Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Modellering av ligander til kart avledet fra elektronkryomikroskopi

Published: July 19, 2024 doi: 10.3791/66310
Automatic Translation
*1, *2, 1
1National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, 2Institute for Stem Cell Science and Regenerative Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen introduserer verktøyene som er tilgjengelige for modellering av småmolekylære ligander i kryoEM-kart over makromolekyler.

Abstract

Å dechiffrere protein-ligand-interaksjonene i et makromolekylært kompleks er avgjørende for å forstå den molekylære mekanismen, underliggende biologiske prosesser og legemiddelutvikling. De siste årene har kryogen prøveelektronmikroskopi (cryoEM) dukket opp som en kraftig teknikk for å bestemme strukturene til makromolekyler og for å undersøke modusen for ligandbinding ved nær atomoppløsning. Å identifisere og modellere ikke-proteinmolekyler i kryoEM-kart er ofte utfordrende på grunn av anisotrop oppløsning på tvers av molekylet av interesse og iboende støy i dataene. I denne artikkelen blir leserne introdusert for ulike programvarer og metoder som i dag brukes til ligandidentifikasjon, modellbygging og foredling av atomkoordinater ved hjelp av utvalgte makromolekyler. En av de enkleste måtene å identifisere tilstedeværelsen av en ligand på, som illustrert med enolase-enzymet, er å trekke fra de to kartene oppnådd med og uten liganden. Den ekstra tettheten til liganden vil sannsynligvis skille seg ut i differansekartet selv ved en høyere terskel. Det er tilfeller, som vist i tilfellet med metabotrope glutamatreseptor mGlu5, når slike enkle forskjellskart ikke kan genereres. Den nylig introduserte metoden for å utlede Fo-Fc utelatelseskartet kan tjene som et verktøy for å validere og demonstrere tilstedeværelsen av liganden. Til slutt, ved å bruke den godt studerte β-galaktosidasen som eksempel, analyseres effekten av oppløsning på modellering av ligander og løsningsmiddelmolekyler i kryoEM-kart, og et syn på hvordan kryoEM kan brukes i legemiddeloppdagelse presenteres.

Introduction

Celler utfører sine funksjoner ved å utføre utallige kjemiske reaksjoner samtidig og uavhengig, hver omhyggelig regulert for å sikre deres overlevelse og tilpasningsevne som svar på miljøsignaler. Dette oppnås ved molekylær gjenkjenning, som gjør det mulig for biomolekyler, spesielt proteiner, å danne forbigående eller stabile komplekser med andre makromolekyler så vel som små molekyler eller ligander1. Dermed er protein-ligand-interaksjoner grunnleggende for alle prosesser i biologi, som inkluderer regulering av proteinuttrykk og aktivitet, gjenkjennelse av substrater og kofaktorer av enzymer, samt hvordan celler oppfatter og videresender signaler 1,2. En bedre forståelse av de kinetiske, termodynamiske og strukturelle egenskapene til protein-ligand-komplekset avslører det molekylære grunnlaget for ligandinteraksjon og letter også rasjonell legemiddeldesign ved å optimalisere legemiddelinteraksjon og spesifisitet. En økonomisk og raskere tilnærming til å studere protein-ligand-interaksjon er å bruke molekylær dokking, som er en beregningsmetode som praktisk talt screener et mangfoldig utvalg av små molekyler og forutsier bindingsmodusen og affiniteten til disse ligandene til målproteiner3. Imidlertid gir eksperimentelle bevis fra høyoppløselige strukturer bestemt av røntgendiffraksjon (XRD), kjernemagnetisk resonans (NMR) eller elektronkryomikroskopi (cryoEM) det essensielle beviset for slike spådommer og hjelper til med utviklingen av nyere og mer effektive aktivatorer eller hemmere for et gitt mål. Denne artikkelen bruker forkortelsen 'cryoEM' som teknikken ofte refereres til. Imidlertid er det en pågående debatt om valg av riktig nomenklatur, og nylig har begrepet kryogeniskprøve Electron Microscopy (cryoEM) blitt foreslått for å indikere at prøven er ved kryogen temperatur og avbildet med elektroner4. På samme måte har kartene avledet fra cryoEM blitt kalt elektronpotensial, elektrostatisk potensial eller Coulomb-potensial, og for enkelhets skyld bruker vi her kryoEM-kart 5,6,7,8,9,10.

Selv om XRD har vært gullstandardteknikken i høyoppløselig strukturbestemmelse av protein-ligandkomplekser, har kryoEM etter oppløsningsrevolusjon11 fått fart, som indikert av økningen av Coulomb-potensialkart eller kryoEM-kart deponert i Electron Microscopy Database (EMDB)12,13 i løpet av de siste årene14. På grunn av fremskritt innen prøvepreparering, avbildning og databehandlingsmetoder, økte antallet Protein Data Bank (PDB)14-avsetninger som bruker kryoEM fra 0,7 % til 17 % mellom 2010 og 2020, med omtrent 50 % av rapporterte strukturer i 2020 bestemt ved 3,5 Å oppløsning eller bedre15,16. CryoEM har raskt blitt tatt i bruk av det strukturelle biologiske miljøet, inkludert farmasøytisk industri, da det tillater studier av fleksible og ikke-krystallinske biologiske makromolekyler, spesielt membranproteiner og multiproteinkomplekser, ved nær atomoppløsning, overvinne krystalliseringsprosessen og oppnå godt diffrakterende krystaller som kreves for høyoppløselig strukturbestemmelse av XRD.

Nøyaktig modellering av liganden i cryoEM-kartet er avgjørende, siden det fungerer som en blåkopi av protein-ligandkomplekset på molekylært nivå. Det er flere automatiserte ligandbyggingsverktøy som brukes i røntgenkrystallografi som avhenger av formen og topologien til ligandtettheten for å passe eller bygge liganden inn i elektrontettheten 17,18,19,20. Likevel, hvis oppløsningen er lavere enn 3 Å, har disse tilnærmingene en tendens til å gi mindre ønskelige resultater fordi de topologiske egenskapene de er avhengige av for gjenkjennelse og bygging blir mindre definerte. I mange tilfeller har disse metodene vist seg ineffektive for nøyaktig modellering av ligander til kryoEM-kart, da disse kartene har blitt bestemt i området lav til middels oppløsning, typisk mellom 3,5 Å-5 Å17.

Det første trinnet i 3D-strukturbestemmelse av et protein-ligandkompleks ved cryoEM innebærer enten samrensing av liganden med proteinet (når liganden har høy bindingsaffinitet til proteinet) eller inkubering av proteinløsningen med liganden i en bestemt varighet før gitterforberedelse. Deretter plasseres et lite prøvevolum på et plasmarenset hullete TEM-gitter, etterfulgt av flashfrysing i flytende etan og til slutt avbildning med en kryo-TEM. 2D-projeksjonsbildene fra hundretusener til millioner av individuelle partikler er gjennomsnittet for å rekonstruere et 3-dimensjonalt (3D) Coulomb-potensialkart over makromolekylet. Identifisering og modellering av ligander og løsningsmiddelmolekyler i disse kartene utgjør betydelige utfordringer i mange tilfeller på grunn av den anisotrope oppløsningen på tvers av kartet (dvs. oppløsningen er ikke ensartet over makromolekylet), fleksibilitet i regionen der liganden er bundet, og støyen i dataene. Mange av modellerings-, foredlings- og visualiseringsverktøyene som ble utviklet for XRD blir nå tilpasset for bruk i cryoEM for samme formål 18,19,20,21. I denne artikkelen presenteres en oversikt over ulike metoder og programvare som for tiden brukes til å identifisere ligander, bygge modeller og avgrense koordinatene avledet fra cryoEM. En trinn-for-trinn-protokoll er gitt for å illustrere prosessene som er involvert i modellering av ligander ved bruk av spesifikke protein-ligandkomplekser med varierende oppløsning og kompleksitet.

