEP.png als Dateinamen auswählen.

2. Modellierung von Liganden im metabotrope Glutamatrezeptor mGlu₅

1. Identifizierung und Modellierung der Ligandendichte in der KryoEM-Karte von Agonisten und antagonistengebundenem mGlu₅
   1. Laden Sie die beiden Halbkarten zusammen mit den entsprechenden Koordinatendateien für jeden der Agonisten gebundenen (EMD-31536, 7fd8.pdb) und der antagonistisch gebundenen (EMD-31537,7fd9.pdb) mGlu_5-Komplexe herunter.
   2. Öffnen Sie ChimeraX
      1. Öffnen Sie die Koordinatendatei 7fd8.pdb, indem Sie auf Öffnen klicken und 7fd8.pdb auswählen.
      2. Geben Sie delete ligand in die Befehlszeile ein und drücken Sie die Eingabetaste.
      3. Verwenden Sie auf ähnliche Weise den Befehl delete/B , um die Kette B zu löschen.
         HINWEIS: Liganden und Ketten können gelöscht werden, indem Sie das Dropdown-Menü oben mit Auswählen und Aktionen > Atome/Bindungen > Löschen verwenden.
      4. Speichern Sie die unligandierte PDB, indem Sie Folgendes in die Befehlszeile eingeben: save 7fd8_noligand_chainA.pdb #1. #1 bezeichnet die Modell-ID.
      5. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.2.1 bis 2.1.2.4 für 7fd9.pdb.
   3. Öffnen Sie CCP-EM. Erstellen Sie ein neues Projekt mit dem Namen mGlu₅ und geben Sie das Projektverzeichnis und den Benutzernamen an.
      1. Öffnen Sie Relion über die Optionen auf der linken Seite.
         1. Gehen Sie zur Registerkarte Maskenerstellung .
         2. Geben Sie eine der Halbkarten für EMD-31536 als Eingang an.
            HINWEIS: Relion akzeptiert Maps mit .mrc als Suffix, und die EMD-Maps haben das Suffix .map. Die Map-Dateien können in ChimeraX zur Überprüfung geöffnet und im .mrc-Format gespeichert werden.
         3. Geben Sie auf der Registerkarte "Maske " die Pixelgröße auf 0,89 Å und den anfänglichen Binarisierungsschwellenwert auf 0,007 an.
         4. Führen Sie den Auftrag mit dem Alias 31536 (oder einem anderen Namen, der leicht zu verfolgen ist) aus.
         5. Erstellen Sie auf ähnliche Weise eine Maske für die halbe Karte EMD - 31537.
      2. Öffnen Sie das Programm Refmac Servalcat über die Optionen im linken Bereich in CCPEM.
         1. Geben Sie den Namen als mGlu₅_agonist an.
         2. Importieren Sie die 7fd8_noligand_chainA .pdb-Datei, wie im Modellabschnitt 2.1.2.4 beschrieben. Geben Sie die Position der beiden halben Maps und der entsprechenden Maske an, die in Relion erstellt wurde.
         3. Geben Sie die Auflösung mit 3,8 Å an.
         4. Gehen Sie zu den Verfeinerungseinstellungen > Strikte Symmetrie und geben Sie C2 als Relion-Punktgruppensymmetrie an.
         5. Starten Sie das Programm, indem Sie die Starttaste oben drücken.
   4. Sobald der Job abgeschlossen ist, öffnen Sie das Ergebnis in Coot (Option oben im Ergebnisbereich verfügbar). Dadurch wird standardmäßig eine diffmap.mtz in Coot angezeigt, wobei die Farben Rot und Grün negative bzw. positive Dichten anzeigen.
      1. Gehen Sie im Darstellungsmanager > Eigenschaften der Differenzkarte mit der Bezeichnung DELFWT PHDELWT und ändern Sie die Konturebene auf 4,0 (absoluter Wert).
         HINWEIS: Die Wahl des Schwellenwerts hängt von der Karte und der Auflösung ab.
      2. Blenden Sie die Map mit der Bezeichnung FWT PHWT und das Molekül mit der Bezeichnung refined.pdb aus.
      3. Bewegen Sie die Karte mit der Maus, um die positive Dichte (grün) zu visualisieren und den größeren Blob in die Mitte zu bringen.
      4. Gehen Sie zu Datei > Monomer abrufen, geben Sie QUS ein und drücken Sie die Eingabetaste.
      5. Gehen Sie zu Berechnen > Modellierung > Starrkörper-Fit-Moleküls und doppelklicken Sie auf das QUS-Monomer , um das Molekül so anzupassen, dass es in die Fo-Fc-Dichte passt.
      6. Verwenden Sie die Option Molekül zusammenführen auf der Registerkarte Bearbeiten , um das QUS-Molekül zur Koordinatendatei refined.pdb hinzuzufügen.
      7. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.4.3 bis 2.1.4.6, um den Liganden mit dem Monomercode NAG und CHS in den kleineren Blob in der extrazellulären bzw. an den oberen Rand der Transmembrandomäne einzupassen.
      8. Speichern Sie die Koordinate als refined_ligands.pdb.
         HINWEIS: Die Auflösung der Transmembran (TM)-Domäne ist geringer und wird daher hier nicht diskutiert.
2. Verfeinerung der ligandierten Struktur von mGlu₅
   1. Öffnen Sie CCPEM , klonen Sie den vorherigen Verfeinerungsauftrag (Schritt 2.1.3.2) und führen Sie ihn mit der Datei refined_ligands.pdb und der Sharpened Map (emd. 31536.mrc) als Eingabe unter Verwendung von Standardparametern und C2-Symmetrie.
      HINWEIS: Wenn das Programm den Liganden nicht erkennt, müssen die CIF-Dateien bereitgestellt werden. Diese CIF-Dateien können von der PDB heruntergeladen oder mit verschiedenen Programmen erzeugt werden (siehe Schritt 3.1.1 für Details).
3. Visualisierung und Figurengenerierung in PyMOL
   1. Öffnen Sie das Modell refined_expanded.pdb aus dem neuesten Refmac-Einschränkungsauftrag in PyMOL.
   2. Gehen Sie zu Datei > Öffnen und navigieren Sie zum Refmac-Auftragsverzeichnis, um die Datei diffmap_normalised_fofc.mrc (Differenzzuordnung zum Servalcat-Auftrag in Schritt 2.1.3.2) zu laden.
      HINWEIS: Wenn die Dateien mit der Erweiterung .mrc beim Surfen nicht sichtbar sind, ändern Sie den Dateityp in Alle Dateien und durchsuchen Sie sie.
   3. Wählen Sie die Liganden über die Anzeige > Sequenz aus.
   4. Gehen Sie zur Schaltfläche Aktionen und benennen Sie die Auswahl in Liganden um.
   5. Geben Sie Folgendes in die Befehlszeile ein und drücken Sie die Eingabetaste: isomesh mesh_ligands, diffmap_normalised_fofc, 6.0, ligands, carve=2.5.
      HINWEIS: Die Maschenweite kann angepasst werden. Hier wird eine Maschenweite von 0,2 verwendet, die mit dem folgenden Befehl eingestellt wird: set mesh_width=0,2.
   6. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eines der Monomere und gehen Sie zu Kette > Farbe, um die Farbe jedes Monomers anzugeben. Färben Sie den Liganden und das Netz mit dem letzten Feld mit der Bezeichnung c in den Objekten Ligand und mesh_ligands ein. Das mGlu 5-Rezeptor-Dimer ist in einer Cartoon-Darstellung dargestellt, und die Monomere sind in Blaugrün und Weizen gefärbt. Die Liganden werden im Stick dargestellt, und das Netz, das die Liganden konturiert, ist grün gefärbt.
   7. Verwenden Sie die Aktionen > Option Ausrichten/Zentrieren/Zoomen gegen die Objekte und passen Sie sie manuell an, um das Netz klar und deutlich zu visualisieren. Wählen Sie die nahe gelegenen Reste aus, die mit dem Liganden interagieren könnten, z. B. Tyr64, Trp100 für QUS, und zeigen Sie bei Bedarf ihre Seitenkette oder Hauptkette oder beide als Stick-Darstellung an.
   8. Raytrace, um hochauflösende Bilder zu generieren und als PNG-Datei zu speichern.
      HINWEIS: Die obigen Schritte werden für die antagonistengebundene Karte EMD-31537 und die entsprechende Koordinatendatei PDB-7fd9 wiederholt.