Det første trinnet i modellering av ligander i kryoEM-kart inkluderer identifisering av ligandtettheten (ikke-protein) i kartet. Hvis ligandbinding ikke induserer noen konformasjonsendring i proteinet, fremhever beregning av et enkelt forskjellskart mellom protein-ligandkomplekset og apo-proteinet i hovedsak regionene med ekstra tetthet, noe som tyder på tilstedeværelsen av liganden. Slike forskjeller kan observeres umiddelbart, da det bare krever to kart, og til og med mellomkart under prosessen med 3D-foredling kan brukes til å sjekke om liganden er tilstede. I tillegg, hvis oppløsningen er høy nok (<3,0 Å), kan differansekartet også gi innsikt i plasseringen av vannmolekyler så vel som ioner som interagerer med liganden og proteinrestene.

I fravær av apo-proteinkartet er det nå mulig å bruke Servalcat22, som er tilgjengelig som et frittstående verktøy og også har blitt integrert i CCP-EM-programvarepakken23,24 som en del av Refmac-foredlingen og i CCP4 8.0 versjon25,26. Servalcat tillater beregning av et FSC-vektet differansekart (Fo-Fc) ved å bruke de uskarpe halvkartene og apoproteinmodellen som input. Fo-Fc utelatelseskartet representerer forskjellen mellom det eksperimentelle kartet (Fo) og kartet avledet fra modellen (Fc). I fravær av en ligand i modellen, antyder en positiv tetthet i et Fo-Fc-kart som overlapper med det eksperimentelle EM-kartet vanligvis tilstedeværelsen av liganden. Antakelsen her er at proteinkjeden er godt tilpasset i kartet, og den gjenværende positive tettheten indikerer plasseringen av liganden. Det er imidlertid viktig å undersøke nøye om den positive tettheten stammer fra modelleringsunøyaktigheter, for eksempel feil rotamer av en proteinsidekjede.

Det andre trinnet innebærer å skaffe eller lage en kartesisk koordinatfil av liganden med veldefinert geometri fra tilgjengelig kjemisk informasjon. Standard ligander (for eksempel ATP og NADP+) som allerede er tilgjengelige i CCP4-monomerbiblioteket kan brukes til foredling ved å hente koordinat- og geometrifilene via deres monomertiltredelseskode. For ukjente eller ikke-standardiserte ligander er imidlertid ulike verktøy tilgjengelige for å lage geometrifilene. Noen av eksemplene inkluderer eLBOW27 - (elektronisk ligandbygger og optimaliseringsarbeidsbenk) i Phoenix28, Lidia - et innebygd verktøy i Coot29, JLigand/ACEDRG 30,31, CCP-EM23,24, Ligprep32-a-modul av Glide i Schrödinger-suiten. Ligandkoordinatfilen blir deretter montert i tettheten, styrt av både det eksperimentelle kryoEM-kartet og differansekartet i Coot. Dette etterfølges av raffinement i sanntid i Phoenix28 eller gjensidig raffinement i Refmac33. En Linux-arbeidsstasjon eller en bærbar datamaskin utstyrt med et godt grafikkort og ovennevnte programvare kreves. De fleste av disse programmene er inkludert i ulike suiter. CCP-EM24 og Phenix28 er fritt tilgjengelige for akademiske brukere og inkluderer en rekke verktøy som brukes i denne artikkelen, inkludert Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, etc. På samme måte gir Chimera37 og ChimeraX38 gratis lisenser til akademiske brukere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Modellering av fosfoenolpyruvat (PEP) i enolase fra Mycobacterium tuberculosis