3. Modellierung des Inhibitors, des Desoxygalacto-Nojirimycins (DGN) und der Lösungsmittelmoleküle in einer hochauflösenden, geschärften Karte der β-Galactosidase

1. Identifizierung des Liganden DGN anhand der Halbkarten aus der KryoEM
   1. Erstellung eines unbekannten Ligandenwörterbuchs für die Modellierung [Deoxygalacto-nojirimycin(DGN)]
      HINWEIS: Die Deoxygalacto-nojirimycin-Wörterbuchdatei ist in der CCP4-Monomerbibliothek als DGJ (3-Buchstaben-Liganden-ID) enthalten. Nichtsdestotrotz wird es hier als neuer und unbekannter Ligand betrachtet, um den Prozess der Generierung von Wörterbuchdateien für unbekannte Liganden zu veranschaulichen, DGN wird als 3-Buchstaben-Code verwendet.
      1. Öffnen Sie die Zusammenfassung der Verbindung für Deoxygalacto-nojirimycin (DGN) auf der PubChem-Webseite, und kopieren Sie die Zeichenfolge für die Verbindung Deoxygalacto-nojirimycin.
      2. Öffnen Sie Phenix > Liganden > eLBOW.
      3. Geben Sie die Zeichenfolge "smiles" als Eingabe an.
      4. Geben Sie eine geeignete Methode zur Optimierung des Ligandenaufbaus an. Hier kommt eine einfache Optimierung zum Einsatz.
      5. Fügen Sie die Zeichenfolge "Chemical Smiles" in den Abschnitt "Ligandendefinition" ein.
      6. Geben Sie eine Stellenbezeichnung, ein Präfix für die Ausgabedatei und eine Liganden-ID entsprechend an, und drücken Sie auf Ausführen.
         HINWEIS: Die Ausgabe des Auftrags enthält eine Koordinatendatei (DGN.pdb) und eine Wörterbuchdatei (DGN.cif). Jligand²⁹ kann auch verwendet werden, um die cif-Datei zu erstellen.
   2. Laden Sie die β-Galactosidase-Koordinatendatei (6tsh.pdb) aus der PDB herunter und entfernen Sie die Koordinaten für die Proteinketten (B, C, D), Liganden, DGN und andere Lösungsmittelmoleküle, indem Sie einen Texteditor verwenden oder die Option zum Löschen von Kette/Zone in Coot verwenden. Speichern Sie die Koordinatendatei als apo-betaGal_chainA.pdb.
      HINWEIS: ChimeraX oder Pymol können auch verwendet werden, um das Liganden-/Lösungsmittelmolekül zu entfernen.
   3. Laden Sie die halben Karten (emd_10563_half_map_1.map und emd_10563_half_map_2.map) aus zusätzlichen Daten des EMD-10563-Eintrags aus der EMDB herunter.
   4. Öffnen Sie CCPEM und verwenden Sie Relion , um die Maske für die Karte bei einem Schwellenwert von 0,01 zu erstellen (wie in den Schritten 2.1.3.1.1 bis 2.1.3.1.4 beschrieben).
   5. Führen Sie Servalcat (innerhalb der CCPEM-Suite, wie in Schritt 2 beschrieben) mit den in Schritt 3.1.3 erhaltenen Halbzuordnungen und dem Apo-Modell in Schritt 3.1.2 und der D2-Symmetrie aus.
      HINWEIS: Das Modell muss an einer der halben oder vollständigen Karten ausgerichtet werden, um die Ligandendichte zu lokalisieren. Dies kann erreicht werden, indem das Modell mit ChimeraX in die Karte eingepasst und dann die Koordinaten relativ zur Halbkarte gespeichert werden. In diesem Beispiel haben halbe Maps und die primäre Map in EMDB unterschiedliche Boxgrößen/Gitternetze, und das Modell muss in der halben Map platziert werden.
   6. Öffne das Blässhuhn.
      1. Öffnen Sie DGN.cif für das Ligandenwörterbuch, wie es in Schritt 3.1.1 mit Phenix eLBOW generiert wurde. Gehen Sie dazu zu Datei > CIF-Wörterbuch importieren und durchsuchen Sie das eLBOW-Job-Verzeichnis.
      2. Öffnen Sie die Protein- und Ligandenkoordinatendateien, apo-betaGal_chainA.pdb aus Schritt 3.1.2 bzw. DGN.pdb aus Schritt 3.1.6.
      3. Öffnen Sie automatisch die Datei diffmap.mtz aus dem Servalcat-Auftrag (Schritt 3.1.5), und visualisieren Sie die Map mit der Bezeichnung DELFWT PHDELWT in Coot. Konturieren Sie das Map bei einem Schwellenwert von ~ 4 absolutem Wert.
         HINWEIS: Es ist wichtig, die Zuordnungsstatistiken zu überprüfen, indem Sie die Kopfzeile map.mrc eingeben oder Werkzeuge in Chimera verwenden. Alle notwendigen Informationen über die Pixelgröße, die Boxgröße, die minimale, mittlere und maximale Dichte sowie die Effektivabweichung von der mittleren Dichte können abgerufen werden. Es ist wichtig, die Pixelgröße und die Boxgröße der KryoEM-Karten zu überprüfen. Die 3D-Karte stellt das Protein-Liganden-Kartenvolumen in einem Gitter von 3D-Voxeln dar. In jedem Voxel wird der Elektronenpotentialwert oder die Wahrscheinlichkeit, das Elektron an diesem Ort zu finden, gespeichert. Wenn ein bestimmter Schwellenwert ausgewählt wird, werden die Voxel, deren Dichte niedriger als der angegebene Wert ist, auf Null gesetzt. Dies trägt dazu bei, das experimentelle Rauschen in der Karte zu minimieren und die Kartenmerkmale besser zu visualisieren⁴³. Daher sollte die Karte an einem Schwellenwert konturiert werden, bei dem die Kartenmerkmale gut sichtbar sind und das Rauschen in der Karte minimal ist.
      4. Gehen Sie zu Ligand > Liganden suchen. Wählen Sie im neuen Fenster, das angezeigt wird, den Liganden, die Differenzkarte und das Modell apo-betaGal_chainA.pdb aus. Belassen Sie die Standardeinstellungen für die anderen Optionen und klicken Sie auf Liganden suchen , um die Suche zu starten.
      5. Eine Liste der Top-Treffer, die die potenzielle Ligandendichte anzeigen, wird angezeigt, wobei in jeder der Dichten eine Kopie platziert wird. Überprüfen Sie manuell alle Treffer, bei denen der Ligand platziert wurde. Behalten Sie die wahrscheinlichsten Treffer bei und entfernen Sie die mehrdeutigen.
         HINWEIS: Der Unterschied in der Kartendichte bei einem hohen Schwellenwert deutet eindeutig auf das Vorhandensein des Liganden im aktiven Zentrum hin.
2. Modellierung des Liganden DGN und der Lösungsmittelmoleküle
   1. Führen Sie eine reale Raumverfeinerung in Coot durch, um den Liganden (DGN.pdb) in die Differenzdichtekarte einzupassen, und führen Sie dann die Ligandenkoordinaten mit der apo-betaGal_chainA.pdb zusammen, und speichern Sie sie als betaGal_chainA+ligand.pdb.
      HINWEIS: Die Liganden, die in Bereichen anderer Ketten platziert wurden, können entfernt werden und werden beim Speichern der zusammengeführten Koordinatendatei nicht zusammengeführt. Die Liganden in anderen Ketten können von NCS-Liganden erzeugt werden, wie in Beispiel 1, Schritt 1.2.8 gezeigt, oder in Refmac/Servalcat unter Verwendung der Symmetrieerweiterung.
   2. Führen Sie einen weiteren Servalcat-Auftrag wie oben (Schritt 3.1.5) mit betaGal_chainA+ligand.pdb als Eingabemodell und den Halbzuordnungen (aus Schritt 3.1.3) mit D2-Symmetrie aus.
   3. Die Differenzdichte (aus dem Servalcat-Job in Schritt 3.2.2), die den modellierten Liganden umgibt, deutet auf das Vorhandensein der Lösungsmittelmoleküle hin, die mit dem Ligandenmolekül koordiniert sind. Die zentrale Dichte in der Nähe des Liganden scheint für Wassermoleküle zu groß zu sein.
   4. Basierend auf früheren biochemischen und strukturellen Daten, die auf das Vorhandensein von Mg²⁺ an dieser Position hinweisen, wird das Mg²⁺ -Ion hier modelliert, indem auf die Option Atom platzieren geklickt und das Atom als MG angegeben wird.
   5. Modellieren Sie Wassermoleküle in der Differenzdichte im aktiven Zentrum, die auf das Vorhandensein eines Lösungsmittelmoleküls hinweisen, indem Sie auf das Atom am Zeiger platzieren klicken und Wasser auswählen.
      HINWEIS: Coot hat auch die Möglichkeit, Wassermoleküle automatisch aufzunehmen. Da hier der Fokus nur auf dem aktiven Zentrum liegt, werden Wassermoleküle manuell zugegeben.
   6. Führen Sie die Koordinaten für Mg²⁺ und Wasser mit der Datei betaGal+ligand.pdb zusammen und speichern Sie sie als betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb.
   7. Führen Sie mit betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb eine Refmac-Verfeinerung in Servalcat mit D2-Symmetrie durch.
      HINWEIS: Die ausgegebene Differenzkarte aus diesem Job kann als Mittel zur Validierung dienen, um zu überprüfen, ob der Ligand genau modelliert wurde, da die Differenzkarte eine minimale verbleibende positive oder negative Dichte aufweisen sollte.
3. Visualisierung und Figurengenerierung mit PyMOL
   HINWEIS: Die unten beschriebenen Schritte sind einige Beispiele für die Erstellung von Abbildungen unter Verwendung von Modellen und Karten, die zur Veranschaulichung des Vorhandenseins von Liganden und Lösungsmitteln verwendet werden können.
   1. Öffnen Sie die refined_expanded.pdb aus dem letzten Servalcat-Auftrag (Schritt 3.2.6) mit dem modellierten Liganden und Lösungsmittel.
   2. Wählen Sie verschiedene Ketten separat aus, um sie magenta, gelb, grün und blaugrün zu färben, wie in Beispiel 2 beschrieben.
   3. Wechseln Sie zu > Sequenz anzeigen, treffen Sie eine separate Auswahl für die Wassermoleküle, Magnesium und DGN, und benennen Sie die Objekte in Wasser, MG bzw. DGN um.
   4. Zeigen Sie MG- und Wassermoleküle als Kugeln an, indem Sie die Objekte auswählen, mit der rechten Maustaste klicken und > Kugel anzeigen. Zeigen Sie auf ähnliche Weise den Liganden in der Stick-Darstellung an und färben Sie die Liganden und Lösungsmittel entsprechend ein. In diesem Fall wurde der Ligand von einem Heteroatom gelb gefärbt, das Magnesiumion ist violett gefärbt und Wassermoleküle sind rot gefärbt.
   5. Wählen Sie DGN-, MG- und Wassermoleküle aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, wählen Sie Aktionen > Kopieren in Objekt aus, und benennen Sie es als Liganden.
   6. Öffnen Sie die Datei diffmap_normalised_fo.mrc aus dem Servalcat-Auftrag in Schritt 3.2.6, und benennen Sie sie in ligand_fo.mrc um. Geben Sie den folgenden Befehl ein: isomesh mesh_ligands_fo, ligand_fo, 3, ligands, carve=2.
      HINWEIS: Die Carve-Option von 2 Å wird um die Atome herum angewendet, und je nach Auflösung und Qualität der Maps können Werte von 3-5 verwendet werden. Darüber hinaus ist es ratsam, beim Öffnen von KryoEM-Karten in PyMOL normalize_ccp4_maps aus zu stellen.
   7. Verwenden Sie die Aktionen > Ausrichtungs-/Zoomoptionen und passen Sie sie manuell an, um die Liganden und nahe gelegene wechselwirkende Reste (sofern zutreffend) zu visualisieren, wie in Schritt 2.3.7 gezeigt.
   8. Führen Sie Raytracing für diese Szenen durch, um hochauflösende Bilder mit dem Befehl ray 3600, 3600 zu speichern.
   9. Speichern Sie die Szene als .png Datei.
      HINWEIS: Die folgenden Schritte sind optional und beschreiben den Prozess zur Visualisierung (1) der Differenzdichte (Fo-Fc) für den nicht modellierten Liganden DGN, (2) der Dichte (Fo) des modellierten Liganden DGN sowie der Differenzdichte (Fo-Fc) für nicht modellierte Lösungsmittel und schließlich für (3) die Dichte (Fo) für den modellierten Liganden DGN und die Lösungsmittelmoleküle im aktiven Zentrum.
   10. Um das Vorhandensein des Liganden, DGN und der umgebenden Lösungsmittelmoleküle anhand der Differenzkarte zu demonstrieren, öffnen Sie diffmap_normalised_fofc.mrc aus dem Servalcat-Job in Schritt 3.1.5. Benennen Sie die Zuordnungsdatei in unliganded_fofc.mrc um, indem Sie neben dem Zuordnungsobjekt auf Aktionen > Umbenennen klicken. Geben Sie Folgendes in die Befehlszeile ein: isomesh mesh_ligands_fofc, unliganded_fofc, ligands, level=6, carve=2.
   11. Um die Dichte des modellierten Liganden DGN und die umgebende nicht modellierte Lösungsmitteldichte zu demonstrieren, öffnen Sie die diffmap_normalised_fo.mrc sowie die diffmap_normalised_fofc.mrc aus dem servalcat-Job in Schritt 3.2.2. Benennen Sie die diffmap_normalised_fo.mrc in DGN_fo und die diffmap_normalised_fofc.mrc in DGN_unmodelled_solvents_fofc um.
   12. Wählen Sie MG und Wasser aus > Sequenz anzeigen, klicken Sie mit der rechten Maustaste, wählen Sie Aktionen > Kopieren in Objekt aus, und benennen Sie sie als Lösungsmittel.
   13. Geben Sie Folgendes in die Befehlszeile ein: isomesh mesh_DGN_fo, DGN_fo, DGN, level=3, carve=2; isomesh mesh_solvent_fofc, DGN_unmodelled_solvents_fofc, solvents, level=6, carve=2.
       HINWEIS: Die mesh_DGN_fo zeigt die Dichte des Liganden an, und die mesh_solvent_fofc zeigt die Auslassungsdichte für MG und Wasser an.
   14. Um schließlich die modellierten Liganden sowie die umgebenden Lösungsmittelmoleküle im aktiven Zentrum zu visualisieren, öffnen Sie die diffmap_normalised_fo.mrc aus dem Servalcat-Auftrag in Schritt 3.2.6, und benennen Sie sie in ligand_fo.mrc um.
   15. Geben Sie folgendes in die Befehlszeile ein: isomesh mesh_ligand_fo, ligand_fo, selection=ligands, level=3, carve=2.
       HINWEIS: Hier haben wir diffmap_normalised_fo.mrc verwendet, aber die endgültige geschärfte Karte kann verwendet werden, um die Dichte der Liganden und die umgebenden Reste zu zeigen. Es empfiehlt sich, den verwendeten Map-Typ, die Werte für die Schärfung des B-Faktors, in der Abbildungslegende zu erwähnen.
   16. Die Netzbreite und die Kugelgröße können durch Eingabe der folgenden Befehle eingestellt werden: Legen Sie mesh_width=0,2 fest und setzen Sie sphere_scale=0,25 , um die Kugelgröße zu verkleinern.
   17. Färben Sie das FO-Netz blau und das FOFC-Netz grün.
   18. Verwenden Sie die Aktionen > Ausrichtungs-/Zoomoptionen und passen Sie sie manuell an, um die Liganden und nahe gelegene wechselwirkende Reste (wo zutreffend) zu visualisieren, wie in Schritt 2.3.7 gezeigt.
   19. Führen Sie Raytracing für diese Szenen durch, um hochauflösende Bilder mit dem Befehl ray 3600, 3600 zu speichern.
   20. Speichern Sie die einzelnen Szenen als .png Dateien.