  1. Identifisering av ligandtetthet i kryoEM-kartet over PEP-enolase-komplekset
    1. Last ned de uskarpe halvkartene (emd_30988_additional_1.map og emd_30988_additional_2.map) av apo-enolase fra tilleggsdataene i EMDB (se materialfortegnelse).
    2. Åpne ChimeraX (se materialfortegnelse). Åpne halvkartene til apo-enolase ved å klikke på Åpne fra verktøylinjen og velge filnavnene. Skriv vop add #1 #2 i kommandolinjen for å kombinere begge halvkartene for å få det apo-enolase uskarpe kartet.
      MERK: #1 og #2 betegner de to halvkartene for apo-enolase-enzymet, som nevnt i trinn 1.1.1.
    3. Gi nytt navn til det kombinerte kartet (ChimeraX-kart-ID: #3) ved å skrive gi nytt navn til #3 Apo-enolase-unsharpened-map. Fargelegg kartet grått fra modellpanelet. Kartet indikerer at enolase er oktamerisk i løsningen med D4-symmetri.
    4. Gjenta trinn 1.1.1-1.1.3 ved å bruke følgende halvkart emd_30989_additional_1.map (kart-ID: 4) og emd_30989_additional_2.map (kart-ID: 5) for å få PEP-enolase-unsharpened-map (kart-ID: #6).
    5. For å beregne et differansekart, må du først passe de to kartene (PEP-enolase og apo-enolase uskarpe kart fra trinn 1.1.3 og trinn 1.1.4) på hverandre ved å klikke på Tilpass (kart i kart) i kartpanelet (verktøylinjen) i ChimeraX.
      MERK: Normalisering utføres ikke mellom de to kartene. I noen tilfeller kan det være nødvendig med normalisering for å bringe kartene til samme skala.
    6. Trekk PEP-enolase-kartet fra apo-enolase-kartet ved å skrive vop subtract #6 #3 på kommandolinjen.
      MERK: #6 = PEP-enolase uskarpt kart, #3 = Apo-enolase uskarpt kart.
    7. Fargelegg det subtraherte kartet (kart-ID:7) i grønt, som angir positiv tetthet (i henhold til konvensjonen i røntgenkrystallografi)39.
    8. Last ned koordinatene til M. tuberculosis oktemarisk enolase (PDB: 7e4x) fra Protein Data Bank (PDB), klikk på åpne fra verktøylinjen, og velg filnavnet.
    9. Gi nytt navn til modellen 7e4x.pdb ved å skrive rename #8 Apo_enolase.pdb på kommandolinjen. #8 betegner Apo_enolase.pdb i ChimeraX.
    10. Velg modellen fra modellpanelet. Klikk på Høyre mus fra verktøylinjen. Klikk på Flytt molekyl for å plassere modellen i nærheten av PEP-enolase-kartet (#6) og juster modellen i forhold til kartet. Monter denne modellen i PEP-enolase-unsharpened-map ved å skrive fit #8 i #6 på kommandolinjen. Her er kartet nummerert 6, og modellen er nummerert 8.
      NOTAT: I noen tilfeller kan det hende at den lokale passformen i ChimeraX ikke er nok til å justere modellen. I disse tilfellene kan et ekstra trinn med global tilpasning (DockinMap, se materialtabell) utføres i Phenix.
    11. Lagre den tilpassede modellen ved å skrive save Apo-enolase.pdb #8 på kommandolinjen.
  2. Modellering og foredling av PEP i B-faktor skjerpet kryoEM-kart over PEP-enolase-kompleks
    1. Åpne "coot" (se materialfortegnelse) fra terminalen ved å skrive ./Coot &.
    2. Vis "Apo-enolase.pdb" ved å klikke på Fil > åpne koordinater Apo-enolase.pdb. Koordinatfilen vises med bindinger (farge for atom).
    3. Last ned det PEP-bundne Enolase-slipte kartet, det vil si emd_30989.map fra EMDB. Vis det samme ved å klikke på Fil > Åpne kart > emd_30989.map . Sett terskelen til 7.00 σ ved å bla den midterste museknappen.
    4. Finn umodellerte blober ved å klikke på Valider > umodellerte blober > Finn blober.
    5. Finn den umodellerte ligandtettheten nær de aktive stedsrestene, Ser 42, Lys-386 og Arg-364 i enolasemodellen.
    6. Få PEP-monomermodellfilen fra Coot-monomerbiblioteket ved å klikke på Fil > Hent monomer og skriv inn PEP som 3-bokstavskode.
    7. Flytt PEP-molekylet til tettheten ved å bruke alternativet Roter/Oversett- Sone/Kjede/Molekyl i sidefeltmenyen. Bruk real-space refinement i Coot for å passe PEP-molekylet i tettheten ved å klikke på Real Space Refine Zone i sidefeltmenyen. Slå sammen den monterte liganden med Apo-enolase.pdb ved å bruke flettemolekylalternativet i redigeringsfanen . Lagre modellen som PEP-Enolase.pdb.
      NOTAT: Man kan også bruke ligand> Jiggle-Fit Ligand-alternativet for å passe til liganden også.
    8. For å legge til ligander til resten av monomerene i koordinatfilen, klikk på Beregn > NCS-verktøy > NCS-ligander. Et eget vindu kalt Finn NCS-relaterte ligander vises. For alternativet Protein med NCS, velg koordinatfilen Apo-enolase.pdb og kjede-ID A som NCS-hovedkjede.
      1. For molekylet som inneholder ligand, velg Apo-enolase.pdb som koordinatfil og kjede-ID, J og restnummer 1 til 1. Klikk på Finn kandidatstillinger. Et vindu kalt Fitted Ligands vil dukke opp med en liste over kandidatstillinger. Evaluer tilpasningen ved å klikke på de enkelte kandidatligandene og analyser tilpasningen visuelt.
        MERK: I Servalcat/Refmac kan bare en monomermodell leveres, og symmetrien som brukes i rekonstruksjon kan gis for å oppnå en utvidet modell.
    9. Ytterligere tetthet for løsningsmiddelmolekylene ble også observert nær liganden. Høyoppløselige krystallstrukturer av enolase fra forskjellige homologer antyder tilstedeværelsen av to Mg2+ ioner40,41, som sannsynligvis stabiliserer den negative ladningen til reaksjonsmellomproduktet. Modeller to Mg2+ ioner i den aktive stedstettheten ved å klikke på plasser atom ved pekeren og velge MG fra Pointer Atom-typelisten.
      NOTAT: Bindingsgeometrien og avstanden kan brukes som en veiledning for å velge metallion. Når det gjelder Mg2+ bundet til oksygenatomer i proteinrester, varierer bindingsavstanden mellom 2,1 Å -2,4 Å, med en oktaedrisk geometri. Når det gjelder lavoppløselige kart, er imidlertid koordinasjonssfæren ofte ufullstendig, og avstanden kan også variere på grunn av begrensninger i oppløsningen.
    10. Gjenta trinn 1.2.8 for å legge til Mg2+- ionene i de symmetrirelaterte monomerene.
    11. Lagre modellen ved å klikke på Fil > Lagre koordinater > Velg filnavn > og skrive Enolase+PEP+Mg.pdb.
    12. Åpne Phoenix GUI (se Materialtabell). Kjør en reell plassforbedringsjobb med Enolase+PEP+Mg.pdb og emd_30989.map som henholdsvis inndatamodell og kart ved hjelp av standardparametere. Dette trinnet gjøres iterativt med Coot for å oppnå god kartmodelltilpasning og geometri.
      NOTAT: Det uskarpe differansekartet brukes til å demonstrere tilstedeværelsen av ligand, for eksempel i en figur. For modelleringsformål har B-faktor skjerpet kart blitt brukt og anbefales. Det B-faktor skjerpede kartet kan også brukes til å beregne differansekartet for demonstrasjonsformål i motsetning til det uskarpe kartet. Men hvis oppløsningen er lavere i området der liganden er bundet, kan det hende at den enkle B-faktoren som brukes til å gjøre hele kartet skarpere ikke tydelig avslører ligandtettheten.
  3. Visualisering og figurgenerering av den modellerte liganden
    1. Åpne den raffinerte Enolase+PEP+Mg-modellen fra den endelige Phoenix-foredlingsjobben i PyMOL42 (se materialfortegnelse) ved å klikke på Fil > Åpne og velge filnavnet.
    2. Last inn emd-30989.map (PEP-bundet skarpt kart) ved å klikke på Fil > Åpne og velge filnavnet.
    3. Gi nytt navn til kartet som PEP-skjerpet ved å klikke på handlinger > gi nytt navn mot det emd_30989 objektet og skrive PEP-skjerpet.
      MERK: I de fleste tilfeller, for eksempel enolase, normaliseres kartene når de åpnes i pymol ettersom normaliser kartalternativet er merket av som standard i pymol. Ettersom kryoEM-kart er sentrert på en større boks, vil normaliseringen inkludere alt i boksen. Dermed kan normaliseringen slås av før åpning i pymol.
    4. Velg ligandene ved å klikke på display > sekvens.
    5. Skriv isomesh mesh_ligands, PEP-slipt, 6.0, sele, carve=3.0 i kommandolinjen og trykk enter.
    6. Farg mesh_ligand blå ved å klikke på den siste boksen, C, ved siden av det mesh_ligand objektet.
    7. Vis restene av aktive steder, Ser-42, Asp-241, Glu-283, Asp-310, Arg-364 og Lys-386 som interagerer med PEP og Mg2+ i henholdsvis pinne- og sfærerepresentasjon, og enolase-enzymet i tegneserierepresentasjon.
    8. Strålesporing ved å skrive stråle 3600, 3600 for å generere bilder av publikasjonskvalitet og lagre som en png-fil ved å klikke på Fil > lagre og velge PEP.png som filnavn.