4. Einfluss der Auflösung auf die Ligandenmodellierung in β-Galactosidase

1. Öffnen Sie Terminal und gehen Sie in das Verzeichnis, das die beiden halben Maps enthält.
2. Öffnen Sie die beiden Halbkarten (Schritt 3.1.3) im .map-Format in ChimeraX, visualisieren Sie sie und speichern Sie sie als emd10563_half1_1_unfil.mrc und emd10563_half2_1_unfil.mrc.
3. Die in Schritt 3.1.4 erstellte Maske kann als Eingabe verwendet werden.
4. Führen Sie einen PostProcessing-Job in Relion mit Halbzuordnungen und Masken aus den Schritten 4.2 bis 4.3 mit den Standardparametern aus.
5. Wiederholen Sie Schritt 4.4, jetzt mit aktiviertem Skip FSC-Wiegen und Angabe eines Ad-hoc-Tiefpassfilters von 3 Å.
6. Wiederholen Sie den Schritt 4.4 mit einem Ad-hoc-Tiefpassfilter von 3,5 Å.
7. Öffnen Sie die Maps (postprocess.mrc) aus den Schritten 4.4 bis 4.6, filtern Sie mit unterschiedlichen Auflösungen, und die Modellkoordinate 6tsh.pdb (ausgerichtet an den Halbmaps in ChimeraX) aus Schritt 3.1.2 in PyMOL. Benennen Sie die verschiedenen Maps in 3.0, 3.5 und 2.3 um, je nach Auflösung.
   HINWEIS: Man kann die Tiefpassfilterung der Maps bestätigen, indem man sie in ChimeraX oder Coot visualisiert.
8. Visualisieren Sie den Effekt der Auflösung auf die Dichte von Liganden- und Lösungsmittelmolekülen, indem Sie ein Netz von 2 Å um die Liganden- und Lösungsmittelmoleküle bei einem Schwellenwert von 6σ erstellen, wie in Schritt 3.3.6 beschrieben, mit Karten, die auf unterschiedliche Auflösungen gefiltert wurden.

Representative Results

Beispiel 1
Das Enzym Enolase aus M. tuberculosis katalysiert den vorletzten Schritt der Glykolyse und wandelt 2-Phosphoglycerat in Phosphoenolpyruvat (PEP) um, das ein essentielles Zwischenprodukt für mehrere Stoffwechselwege ist^44,45. Die KryoEM-Daten für die Apo-Enolase- und PEP-gebundenen Enolase-Proben wurden bei der gleichen Pixelgröße von 1,07 Å erhoben, und die Bildverarbeitung wurde mit Relion 3.1^46,47 durchgeführt. Die Apo-Enolase- und die PEP-Enolase-Strukturen wurden bei 3,1 Å bzw. 3,2 Å bestimmt⁴⁸. Die Karten und Modelle wurden in EMDB und PDB^49,50 (EMD-30988, EMD-30989, PDB-7e4x und PDB-7e51) hinterlegt. Die KryoEM-Karte des Enzyms zeigt, dass es sich um ein Oktamer in der Lösung handelt (Abbildung 1A). Um die Ligandendichte in der PEP-Enolase-Karte zu identifizieren, wurden die unscharfen Karten des Apoenzyms und des PEP-gebundenen Enzyms ausgewählt, und eine Differenzkarte wurde in ChimeraX berechnet, indem die PEP-Enolase-Karte von der Apoenzymkarte subtrahiert wurde. Es wurde eine deutliche Dichte (grün) an einem hohen Schwellenwert beobachtet, was auf das Vorhandensein des Liganden hindeutet (Abbildung 1B). Die Modellierung der Proteinkette in der unscharfen Karte zeigte deutlich, dass die zusätzliche Dichte im aktiven Zentrum des Proteins vorhanden ist (Abbildung 1C). Der Ligand, PEP, wurde dann in der B-Faktor geschärften Karte mit Coot modelliert, und das Protein+Liganden-Modell wurde im realen Raum mit Phenix verfeinert. Zwei Mg²⁺-Ionen wurden in der in der Nähe des Liganden beobachteten Dichte modelliert (Abbildung 1D). Der Ligand, PEP, nimmt eine ähnliche Orientierung ein, wie sie in anderen Enolase-Homologen beobachtet wird, und mehrere Reste des aktiven Zentrums, wie Lys-386, Arg-364, bilden Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen mit dem Liganden PEP. Die Mg²⁺-Ionen bilden metallische Koordinationsbindungen mit Asp-241, Glu-283, Asp-310 und dem Phosphat von PEP (Abbildung 1D).

Beispiel 2
In Ermangelung einer verfügbaren Apo-Proteinstruktur oder wenn das Protein eine große Konformationsänderung erfährt, ist die Berechnung der Differenzkarten wie oben beschrieben nicht möglich. Im Jahr 2021 führte die Gruppe von Garib Murshudov am Laboratory of Molecular Biology in Cambridge Servalcat²² ein, das einen Verfeinerungsworkflow mit Refmac implementiert und nach der Verfeinerung auch eine Fo-Fc-Differenzkarte berechnet. Eine positive Fo-Fc-Differenzdichte deutet auf das Vorhandensein von Molekülen/Liganden hin, die während der Verfeinerung nicht in das Modell aufgenommen wurden, im Wesentlichen eine Auslassungskarte. Es wird jedoch empfohlen, zuerst die Anpassung des Modells an die Karte im Allgemeinen zu beurteilen und dann die Differenzdichtekarte auszuwerten.