2. Modellering av ligander i metabotrope glutamatreseptor mGlu5

  1. Identifisere og modellere ligandtettheten i kryoEM-kartet over agonist og antagonistbundet mGlu5
    1. Last ned de to halvkartene sammen med deres tilsvarende koordinatfiler for hvert av de agonistbundne (EMD-31536, 7fd8.pdb) og antagonistbundne (EMD-31537,7fd9.pdb) mGlu5-kompleksene .
    2. Åpne ChimeraX
      1. Åpne koordinatfilen, 7fd8.pdb ved å klikke åpne og velge 7fd8.pdb.
      2. Skriv slett ligand på kommandolinjen og trykk Enter.
      3. På samme måte bruker du kommandoen delete/B for å slette kjeden B.
        MERK: Ligander og kjeder kan slettes ved å bruke rullegardinmenyen øverst ved hjelp av velg og handlinger > atomer/bindinger > slette.
      4. Lagre den uliganderte pdb ved å skrive inn følgende på kommandolinjen: lagre 7fd8_noligand_chainA.pdb #1. #1 angir modell-ID-en.
      5. Gjenta trinn 2.1.2.1-2.1.2.4 for 7fd9.pdb.
    3. Åpne CCP-EM. Opprett et nytt prosjekt med navnet mGlu5 og spesifiser prosjektkatalogen og brukernavnet.
      1. Åpne Relion fra alternativene på venstre panel.
        1. Gå til fanen Oppretting av maske .
        2. Oppgi et av halvkartene for EMD-31536 som inndata.
          MERK: Relion godtar kart med .mrc som suffiks, og EMD-kartene har .map-suffiks. Kartfilene kan åpnes i ChimeraX for undersøkelse og lagres i .mrc-format.
        3. I maskefanen angir du pikselstørrelse som 0,89 Å og innledende binariseringsterskel som 0,007.
        4. Kjør jobben med aliaset 31536 (eller et annet navn som er lett å følge).
        5. På samme måte oppretter du en maske for EMD - 31537-halvkartet.
      2. Åpne Refmac Servalcat-programmet fra alternativene i venstre panel i CCPEM.
        1. Oppgi navnet som mGlu5_agonist.
        2. Importer den 7fd8_noligand_chainA .pdb-filen som beskrevet i modellavsnitt 2.1.2.4. Oppgi plasseringen av de to halvkartene og den tilsvarende masken som er opprettet i Relion.
        3. Oppgi oppløsningen til 3,8 Å.
        4. Gå til presiseringsinnstillinger > Strict Symmetry og nevn C2 som Relion-punktgruppesymmetri.
        5. Start programmet ved å trykke på startknappen øverst.
    4. Når jobben er fullført, åpner du resultatet i Coot (alternativet er tilgjengelig øverst i resultatdelen). Dette vil vise en diffmap.mtz i Coot som standard, der fargene rød og grønn indikerer henholdsvis negative og positive tettheter.
      1. Gå til Display Manager > egenskapene til differansekartet merket DELFWT PHDELWT og endre konturnivået til 4.0 (absolutt verdi).
        MERK: Valget av terskel avhenger av kartet og oppløsningen.
      2. Skjul kartet merket FWT PHWT og molekylet merket refined.pdb.
      3. Flytt kartet rundt med musen for å visualisere den positive tettheten (farget grønn) og bringe den større blobben til midten.
      4. Gå til Fil > Hent monomer, skriv QUS og trykk enter.
      5. Gå til Beregn > modellering > Rigid Body Fit-molekylet og dobbeltklikk på QUS-monomeren for å justere molekylet slik at det passer inn i Fo-Fc-tettheten.
      6. Bruk alternativet slå sammen molekyl i redigeringsfanen for å legge til QUS-molekylet i koordinatfilen, refined.pdb.
      7. Gjenta trinn 2.1.4.3-2.1.4.6 for å tilpasse liganden med monomerkode NAG og CHS i den mindre blobben i henholdsvis det ekstracellulære og på toppen av det transmembrane domenet.
      8. Lagre koordinaten som refined_ligands.pdb.
        MERK: Oppløsningen til transmembran (TM) domenet er lavere, og dermed er det ikke diskutert her.
  2. Foredling av mGlu 5-ligandstrukturen
    1. Åpne CCPEM og klon den forrige presiseringsjobben (trinn 2.1.3.2) og kjør den med refined_ligands.pdb og skjerpet kart (emd. 31536.mrc) som inngang, ved bruk av standardparametere og C2-symmetri.
      MERK: Hvis programmet ikke gjenkjenner liganden, må CIF-filene oppgis. Disse CIF-filene kan lastes ned fra PDB eller genereres ved hjelp av forskjellige programmer (se trinn 3.1.1 for detaljer).
  3. Visualisering og figurgenerering i PyMOL
    1. Åpne refined_expanded.pdb-modellen fra den nyeste Refmac-foredlingsjobben i PyMOL.
    2. Gå til Fil > Åpne og bla til Refmac-jobbkatalogen for å laste inn diffmap_normalised_fofc.mrc-filen (differansekart fra Servalcat-jobb i trinn 2.1.3.2).
      MERK: Hvis .mrc-filtypen files ikke er synlige mens du surfer, endrer du filtypen til alle files og bla gjennom.
    3. Velg ligandene ved å bruke display > sekvens.
    4. Gå til Handlinger-knappen og gi nytt navn til utvalget til ligander.
    5. Skriv inn følgende på kommandolinjen og trykk enter: isomesh mesh_ligands, diffmap_normalised_fofc, 6.0, ligander, carve=2.5.
      NOTAT: Maskebredden kan justeres. Her brukes 0,2 maskebredde, og dette settes ved å bruke følgende kommando: sett mesh_width=0,2.
    6. Høyreklikk på en av monomerene og gå til kjede > farge for å spesifisere fargen på hver monomer. Fargelegg liganden og nettet ved å bruke den siste boksen merket c i liganden og mesh_ligands objekter. mGlu 5-reseptordimeren er vist i tegneserierepresentasjon, og monomerene er farget i blågrønn og hvete. Ligander er vist i pinne, og nettet som konturerer ligandene er farget grønt.
    7. Bruk handlingene > orientere/sentrere/zoome mot objektene og juster manuelt for å visualisere nettet og tydelig. Velg de nærliggende restene som kan samhandle med liganden, for eksempel Tyr64, Trp100 for QUS, og vis etter behov sidekjeden eller hovedkjeden eller begge deler som pinnerepresentasjon.
    8. Strålesporing for å generere høyoppløselige bilder og lagre dem som en png-fil.
      MERK: Trinnene ovenfor gjentas for det antagonistbundne kartet EMD-31537 og den tilsvarende koordinatfilen PDB-7fd9.

3. Modellering av inhibitoren, deoksygalakto-nojirimycin (DGN) og løsningsmiddelmolekyler i et høyoppløselig skjerpet kart over β-galaktosidase

  1. Identifikasjon av liganden, DGN, ved hjelp av halvkartene fra kryoEM
    1. Utarbeidelse av ukjent Ligand-ordbok for modellering [Deoxygalacto-nojirimycin(DGN)]
      MERK: Deoxygalacto-nojirimycin-ordbokfilen er inkludert i CCP4-monomerbiblioteket som DGJ (3 bokstavers ligand-ID). Likevel, her betraktes det som en ny og ukjent ligand for å illustrere prosessen med å generere ordbokfiler for ukjente ligander, DGN brukes som 3-bokstavskoden.
      1. Åpne det sammensatte sammendraget for deoksygalakto-nojirimycin (DGN) på PubChem-nettsiden og kopier smilestrengen for forbindelsen deoksygalakto-nojirimycin.
      2. Åpne Phoenix > Ligands > eLBOW.
      3. Angi smilestrengen som inndata.
      4. Spesifiser passende metode for optimalisering av ligandbygging. Her brukes enkel optimalisering.
      5. Lim inn strengen for kjemiske smil i liganddefinisjonsdelen.
      6. Oppgi en stillingstittel, utdatafilprefiks og ligand-ID på riktig måte, og trykk kjør.
        MERK: Utdataene fra jobben inneholder en koordinatfil, DGN.pdb, og en ordbokfil, DGN.cif-fil. Jligand29 kan også brukes til å lage cif-filen.
    2. Last ned β-galaktosidase-koordinatfilen (6tsh.pdb) fra PDB og fjern koordinatene for proteinkjedene (B, C, D), ligand, DGN og andre løsningsmiddelmolekyler ved å bruke et tekstredigeringsprogram eller slette kjede/sone-alternativet i Coot. Lagre koordinatfilen som apo-betaGal_chainA.pdb.
      NOTAT: ChimeraX eller Pymol kan også brukes til å fjerne ligand/løsningsmiddelmolekylet.
    3. Last ned halvkartene (emd_10563_half_map_1.map og emd_10563_half_map_2.map) fra tilleggsdata i EMD-10563-oppføringen fra EMDB.
    4. Åpne CCPEM og bruk Relion til å lage masken for kartet ved en terskel på 0,01 (som beskrevet i trinn 2.1.3.1.1-2.1.3.1.4).
    5. Kjør Servalcat (innenfor CCPEM-pakken som beskrevet i trinn 2) med halvkartene oppnådd i trinn 3.1.3 og apo-modellen i trinn 3.1.2 og D2-symmetri.
      NOTAT: Modellen må justeres til et av halvkartene eller hele kartene for å finne ligandtettheten. Dette kan gjøres ved å tilpasse modellen til kartet ved hjelp av ChimeraX og deretter lagre koordinatene i forhold til halvkartet. I dette eksemplet har halvkart og primærkartet i EMDB forskjellige boksstørrelser/rutenett, og modellen må plasseres i halvkartet.
    6. Åpne Coot.
      1. Åpne DGN.cif for ligandordboken som generert i trinn 3.1.1 med Phenix eLBOW. Dette gjøres ved å gå til File > Import CIF-ordboken og bla gjennom eLBOW-jobbkatalogen.
      2. Åpne protein- og ligandkoordinatfilene, apo-betaGal_chainA.pdb fra henholdsvis trinn 3.1.2 og DGN.pdb fra trinn 3.1.6.
      3. Åpne diffmap.mtz-filen automatisk fra Servalcat-jobben (trinn 3.1.5) og visualiser kartet merket DELFWT PHDELWT i Coot. Konturer kartet med en terskel på ~ 4 absolutt verdi.
        MERK: Det er viktig å sjekke kartstatistikken ved å skrive header map.mrc eller bruke verktøy i Chimera. All nødvendig informasjon om pikselstørrelse, boksstørrelse, minimum, gjennomsnitt og maksimal tetthet, og rms-avvik fra gjennomsnittlig tetthet kan oppnås. Det er avgjørende å sjekke pikselstørrelsen og boksstørrelsen på kryoEM-kartene. 3D-kartet representerer protein-ligandkartvolumet i et rutenett av 3D-voxels. I hver voxel lagres elektronpotensialverdien eller sannsynligheten for å finne elektronet på det stedet. Når en viss terskel er valgt, blir voxelene, som har en tetthet lavere enn den angitte verdien, satt til null. Dette bidrar til å minimere den eksperimentelle støyen i kartet og visualisere kartfunksjonene bedre43. Kartet bør derfor kontureres på en terskel der kartfunksjonene er lett synlige og støyen i kartet er minimal.
      4. Gå til Ligand > finne ligander. I det nye vinduet som vises, velger du ligand, differansekartet og apo-betaGal_chainA.pdb-modellen. La de andre alternativene være i standardinnstillingene og klikk på Finn ligander for å starte søket.
      5. En liste over topptreff som viser potensiell ligandtetthet vises med en kopi plassert i hver av tetthetene. Sjekk manuelt alle treffene der liganden er plassert. Behold de mest sannsynlige treffene og fjern de tvetydige.
        MERK: Forskjellen i karttetthet ved en høy terskel antyder tydelig tilstedeværelsen av liganden på det aktive stedet.
  2. Modellering av ligand-DGN- og løsningsmiddelmolekyler
    1. Utfør en reell romfinjustering i Coot for å passe til liganden (DGN.pdb) i differansetetthetskartet, og slå deretter sammen ligandkoordinatene med apo-betaGal_chainA.pdb og lagre den som betaGal_chainA+ligand.pdb.
      MERK: Ligandene som er plassert i områder av andre kjeder kan fjernes og slås ikke sammen mens du lagrer den sammenslåtte koordinatfilen. Ligandene i andre kjeder kan genereres av NCS-ligander som vist i eksempel 1, trinn 1.2.8, eller i Refmac/Servalcat ved hjelp av symmetriekspansjon.
    2. Kjør en annen Servalcat-jobb som ovenfor (trinn 3.1.5) med betaGal_chainA+ligand.pdb som inngangsmodell og halvkartene (fra trinn 3.1.3) med D2-symmetri.
    3. Differansetetthet (fra Servalcat-jobben i trinn 3.2.2) rundt den modellerte liganden antyder tilstedeværelsen av løsningsmiddelmolekylene som koordinerer med ligandmolekylet. Den sentrale tettheten nær liganden ser ut til å være for stor for vannmolekyler.
    4. Basert på tidligere biokjemiske og strukturelle data som indikerer tilstedeværelsen av Mg2+ i den posisjonen, modelleres Mg2+-ionet her ved å klikke på alternativet plasser atom og spesifisere atomet som MG.
    5. Modeller vannmolekyler i forskjellstettheten på det aktive stedet som indikerer tilstedeværelsen av løsningsmiddelmolekyl ved å klikke på plassatomet ved pekeren og velge vann.
      MERK: Coot har også muligheten til å plukke vannmolekyler automatisk. Her, siden fokuset bare er på det aktive stedet, tilsettes vannmolekyler manuelt.
    6. Slå sammen koordinatene for Mg2+ og vann med betaGal+ligand.pdb-filen og lagre den som betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb.
    7. Med betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb kan du utføre Refmac-foredling i Servalcat med D2-symmetri.
      MERK: Utgangsdifferansekartet fra denne jobben kan tjene som et middel til å validere om liganden er nøyaktig modellert, da differansekartet skal vise minimal gjenværende positiv eller negativ tetthet.
  3. Visualisering og figurgenerering med PyMOL
    NOTAT: Trinnene som er skissert nedenfor gir noen eksamples av å lage figurer ved hjelp av modeller og kart som kan brukes til å illustrere tilstedeværelsen av ligander og løsemidler.
    1. Åpne refined_expanded.pdb fra den siste Servalcat-jobben (trinn 3.2.6) med liganden og løsemidlet modellert.
    2. Velg forskjellige kjeder separat for å fargelegge dem magenta, gule, grønne og blågrønne, som beskrevet i eksempel 2.
    3. Gå til Vis > sekvens, gjør separate valg for vannmolekylene, magnesium og DGN, og gi objektene nytt navn til henholdsvis vann, MG og DGN.
    4. Vis MG- og vannmolekyler som kuler ved å velge objektene, høyreklikke og vise > kule. På samme måte viser du liganden i pinnerepresentasjon og farger ligandene og løsemidlene på riktig måte. I dette tilfellet har liganden blitt farget gul av et heteroatom, magnesiumionet er farget lilla, og vannmolekyler er farget røde.
    5. Velg DGN-, MG- og vannmolekyler. Høyreklikk og velg handlinger > kopierer til objekt og navngir det som ligander.
    6. Åpne diffmap_normalised_fo.mrc fra Servalcat-jobben i trinn 3.2.6 og gi nytt navn til ligand_fo.mrc. Skriv inn følgende kommando: isomesh mesh_ligands_fo, ligand_fo, 3, ligander, carve=2.
      MERK: Utskjæringsalternativet på 2 Å brukes rundt atomene, og avhengig av oppløsningen og kvaliteten på kartene kan verdier på 3-5 brukes. Videre, når du åpner kryoEM-kart i PyMOL, er det tilrådelig å sette normalize_ccp4_maps til av.
    7. Bruk handlingene > orientere/zoome alternativer og juster manuelt for å visualisere ligandene og nærliggende samvirkende rester (der det er aktuelt) som vist i trinn 2.3.7.
    8. Strålespor disse scenene for å lagre høyoppløselige bilder ved hjelp av kommandostråle 3600, 3600.
    9. Lagre scenen som .png fil.
      NOTAT: Følgende trinn er valgfrie og skisserer prosessen for å visualisere (1) differansetettheten (Fo-Fc) for den umodellerte liganden, DGN, (2) tettheten (Fo) til den modellerte liganden, DGN samt differansetettheten (Fo-Fc) for umodellerte løsningsmidler og til slutt for (3) tettheten (Fo) for den modellerte liganden, DGN og løsningsmiddelmolekylene i det aktive stedet.
    10. For å demonstrere tilstedeværelsen av liganden, DGN og omkringliggende løsningsmiddelmolekyler ved hjelp av differansekartet, åpne diffmap_normalised_fofc.mrc fra Servalcat-jobben i trinn 3.1.5. Gi nytt navn til kartfilen til unliganded_fofc.mrc ved å klikke handlinger > gi nytt navn ved siden av kartobjektet. Skriv inn følgende på kommandolinjen: isomesh mesh_ligands_fofc, unliganded_fofc, ligander, level=6, carve=2.
    11. For å demonstrere tettheten til den modellerte liganden, DGN og den omkringliggende umodellerte løsningsmiddeltettheten, åpne diffmap_normalised_fo.mrc så vel som diffmap_normalised_fofc.mrc fra servalcat-jobben i trinn 3.2.2. Endre navnet på diffmap_normalised_fo.mrc som DGN_fo og diffmap_normalised_fofc.mrc som DGN_unmodelled_solvents_fofc.
    12. Velg MG og vann fra Display > Sequence, høyreklikk og velg handlinger > kopiere til objekt, og navngi dem som løsemidler.
    13. Skriv inn følgende på kommandolinjen: isomesh mesh_DGN_fo, DGN_fo, DGN, nivå=3, carve=2; isomesh mesh_solvent_fofc, DGN_unmodelled_solvents_fofc, løsemidler, nivå=6, carve=2.
      NOTAT: mesh_DGN_fo vil vise tettheten til liganden, og mesh_solvent_fofc vil vise utelatelsestettheten for MG og vann.
    14. Til slutt, for å visualisere de modellerte ligandene så vel som de omkringliggende løsningsmiddelmolekylene i det aktive stedet, åpne diffmap_normalised_fo.mrc fra Servalcat-jobben i trinn 3.2.6 og gi den nytt navn til ligand_fo.mrc.
    15. Skriv inn følgende på kommandolinjen: isomesh mesh_ligand_fo, ligand_fo, selection=liganders, level=3, carve=2.
      MERK: Her brukte vi diffmap_normalised_fo.mrc, men det endelige skjerpede kartet kan brukes til å vise tettheten av ligander og de omkringliggende restene. Det er en god praksis å nevne hvilken type kart som brukes, B-faktor skarphetsverdier i figurforklaringen.
    16. Maskebredden og kulestørrelsen kan stilles inn ved å skrive inn følgende kommandoer: sett mesh_width=0.2 og sett sphere_scale=0.25 for å gjøre kulestørrelsen mindre.
    17. Farg fo mesh blå og fofc mesh grønn.
    18. Bruk handlingene > orientere/zoome alternativer og juster manuelt for å visualisere ligandene og nærliggende interagerende rester (der det er aktuelt), som vist i trinn 2.3.7.
    19. Strålespor disse scenene for å lagre høyoppløselige bilder ved hjelp av kommandostråle 3600, 3600.
    20. Lagre de enkelte scenene som .png filer.