Um die Verwendung von Servalcat/Refmac zu veranschaulichen, wurde mGlu₅ gewählt, ein dimerer G-Protein-gekoppelter Rezeptor, der an den Neurotransmitter L-Glutamat bindet. Nach der Bindung des Agonisten L-Quisqualat orientiert sich die extrazelluläre Domäne neu, was die Rotation des 7TM auslöst und sie näher zusammenbringt, um den aktivierten Zustand zu stabilisieren. Somit wird eine große Konformationsänderung zwischen dem Apo/Antagonisten vs. Agonisten-gebundene Zustände⁵¹ (Abbildung 2A und Abbildung 2E). Die beiden Halbkarten sowohl für den Agonisten (EMD-31536) als auch für den Antagonisten (EMD-31537) gebundenen Komplex wurden aus EMDB erhalten, und die KryoEM-Karten zeigen eine unterschiedliche Auflösung über das Molekül und eine besser aufgelöste extrazelluläre Domäne. Anschließend wurden diese als Eingaben in Servalcat zusammen mit dem Apo-Protein als Modell verwendet, um die Differenz oder Fo-Fc-Karte für jeden Datensatz zu berechnen. Diese Karte zeigte deutlich das Vorhandensein verschiedener Ligandenmoleküle (Nicht-Proteine). Die durch FSC (Fourier-Shell-Korrelation) geschätzte Auflösung für die an Agonisten und Antagonisten gebundenen Komplexe betrug 3,8 Å bzw. 4,0 Å. Im Fall des agonistengebundenen mGlu₅ zeigte die Servalcat Fo-Fc-Differenzkarte das Vorhandensein sowohl des Agonisten (L-Quisqualat) (Abbildung 2B) als auch des N-AcetylGlucosamins (NAG) (Abbildung 2C) in der ECD des Rezeptors (aufgrund der geringeren Auflösung der TMD konzentrieren wir uns hier nur auf die ECD und den oberen Teil der CMD). Es wurde beobachtet, dass Proteinreste, einschließlich Tyr-64, Trp-100, Ser-151 und Thr-175, mit dem Agonisten interagieren. Die Dichte in der Nähe des Asn-210-Rests deutete auf das Vorhandensein von N-Acetylglucosamin hin (Abbildung 2C). Eine Dichte, die mit Cholesterylhemisuccinat übereinstimmte, das während der Reinigung von mGlu 5 hinzugefügt wurde_, wurde in der Nähe der Spitze der Transmembranhelix 1 beobachtet (Abbildung 2D). Da die Auflösung moderat ist und der Ligand, L-Quisqualat, in verschiedenen Orientierungen platziert werden kann, wurde die vorherige Struktur der extrazellulären Domäne mit dem Liganden (PDB-6N50) als Leitfaden für die Modellierung des Liganden verwendet. Die Bindung an Antagonisten stabilisiert den offenen oder ruhenden Zustand des Rezeptors (Abbildung 2E). Eine Dichte, die mit dem Antagonisten LY341495 übereinstimmt, wurde am Scharnier von Lappen I und Lappen II der Venusfliegenfallendomäne in der ECD beobachtet. Der Antagonist interagiert mit Resten, die denen des Agonisten ähneln. Die Stacking-Wechselwirkung zwischen Tyr-223 im Lappen II und dem Antagonisten stabilisiert den Rezeptor in einem offenen Zustand (Abbildung 2F). Ähnlich wie bei der Agonistenstruktur wurde in der Nähe von Asn-210 eine Glykosylierung bzw. das Vorhandensein von N-Acetylglucosamin-Anteil beobachtet (Abbildung 2G).

Beispiel 3
Das dritte Beispiel verdeutlicht das Protokoll zur Modellierung von fragmentgroßen oder kleinen Liganden und Lösungsmittelmolekülen in hochauflösenden KryoEM-Karten. Die fragmentbasierte Wirkstoffforschung (FBDD) hat sich als leistungsstarke und innovative Methode bei der Entwicklung von zielbasierten neuartigen Therapeutika in verschiedenen Krankheitsbereichen erwiesen und ist damit ein vielversprechender Weg in der pharmazeutischen Forschung und Entwicklung^52,53. FBDD beginnt mit dem Screening und der sorgfältigen Auswahl kleiner, hochlöslicher, niedermolekularer Fragmente von Molekülen, die an bestimmte Zielproteine oder Biomoleküle von Interesse binden. Die Bestimmung der Strukturen dieser Protein-Fragment-Komplexe offenbart die Art der Bindung dieser Fragmente, die als Leitfaden für das Design größerer und komplexerer wirkstoffähnlicher Moleküle mit zunehmender Affinität und Spezifität gegenüber dem Zielprotein^{dient 54}. Diese Methode erfordert jedoch eine hochauflösende Ligandendichte, um die Pose genau zu bestimmen und die funktionellen Gruppen des Liganden¹⁵ korrekt zu platzieren.

β-Galactosidase, eine der ersten hochauflösenden Strukturen, die aus den Fortschritten in der KryoEM-Technologie bestimmt wurde, ist ein gut untersuchtes homotetrameres 450-kDa-Enzym, das die Hydrolyse von Laktose zu Glukose und Galaktose^{katalysiert 55}. Um den Einsatz von KryoEM bei FBDD zu demonstrieren, bestimmte Astex, Großbritannien, die Struktur der β-Galactosidase mit einem fragmentgroßen Inhibitor, Deoxygalacto-Nojirimycin (DGN), das im aktiven Zentrum gebunden ist (EMDB-10563, PDB:6tsh)⁵⁶. Dieser Datensatz wird verwendet, um das Protokoll zur eindeutigen Modellierung von Liganden und Lösungsmitteln in hochauflösenden Karten zu veranschaulichen. Um den Einfluss der Auflösung auf die Ligandenmodellierung und -visualisierung zu veranschaulichen, wurden die Karten im Nachbearbeitungsschritt in Relion auf 3,0 Å und 3,5 Å gefiltert. Dies unterstreicht die Qualität der Kartendichte bei verschiedenen Auflösungen und unterstreicht die Notwendigkeit einer höheren Auflösung für die Modellierung von Liganden und Lösungsmitteln.

Das Enzym ist ein Tetramer mit D2-Symmetrie in Lösung (Abbildung 3A). Die von Servalcat berechnete Differenzkarte (zwischen Karte und Modell) deutet auf das Vorhandensein von DGN und mehreren Lösungsmittelmolekülen im aktiven Zentrum des Enzyms hin (Abbildung 3B). Bei einer geschätzten Auflösung von 2,3 Å zeigte die Dichte hochauflösende Merkmale, die bei der genauen Modellierung des Inhibitors im aktiven Zentrum des Proteins halfen. Es wurden Wechselwirkungen zwischen DGN und Tyr-503 und His-540 beobachtet (Abbildung 3C). Die unterschiedliche Dichte deutete auch auf das Vorhandensein von Lösungsmittelmolekülen hin, die mit DGN interagieren, sowie auf die Proteinreste. Mg²⁺ und mehrere Wassermoleküle wurden in der Dichte modelliert (Abbildung 3D). Es werden metallische Koordinationsbindungen zwischen Mg²⁺ und Glu-416, Glu-461 und mehreren Wassermolekülen beobachtet (Abbildung 3D). Es wurde beobachtet, dass Mg²⁺ über ein Wassermolekül mit DGN interagiert.

Bei einer niedrigeren Auflösung von 3,5 Å und 3,0 Å ähnelt die Ligandendichte einem Blob und es fehlen hochauflösende Merkmale, die für eine genaue Modellierung des Liganden entscheidend sind (Abbildung 4A,B). Die Dichte für Wassermoleküle war bei diesen Auflösungen fast nicht vorhanden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Dichte mit zunehmender Auflösung, insbesondere über 3,0 Å, die Modellierung einer größeren Anzahl von Wassermolekülen ermöglichte (Abbildung 4C,D). Die korrekte Positionierung des chiralen Zentrums des Liganden wurde bei ~2,3 Å (Abbildung 4C,D) aufgrund des Vorhandenseins unterschiedlicher Merkmale in der Karte möglich, die die Platzierung sowie die Modellierung von Wassermolekülen und Mg²⁺ leiteten. Im Vergleich dazu blieb die Dichte für Mg²⁺ über den gesamten Auflösungsbereich erkennbar (Abbildung 4A-C).

Abbildung 1: Modellierung des Liganden Phosphoenolpyruvat in M. tuberculosis Enolase. (A) zeigt die B-Faktor geschärfte Karte des PEP-gebundenen Enolase-Enzyms. Die Karte deutet darauf hin, dass Enolase in Lösung oktamer ist und jedes Monomer in der Karte unterschiedlich gefärbt ist. (B) zeigt eine ungeschärfte KryoEM-Karte des apo-Enolasischen Enzyms in grau, wobei die Differenzkarte (zwischen PEP-gebundenen und apo-enolasischen unscharfen Karten) grün überlagert ist, was auf das Vorhandensein des Liganden PEP hindeutet. Dies ist eine Demonstrationskarte, um das Vorhandensein von Liganden zu zeigen. (C) zeigt die Anpassung des Enolase-Modells in der ungeschärften KryoEM-Karte an und hebt die Position der Differenzdichte relativ zum Protein hervor. Das Proteinmodell ist in einer Cartoon-Darstellung dargestellt und in Chainbow koloriert. Diese Abbildung zeigt, dass die zusätzliche Dichte (grün) im aktiven Zentrum jedes Monomers vorhanden ist. (D) zeigt den Liganden PEP, eingeschlossen in der geschärften Karte des B-Faktors, blau gefärbt. Zusätzlich wurde auch eine Dichte für zwei Mg²⁺-Ionen beobachtet, die Metallkoordinationsbindungen mit mehreren Resten des aktiven Zentrums bildet, darunter Ser-42, Asp 241, Glu-283, Asp-310 und Ligandenatome. Der Ligand stellt Wasserstoffbrückenwechselwirkungen mit Lys-386, Lys-335 und Arg-364 her. Die Proteinreste sind in Stäbchendarstellung dargestellt, und Mg²⁺ Ionen sind als violette Kugeln dargestellt. Die Figuren in den Panels (A-D) wurden mit Pymol generiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Identifizierung, Modellierung und Visualisierung verschiedener Liganden im mGlu_5-Rezeptor. Die Fo-Fc-Auslassungskarten wurden mit Servalcat erstellt. (A) zeigt die mGlu-5-Rezeptor-Dimerstruktur (PDB-7fd8) in Cartoon-Darstellung, wobei jedes Monomer in Blaugrün bzw. Weizen gefärbt und an den Agonisten L-Quisqualat gebunden ist. Alle Liganden, die in der extrazellulären und auf der Oberseite der Transmembrandomäne des Rezeptors identifiziert wurden, sind in der Fo-Fc-Omit-Map eingeschlossen, grün gefärbt und bei 6σ konturiert. (B) hebt die Passung des Agonisten L-Quisqualat hervor, der in der Differenzkarte eingeschlossen ist. L-Quisqualat interagiert mit mehreren mGlu_5-Resten, darunter Tyr-64, Trp-100, Ser-151, Thr-175 und Gly-280. Die Wechselwirkungen der H-Bindung werden durch rote Striche dargestellt. In (C) ist eine zusätzliche Dichte in der Nähe von Asn-210 erkennbar, das in der extrazellulären Domäne des Rezeptors vorhanden ist, und das N-Acetylglucosaminmolekül (NAG) wurde in dieser Dichte modelliert. Zur Klarstellung: Die NAG ist in der aktuellen Abbildung nicht mit der ASN verknüpft. (D) zeigt den Dichteunterschied für Cholesterin-Hemisuccinat (CHS) in Grün in der Nähe der lipidexponierten Oberfläche des Rezeptors. Das CHS-Molekül, das in den Sticks dargestellt ist, wurde in dieser Dichte modelliert. (E) zeigt die mGlu-5-Rezeptorstruktur (PDB-7fd9), die in der Cartoon-Darstellung an den Antagonisten LY341495 gebunden ist. In (F) weist eine zusätzliche Dichte in der Fo-Fc-Differenzkarte, die sich am Scharnier zwischen Lappen I und Lappen II der extrazellulären Domäne befindet, auf das Vorhandensein des Antagonisten hin. Schlüsselreste (Tyr-64, Trp-100, Ser-152, Ser-173, Thr-175 und Tyr-223) um den Antagonisten sind in Stick-Darstellungen dargestellt, und potenzielle Wasserstoffbrückenwechselwirkungen mit dem Antagonisten sind in roten Strichen dargestellt. (G) zeigt den Dichteunterschied, der auf das Vorhandensein eines NAG-Moleküls in der Nähe von Asn-210 in der antagonistengebundenen Struktur hindeutet (beachten Sie, dass das NAG aus Gründen der Klarheit nicht mit Asn verknüpft ist). Die Zahlen wurden mit Pymol generiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Identifizierung, Modellierung und Verfeinerung eines kleinen Inhibitors und Lösungsmittelmoleküls in der hochauflösenden Karte der β-Galactosidase (EMD-10563). (A) zeigt das β-Galactosidase-Modell aufgelöst auf 2,3 Å (PDB: 6tsh) in einer Karikaturdarstellung, bei der jedes Monomer deutlich gefärbt ist. Der graue Kasten markiert die Ligandenbindungsstelle. (B) zeigt die Fo-Fc-Differenzdichte (von Servalcat) in grünem Netz im aktiven Zentrum des Enzyms an. Der Dichteunterschied deutet auf das Vorhandensein des Inhibitors (DGN) und mehrerer Lösungsmittelmoleküle im aktiven Zentrum hin. (C) zeigt, dass der Inhibitor Desoxygalacto-Nojirimycin (DGN) anhand der Fo-Fc-Karte im aktiven Zentrum modelliert wird. Dieser modellierte Ligand ist im Stick-Format dargestellt und in der Fo-Dichte (von Servalcat) eingeschlossen, die in blue_mesh eingefärbt ist. Es werden Wasserstoffbrückenwechselwirkungen zwischen DGN und mehreren Proteinresten, einschließlich Tyr-503 und His-540, beobachtet. Die zusätzliche Fo-Fc-Differenzdichte um den Liganden (grün) ist ein Hinweis auf die Lösungsmittelmoleküle. (D) Die Karte zeigt, dass mehrere Lösungsmittelmoleküle, einschließlich Wasser und Mg²⁺, die als rote bzw. violette Kugeln dargestellt werden, im aktiven Zentrum modelliert werden, nachdem sichergestellt wurde, dass jedes Lösungsmittelmolekül entweder an Protein- (Glu-416, His-418 und Glu-461) oder an Ligandenreste gebunden ist. Die Wassermoleküle und Mg²⁺ sind in der Fo-Dichte (blaues Netz) eingeschlossen. Es wird beobachtet, dass Mg²⁺ über ein Wassermolekül mit dem Liganden DGN interagiert. Die Fo-Fc-Map (grünes Netz) in den Feldern (B,C) wird bei 6σ konturiert, während die Fo-Dichte - blaues Netz in C und D (aus der Servalcat-Verfeinerung nach der Modellierung) bei 3σ konturiert ist. Die Figuren in den Panels (A-D) wurden mit Pymol generiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Einfluss der Auflösung auf die Ligandenmodellierung in β-Galactosidase. Halb-Maps von EMD-10563 wurden als Input im Relion-Post-Process-Schritt verwendet, und die kombinierten Post-Process-Maps wurden auf Auflösungen von 2,3 Å, 3,0 Å und 3,5 Å mit unterschiedlichen B-Faktoren gefiltert. Die in allen Feldern gezeigte Karte ist bei 6σ konturiert. Der Übersichtlichkeit halber ist nur das Proteinrückgrat ohne Seitenketten, Liganden oder Lösungsmittelmoleküle in den Feldern A, B und C dargestellt. (A) Die Karte wird auf 3,5 Å gefiltert und das aktive Zentrum der β-Galactosidase gezeigt. In dieser Auflösung ist ein Blob zu sehen, der dem Liganden DGN ähnelt, begleitet von einigen kleineren Blobs in der Nähe. Die Modellierung des Liganden in der richtigen Ausrichtung erweist sich aufgrund des Fehlens eindeutiger Merkmale in der Karte als schwierig. (B) Die auf 3,0 Å Auflösung gefilterte Karte wird angezeigt. Hier wird der Liganden-Blob etwas definierter, aber es fehlen immer noch Merkmale im Allgemeinen. Es werden auch einige weitere kleine Kleckse beobachtet, die auf Lösungsmittelmoleküle hindeuten. (C) Die auf 2,3 Å Auflösung gefilterte Karte zeigt die Ligandendichte mit unterschiedlichen Merkmalen, insbesondere die Stuhlkonformation des Iminozuckers. Bei dieser Auflösung wird eine signifikante Anzahl kleiner Klumpen beobachtet, die Wassermolekülen entsprechen. Die automatische B-Faktor-Schätzung/Schärfung im Relion-Postprozess ergibt einen Wert von -18 Ų für die auf 3 Å und 3,5 Å gefilterten Maps, während der^{Wert für die} auf 2,3 Å gefilterte Map -52 Å 2 beträgt. Verschiedene B-Faktor-Schärfungen von EM-Maps können auch mit Coot durchgeführt werden und sind nützlich für den Modellbau. (D) Das Panel zeigt, dass der Ligand DGN (Stabdarstellung), Mg²⁺ und Wassermoleküle (als Kugeln), wie sie im aktiven Zentrum modelliert sind, und die geschärfte Karte bei 2,3 Å, dargestellt in einem blauen Netz, das diese Atome umgibt. Die Figuren in den Panels (A-D) wurden mit Pymol generiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Die Verbesserungen in der Mikroskop-Hard- und -Software haben in den letzten Jahren zu einer Zunahme der Anzahl von KryoEM-Strukturen geführt. Obwohl die derzeit höchste Auflösung, die in der Einzelpartikel-KryoEM erreicht wird, bei 1,2 Å 57,58,59 liegt, wird der Großteil der Strukturen mit einer Auflösung von etwa 3-4 Å bestimmt. Die Modellierung von Liganden in Karten mit mittlerer bis niedriger Auflösung kann schwierig und oft mit Mehrdeutigkeiten behaftet sein. Angesichts der weit verbreiteten Verwendung von KryoEM sowohl in der akademischen Welt als auch in der Pharmaindustrie für die translationale Forschung und Wirkstoffforschung ist es wichtig, sicherzustellen, dass Liganden korrekt und ohne Mehrdeutigkeiten modelliert werden. Daher ist es ratsam, die Auflösungsfähigkeit von Ligandenatomen durch die Berechnung von Q-Scores⁶⁰ zu quantifizieren, die nun in der EMDB als Metrik zur Bewertung der Qualität der Karten und der Anpassung des Modells sowie in Chimera verfügbar sind.