4. Effekt av oppløsning på ligandmodellering i β-galaktosidase

  1. Åpne Terminal og gå til katalogen som inneholder de to halvkartene.
  2. Åpne de to halvkartene (trinn 3.1.3) i .map-format i ChimeraX, visualiser dem og lagre dem som emd10563_half1_1_unfil.mrc og emd10563_half2_1_unfil.mrc.
  3. Masken som ble opprettet i trinn 3.1.4 kan brukes som inndata.
  4. Kjør en PostProcessing-jobb i Relion ved hjelp av halvkart og masker fra trinn 4.2-4.3, med standardparameterne.
  5. Gjenta trinn 4.4, nå med en Hopp over FSC-veiing aktivert og spesifiser et ad-hoc lavpassfilter på 3 Å.
  6. Gjenta trinn 4.4 med et ad-hoc lavpassfilter på 3,5 Å.
  7. Åpne kartene (postprocess.mrc) fra trinn 4.4-4.6, filtrer med forskjellige oppløsninger, og modellkoordinaten, 6tsh.pdb (justert til halvkartene i ChimeraX) fra trinn 3.1.2 i PyMOL. Gi nytt navn til de forskjellige kartene som 3.0, 3.5 og 2.3 som definert av oppløsningene deres.
    MERK: Man kan bekrefte lavpassfiltreringen av kartene ved å visualisere dem i ChimeraX eller Coot.
  8. Visualiser effekten av oppløsning på tettheten til ligand- og løsningsmiddelmolekyler ved å lage et nett på 2 Å rundt ligand- og løsningsmiddelmolekylene ved en terskel på 6σ som beskrevet i trinn 3.3.6 med kart filtrert til forskjellige oppløsninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eksempel 1
Enzymet enolase fra M. tuberculosis katalyserer det nest siste trinnet av glykolyse og omdanner 2-fosfoglyserat til fosfoenolpyruvat (PEP), som er et essensielt mellomprodukt for flere metabolske veier44,45. CryoEM-data for apo-enolase- og PEP-bundne enolaseprøver ble samlet inn med samme pikselstørrelse på 1,07 Å, og bildebehandling ble utført med Relion 3,146,47. Apo-enolase- og PEP-enolase-strukturene ble bestemt til henholdsvis 3,1 Å og 3,2 Å,48. Kartene og modellene ble deponert i EMDB og PDB49,50 (EMD-30988, EMD-30989, PDB-7e4x og PDB-7e51). KryoEM-kartet til enzymet viser at det er en oktamer i løsningen (figur 1A). For å identifisere ligandtettheten i PEP-enolase-kartet, ble de uskarpe kartene til apoenzymet og PEP-bundet enzym valgt, og et differansekart ble beregnet i ChimeraX, ved å trekke PEP-enolase-kartet fra apoenzymkartet. En distinkt tetthet (grønn) ved høy terskel ble observert, noe som antydet tilstedeværelsen av liganden (figur 1B). Modellering av proteinkjeden i det uskarpe kartet indikerte tydelig at den ekstra tettheten er tilstede i det aktive stedet til proteinet (figur 1C). Liganden, PEP, ble deretter modellert i B-faktor-skjerpekartet ved hjelp av Coot, og protein+ligand-modellen ble raffinert i det virkelige rommet med Phenix. To Mg2+-ioner ble modellert i tettheten observert i nærheten av liganden (figur 1D). Liganden, PEP, har en lignende orientering som observert i andre enolase-homologer, og flere aktive stedrester, som Lys-386, Arg-364, danner hydrogenbindingsinteraksjoner med liganden PEP. Mg2+-ionene danner metallkoordinasjonsbindinger med Asp-241, Glu-283, Asp-310 og fosfatet til PEP (figur 1D).