Im ersten Beispiel wurde ChimeraX verwendet, um die Differenzkarte im realen Raum zwischen dem Apo und den ligandengebundenen Karten im Enolase-Enzym M. tuberculosis zu berechnen. Die zusätzliche Dichte bei einem hohen Schwellenwert deutet auf das Vorhandensein des Liganden Phosphoenolpyruvat im aktiven Zentrum und Mg²⁺ hin, das an den Liganden gebunden ist. Es ist wichtig zu beachten, dass die Karte in diesem Fall eine mittlere Auflösung (3,2 Å) hat und Wassermoleküle nicht sicher modelliert werden können (Abbildung 1). Die Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass sie nur angewendet werden kann, wenn die Ligandenbindung keine signifikanten Konformationsänderungen im Protein induziert. In diesem Fall wurde keine Map-Normalisierung durchgeführt, da sowohl die APO- als auch die ligandengebundenen Datensätze mit der gleichen Pixelgröße erfasst und mit identischen Parametern in Relion verarbeitet wurden. Es ist jedoch erwähnenswert, dass beim Vergleich von Karten, die mit verschiedenen Rekonstruktionsprogrammen wie Relion^46,47 und CryoSparc⁶¹ oder mit unterschiedlicher Qualität erstellt wurden, eine Normalisierung der Karten unerlässlich ist, bevor aussagekräftige Vergleiche durchgeführt werden können.

Das nächste Beispiel ist mGlu₅, das bei der Agonistenbindung eine große molekulare Reorganisation erfährt, wie aus den KryoEM-Strukturen^51,62 hervorgeht (Abbildung 2). In diesem Szenario ist es nicht möglich, eine einfache Differenzkarte zwischen den ungebundenen (APO) und ligandengebundenen Rezeptoren zu berechnen, da es erhebliche Unterschiede zwischen den Karten gibt. Hier wurde Servalcat verwendet, das ungeschärfte und ungewichtete Halbabbildungen als Input für die Verfeinerung im reziproken Raum verwendet und anschließend eine Differenzkarte zwischen der experimentellen Karte und der aus dem Modell abgeleiteten Karte berechnet. Bei einer hohen Schwelle kann man Unterschiede visualisieren und als Leitfaden für die Korrektur und Verbesserung des Modells dienen. Mehrere nicht modellierte Blobs in der extrazellulären und nahe der Transmembrandomäne von mGlu₅ wurden beobachtet und als Leitfaden für die Modellierung von Liganden verwendet (Abbildung 2).

Das dritte Beispiel zeigt, wie die Auflösung (2,3 Å) eine entscheidende Rolle bei der Karteninterpretation und Modellierung eines fragmentgroßen Inhibitors in β-Galactosidase spielt. Hier bestand die Herausforderung darin, einen sehr kleinen Liganden (<200 Da) in der Servalcat-Differenzkarte inmitten des inhärenten Rauschens in den Daten zu identifizieren und genau zu modellieren. Neben der hohen globalen Auflösung, die mit der Fourier-Schalen-Korrelation (FSC) bestimmt wurde, war auch die für den Liganden spezifische lokale Auflösung ausreichend hoch, um eine genaue Platzierung der chiralen Zentren der Liganden zu gewährleisten (Abbildung 3). Die Dichte für Lösungsmittelmoleküle wurde in der Differenzkarte im gesamten Enzym und insbesondere in der Umgebung des Liganden beobachtet. Der Effekt der Auflösung auf die Modellierung von Liganden und Lösungsmittelatomen wurde ebenfalls demonstriert (Abbildung 4). Bei der Modellierung von Wasser- oder Lösungsmittelmolekülen ist Vorsicht geboten, da das Rauschen bei einem niedrigen Schwellenwert gelegentlich Wasser- oder Lösungsmittelmolekülen ähneln kann, was zu möglichen Fehlinterpretationen führen kann.

Eine weitere wichtige Überlegung ist, dass die KryoEM-Karten allein möglicherweise nicht ausreichen, um ein Metallion allein genau zu identifizieren. Zusätzliche biophysikalische Methoden wie die erweiterte Röntgenabsorptionsfeinstruktur (EXAFS) oder die energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX) sind oft erforderlich, um das Vorhandensein und die Identität des Metallions zu bestätigen. Sowohl in Enolase- als auch in β-Galactosidase-Enzymen wurde Mg²⁺ modelliert, da über diese Proteine bereits eine Fülle von Informationen verfügbar war, die die Identität des Metallions bestätigen. Auch die Koordination der Metallionen in diesen Fällen, beispielhaft für die klassische oktaedrische Geometrie und die nahezu idealen Koordinationsabstände von Mg²⁺, lieferte einen wesentlichen Beweis für ihre Identität.

Generell sollten bei der Modellierung von Liganden in KryoEM-Karten einige wichtige Überlegungen berücksichtigt werden. Zunächst ist es wichtig, die richtige Karte für die Ligandenidentifikation und -modellierung auszuwählen. In allen Fällen ist eine unscharfe und ungewichtete Karte oder Halbkarte gegenüber einer geschärften und gewichteten Karte ratsam, um die Ligandendichte zu visualisieren, da das Schärfen und Gewichten zu unter- oder überschärften Bereichen in der Karte führen könnte. Dies kann zu einer suboptimalen Ligandendichte führen, und die Verwendung verschiedener B-Faktor-Schärfungen kann verwendet werden, um die Dichte während der Modellerstellung in Coot zu bewerten. Obwohl die Verwendung der geschärften Karte zur Identifizierung von Liganden in einer KryoEM-Karte ein Risiko darstellt, zeigt die unscharfe Karte möglicherweise nicht die vollständigen Details der Ligandendichte, kann aber zu Demonstrationszwecken verwendet werden, wie in Abbildung 1B, C gezeigt.

Die Pose des modellierten Liganden sollte validiert werden, insbesondere in Fällen, in denen die Daten schwach sind. Wie hier für mGlu₅ gezeigt, variiert die lokale Auflösung über die KryoEM-Karte, und eine unverzerrte Modellierung des Liganden kann eine Herausforderung darstellen. Servalcat kann als wertvolles Werkzeug zur Erkennung potenzieller Ungenauigkeiten bei der Protein- und Ligandenmodellierung eingesetzt werden²².

Die Heterogenität der Zusammensetzung kann in einem Protein-Liganden-Komplex vorhanden sein, in dem der Ligand nur in einer bestimmten Population vorhanden sein kann (wenn der Ligand ein niedriges Molekulargewicht hat, kann der Klassifizierungsschritt die Heterogenität möglicherweise nicht beseitigen). Dennoch ist es wichtig, den Schritt der 3D-Klassifizierung⁶³ während der Bildverarbeitung vor der Ligandenmodellierung iterativ durchzuführen und zu überprüfen, ob sich die Dichte des Liganden verbessert. Wenn mehrere Kopien des Proteins vorhanden sind, ist bei der Anwendung der Symmetrie über die Karte während der anfänglichen Modellgenerierung und -verfeinerung Vorsicht geboten, da dies die Ligandendichte in allen symmetriebezogenen Molekülen ausgleichen kann. Die Symmetrie sollte erst dann auferlegt werden, wenn die Karte gründlich untersucht wurde, um das Vorhandensein der Ligandendichte in allen Proteinketten zu bestätigen.

Abhängig vom Zustand (Kristall oder Lösung) und dem Ort (vergraben oder Oberfläche) können die Atome dynamisch sein, und in der Modellverfeinerung wird dies als atomarer Verschiebungsparameter (ADP) bezeichnet. Zusammen mit der Differenzkarte, die visuelle Hinweise auf mögliche Ungenauigkeiten im Modell liefert, können ADP-Werte verwendet werden, um die Genauigkeit der Liganden nach der Verfeinerung 64,65,66,67 zu bewerten. Typischerweise sollte der Ligand ähnliche ADP-Werte wie die umgebenden Reste haben, d.h. wenn sie stabil gebunden und genau modelliert sind. Liganden an der Peripherie oder Atome eines Liganden (wie Lipide), die weit von Makromolekülen entfernt sind, können jedoch höhere ADP-Werte aufweisen. Neben der Verfeinerung der Koordinaten ermöglichen sowohl Refmac^33,34 als auch Phenix die Verfeinerung der ADP-Werte^28,68. In Refmac wird die Mott-Bethe-Näherung verwendet, um den Elektronenstreufaktor einzelner Atome während der Kartenberechnung zu berechnen. In der neueren Version von Phenix wurde die individuelle B-Faktor-Verfeinerung, ähnlich der Kristallographie, eingeführt, um die Atomunordnung zu berücksichtigen. Sehr oft wird in den verfeinerten Modellen, die von der KryoEM abgeleitet wurden, ein großer Bereich von ADP-Werten beobachtet (manchmal Werte nahe Null), und sogar der Q-Score, der in EMDB zur Bewertung der Anpassung des Modells an die Karte verwendet wird, hängt von der hinterlegten primären Karte und der Art der B-Faktor-Schärfung⁶⁰ ab. Bei der Erstellung von KryoEM-Modellen werden häufig mehrere Karten verwendet, und daher sollten die in der Modellierung und Verfeinerung verwendeten Karten in den Methoden deutlich erwähnt werden, da aufgrund der anisotropen Auflösung in vielen Makromolekülen eine einzige Karte möglicherweise nicht ausreicht, um alle Details zu erklären. 

Bei der Modellierung von Liganden in Makromolekülen besteht eine der Haupteinschränkungen von KryoEM-Karten (wie in der Kristallographie) darin, dass es sich als schwierig erweisen kann, die korrekte Konformation zu bestimmen, wenn die Ligandenbindungsstelle eine niedrige Auflösung hat oder wenn der gebundene Ligand dynamisch ist. Darüber hinaus haben die meisten KryoEM-Strukturen Auflösungen unter 3 Å, und die Darstellung von Wassermolekülen in den Karten ist begrenzt, was es schwierig macht, die Rolle der Hydratation bei der Liganden- oder Wirkstoffbindung zu beurteilen (wie hier an den Beispielen von Enolase und mGluR gezeigt). Computergestützte Methoden können in Kombination mit KryoEM-Daten verwendet werden, um diese Einschränkungen zu überwinden⁶⁹. Im Gegensatz zur Kristallographie erfährt nur das Modell eine Verfeinerung, nicht die Karte. Derzeit ist die einzige Methode, um das Vorhandensein eines Liganden anzuzeigen oder eine genaue Modellierung zu gewährleisten, die Erstellung von Auslassungskarten (unter Verwendung von Tools wie Servalcat). Es gibt also eine Reihe von Werkzeugen, die den Forschern helfen, das Modell zu erstellen und zu bewerten, aber es gibt mehrere Bereiche in der Modellverfeinerung, in denen neuere Ansätze oder Modifikationen aktueller Ansätze in naher Zukunft zu erwarten sind.

In diesem Artikel haben wir uns auf die aktuellen Ansätze zur Modellierung von Liganden konzentriert, zu denen die manuelle Inspektion der Ligandendichte, die Erstellung der Ligandengeometriedatei und die anschließende Modellierung des Liganden in der KryoEM-Karte gehören. Dies ist eine aufregende Zeit in der Strukturbiologie und Wirkstoffforschung, da direkte Elektronendetektoren mit schnelleren Bildraten und die Verwendung einer schnelleren Datenerfassung⁷⁰ dazu geführt haben, dass hochauflösende Karten (<2,8 Å) mehrerer Makromoleküle, die oft an kleine Molekülliganden gebunden sind, in relativ kurzer Zeit erhalten werden konnten. Die kürzliche Einführung automatisierter Ligandenmodellierungswerkzeuge wie GEMspot⁶⁹ in der Schrödinger-Suite und EMERALD¹⁷ in der Rosetta-Suite, die versucht, die wahrscheinlichste gebundene Pose des Liganden unter Berücksichtigung der experimentellen KryoEM-Daten zu finden, verspricht, diesen Prozess zu rationalisieren und zu automatisieren. Ähnlich wie bei der Röntgenkristallographie ist davon auszugehen, dass die Identifizierung der Bindungsmodi von kleinmolekularen Liganden durch KryoEM, vielleicht zwei oder mehr an einem einzigen Tag, zu einer realistischen Möglichkeit wird.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCP4-8.0	Consortium of several institutes	https://www.ccp4.ac.uk	Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography
CCP-EM	Consortium of several institutes	https://www.ccpem.ac.uk/download.php	Free for academic users and includes Coot, Relion and many others
Coot	Paul Emsley, LMB, Cambridge	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/	General software for model building but also available with other suites described above
DockinMap (Phenix)	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html	Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps
Electron Microscopy Data Bank	Consortium of several institutes	https://www.ebi.ac.uk/emdb/	Public Repository for Electron Microscopy maps
Falcon	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf	Commercial, camera from Thermo Fisher
Phenix	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/download	Free for academic users and includes Coot
Protein Data Bank	Consortium of several institutes	https://rcsb.org	Public database of macromolecular structures
Pymol	Schrodinger	https://pymol.org/2/	Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.
Relion	MRC-LMB, Cambridge	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html	Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE	Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF Chimera	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html	General purpose software for display, analysis and more
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	General purpose software for display, analysis and more