Eksempel 2
I fravær av en tilgjengelig apo-proteinstruktur eller hvis proteinet gjennomgår en stor konformasjonsendring, er det ikke mulig å beregne differansekartene som beskrevet ovenfor. I 2021 introduserte Garib Murshudovs gruppe ved Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, Servalcat22, som implementerer en foredlingsarbeidsflyt ved hjelp av Refmac og også beregner et Fo-Fc-forskjellskart etter foredling. En positiv Fo-Fc-differenstetthet antyder tilstedeværelsen av molekyler/ligander som ikke ble inkludert i modellen under foredling, i hovedsak et utelatelseskart. Det anbefales imidlertid å først vurdere modellens tilpasning til kartet generelt og deretter evaluere differansetetthetskartet.

For å illustrere bruken av Servalcat/Refmac, ble mGlu5, en dimer G-proteinkoblet reseptor som binder seg til nevrotransmitteren, L-glutamat valgt. Ved binding av agonisten, L-quisqualate, reorienterer det ekstracellulære domenet, noe som utløser rotasjonen av 7TM, og bringer dem nærmere for å stabilisere den aktiverte tilstanden. Dermed er det observert en stor konformasjonsendring mellom apo/antagonist vs. agonistbundne tilstander51 (figur 2A og figur 2E). De to halvkartene for både agonisten (EMD-31536) og antagonisten (EMD-31537) bundne komplekser ble hentet fra EMDB, og kryoEM-kartene viser variert oppløsning over molekylet og bedre oppløst ekstracellulært domene. Deretter ble disse brukt som innganger i Servalcat sammen med apo-proteinet som modell for å beregne forskjellen eller Fo-Fc-kartet for hvert datasett. Dette kartet viste tydelig tilstedeværelsen av forskjellige ligandmolekyler (ikke-protein). Oppløsningen estimert ved FSC (Fourier Shell-korrelasjon) for de agonist- og antagonistbundne kompleksene var henholdsvis 3,8 Å og 4,0 Å. Når det gjelder den agonistbundne mGlu5, viste Servalcat Fo-Fc-differansekartet tilstedeværelsen av både agonisten (L-quisqualate) (figur 2B) og N-acetylglukosamin (NAG) (figur 2C) i ECD til reseptoren (på grunn av lavere oppløsning av TMD, her fokuserer vi bare i ECD og toppen av TMD). Proteinrester, inkludert Tyr-64, Trp-100, Ser-151 og Thr-175, sees å interagere med agonisten. Tetthet nær Asn-210-resten antydet tilstedeværelsen av N-acetylglukosamin (figur 2C). En tetthet forenlig med kolesterylhemisuccinat, som ble tilsatt under rensingen av mGlu5, ble observert nær toppen av transmembranhelix 1 (figur 2D). Siden oppløsningen er moderat og liganden, L-quisqualate, kan plasseres i forskjellige retninger, ble tidligere struktur av det ekstracellulære domenet med liganden (PDB-6N50) brukt som en guide for å modellere liganden. Antagonistbinding stabiliserer den åpne eller hvilende tilstanden til reseptoren (figur 2E). En tetthet i samsvar med antagonisten LY341495 ble observert ved hengslet til I og II av venusfluefelledomenet i ECD. Antagonisten samhandler med rester som ligner på agonistens. Stablingsinteraksjon mellom Tyr-223 i lobe II med antagonisten stabiliserer reseptoren i åpen tilstand (figur 2F). I likhet med agoniststrukturen ble glykosylering eller tilstedeværelse av N-acetylglukosamindel observert nær Asn-210 (figur 2G).

Eksempel 3
Det tredje eksemplet belyser protokollen for å modellere fragmentstore eller små ligander og løsemiddelmolekyler i høyoppløselige CryoEM-kart. Fragmentbasert legemiddeloppdagelse (FBDD) har dukket opp som en kraftig og innovativ metode i utviklingen av målbaserte nye terapier innen ulike sykdomsområder, noe som gjør det til en lovende vei innen farmasøytisk FoU52,53. FBDD begynner med screening og nøye utvalg av små, svært løselige, lavmolekylære fragmenter av molekyler som binder seg til spesifikke målproteiner eller biomolekyler av interesse. Bestemmelse av strukturene til disse proteinfragmentkompleksene avslører bindingsmåden til disse fragmentene, som fungerer som en guide for å designe større og mer komplekse medikamentlignende molekyler med økende affinitet og spesifisitet mot målproteinet54. Imidlertid krever denne metoden en høyoppløselig ligandtetthet for nøyaktig å bestemme posituren og plassere de funksjonelle gruppene til ligandenriktig 15.

β-galaktosidase, en av de første høyoppløselige strukturene som ble bestemt fra fremskrittene innen kryoEM-teknologi, er et godt studert 450kDa homotetramert enzym som katalyserer hydrolysen av laktose til glukose og galaktose55. For å vise frem bruken av kryoEM i FBDD, bestemte Astex, Storbritannia, strukturen til β-galaktosidase med en hemmer i fragmentstørrelse, deoksygalakto-nojirimycin (DGN) bundet i det aktive stedet (EMDB-10563, PDB: 6tsh)56. Dette datasettet brukes til å illustrere protokollen for å modellere ligander og løsemidler entydig i høyoppløselige kart. For å vise effekten av oppløsning på ligandmodellering og visualisering, ble kartene filtrert til 3,0 Å og 3,5 Å i etterbehandlingstrinnet i Relion. Dette fremhever kvaliteten på karttettheten ved forskjellige oppløsninger og understreker behovet for høyere oppløsning for modellering av ligander og løsemidler.

Enzymet er en tetramer med D2-symmetri i oppløsning (figur 3A). Forskjellskart (mellom kart og modell), som beregnet av Servalcat, antydet tilstedeværelsen av DGN og flere løsningsmiddelmolekyler i det aktive stedet til enzymet (figur 3B). Ved en estimert oppløsning på 2,3 Å viste tettheten høyoppløselige funksjoner, noe som hjalp til med nøyaktig modellering av inhibitoren i proteinets aktive sted. Interaksjoner mellom DGN og Tyr-503 og His-540 ble observert (figur 3C). Forskjellstettheten antydet også tilstedeværelsen av løsningsmiddelmolekyler som interagerer med DGN så vel som proteinrestene. Mg2+ og flere vannmolekyler ble modellert i tettheten (figur 3D). Metallkoordinasjonsbindinger mellom Mg2+ og Glu-416, Glu-461 og flere vannmolekyler er observert (figur 3D). Mg2+ ble sett å interagere med DGN via et vannmolekyl.

Ved en lavere oppløsning på 3,5 Å og 3,0 Å ligner ligandtettheten en klatt og mangler høyoppløselige egenskaper som er avgjørende for nøyaktig modellering av liganden (figur 4A,B). Tettheten for vannmolekyler var nesten ikke-eksisterende ved disse oppløsningene. Oppsummert, med økende oppløsning, spesielt høyere enn 3,0 Å, muliggjorde tettheten modellering av et større antall vannmolekyler (figur 4C,D). Riktig plassering av ligandens kirale senter ble oppnåelig ved ~2,3 Å (figur 4C,D) på grunn av tilstedeværelsen av distinkte trekk i kartet som styrte plasseringen samt modellering av vannmolekyler og Mg2+. Til sammenligning forble tettheten for Mg2+ merkbar over oppløsningsområdet (figur 4A-C).

Figure 1
Figur 1: Modellering av ligandfosfoenolpyruvat i M. tuberculosis enolase. (A) viser B-faktorskarpt kart over det PEP-bundne enolase-enzymet. Kartet antyder at enolase er oktamerisk i løsning, og hver monomer i kartet er farget forskjellig. (B) viser et uskarpt kryoEM-kart over apo-enolase-enzymet i grått med differansekartet (mellom PEP-bundne og apo-enolase uskarpe kart) lagt i grønt, noe som tyder på tilstedeværelsen av ligand, PEP. Dette er et demonstrasjonskart for å vise tilstedeværelsen av ligander. (C) viser passformen til enolasemodellen i det uskarpe kryoEM-kartet, og fremhever posisjonen til forskjellstettheten i forhold til proteinet. Proteinmodellen er vist i tegneserierepresentasjon og fargelagt i Chainbow. Denne figuren viser at den ekstra tettheten (grønn) er tilstede i det aktive stedet til hver monomer. (D) viser liganden, PEP, innkapslet i B-faktor-skarpt kart, farget blått. I tillegg ble det også observert tetthet for to Mg2+-ioner, som danner metallkoordinasjonsbindinger med flere aktive stedsrester, inkludert Ser-42, Asp 241, Glu-283, Asp-310 og ligandatomer. Liganden lager hydrogenbindingsinteraksjoner med Lys-386, Lys-335 og Arg-364. Proteinrestene er vist i pinnerepresentasjon, og Mg2+ ioner er vist som lilla kuler. Figurene i paneler (A-D) ble generert med Pymol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Identifisering, modellering og visualisering av ulike ligander i mGlu 5-reseptoren. Fo-Fc utelatelseskartene ble skaffet ved hjelp av Servalcat. (A) viser mGlu 5-reseptordimerstruktur (PDB-7fd8) i tegneserierepresentasjon, med hver monomer farget i henholdsvis blågrønn og hvete, og bundet til agonisten L-quisqualate. Alle ligandene som ble identifisert i det ekstracellulære og på toppen av det transmembrane domenet til reseptoren er innkapslet i Fo-Fc utelatelseskartet, farget grønt og konturert ved 6σ. (B) fremhever passformen til agonisten, L-quisqualate innkapslet i differansekartet. L-quisqualate interagerer med flere mGlu5-rester, inkludert Tyr-64, Trp-100, Ser-151, Thr-175 og Gly-280. H-bindingsinteraksjonene er representert med røde streker. I (C) er en ekstra tetthet tydelig nær Asn-210, som er tilstede i reseptorens ekstracellulære domene, og N-acetylglukosaminmolekyl (NAG) ble modellert i denne tettheten. For klarhetens skyld er ikke NAG knyttet til Asn i den nåværende figuren. (D) viser forskjellen i tetthet for kolesterolhemisuccinat (CHS) i grønt nær den lipideksponerte overflaten av reseptoren. CHS-molekylet, representert i pinnene, ble modellert i denne tettheten. (E) viser mGlu 5-reseptorstruktur (PDB-7fd9) bundet til antagonisten LY341495 i tegneserierepresentasjon. I (F) indikerer en ekstra tetthet i Fo-Fc-differansekartet som ligger ved hengslet mellom lobe I og lobe II i det ekstracellulære domenet tilstedeværelsen av antagonisten. Nøkkelrester (Tyr-64, Trp-100, Ser-152, Ser-173, Thr-175 og Tyr-223) rundt antagonisten er vist i pinne-representasjoner, og potensielle hydrogenbindingsinteraksjoner med antagonisten er vist i røde streker. (G) viser forskjellen i tetthet som tyder på tilstedeværelsen av NAG-molekyl nær Asn-210 i den antagonistbundne strukturen (merk at NAG ikke er knyttet til Asn for klarhetens skyld). Tallene ble generert med Pymol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Identifisering, modellering og foredling av en liten hemmer og løsningsmiddelmolekyler i høyoppløselige kartet over β-galaktosidase (EMD-10563). (A) viser β-galaktosidasemodellen oppløst til 2,3 Å (PDB: 6tsh) i tegneserierepresentasjon, der hver monomer er farget tydelig. Den grå boksen fremhever ligandbindingsstedet. (B) viser Fo-Fc-differanstettheten (fra Servalcat) i grønt nett i enzymets aktive sted. Forskjellen i tetthet antyder tilstedeværelsen av inhibitoren (DGN) og flere løsningsmiddelmolekyler i det aktive stedet. (C) viser at styrt av Fo-Fc-kartet, er hemmeren deoksysgalakto-nojirimycin (DGN) modellert i det aktive stedet. Denne modellerte liganden er avbildet i pinneformat og innkapslet i Fo-tettheten (av Servalcat), som er farget i blue_mesh. Hydrogenbindingsinteraksjoner mellom DGN og flere proteinrester, inkludert Tyr-503 og His-540, er observert. Den ekstra Fo-Fc-differanstettheten rundt liganden (grønn) er en indikasjon på løsningsmiddelmolekylene. (D) Kartet viser flere løsningsmiddelmolekyler, inkludert vann og Mg2+, representert som henholdsvis røde og lilla kuler, er modellert på det aktive stedet etter å ha sikret at hvert løsningsmiddelmolekyl er bundet til enten protein (Glu-416, His-418 og Glu-461) eller liganderester. Vannmolekylene og Mg2+ er innkapslet i Fo-tettheten (blått nett). Mg2+ ses å interagere med liganden, DGN via et vannmolekyl. Fo-Fc-kartet (grønt nett) i paneler (B,C) er konturert ved 6σ, mens Fo-tettheten - blått nett i C og D (fra Servalcat-foredlingen etter modellering) er konturert ved 3σ. Figurene i paneler (A-D) ble generert med Pymol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Effekt av oppløsning på ligandmodellering i β-galaktosidase. Halvkart fra EMD-10563 ble brukt som input i Relion etterprosesstrinnet, og de kombinerte etterbehandlingskartene ble filtrert til oppløsningene 2,3 Å, 3,0 Å og 3,5 Å med forskjellige B-faktorer. Kartet som vises i alle panelene er konturert ved 6σ. For klarhetens skyld er bare proteinryggraden vist uten sidekjeder, ligand eller løsningsmiddelmolekyler i panelene A, B og C. (A) Kartet er filtrert til 3,5 Å, og det aktive stedet for β-galaktosidase vises. En blob som ligner liganden, DGN, sees med denne oppløsningen, ledsaget av noen mindre blobber i nærheten. Modellering av liganden i riktig retning viser seg å være utfordrende på grunn av mangelen på distinkte funksjoner i kartet. (B) Kartet filtrert til 3.0 Å oppløsning vises. Her blir ligandblobben litt mer definert, men mangler fortsatt funksjoner generelt. Noen flere små klumper som tyder på løsemiddelmolekyler er også observert. (C) Kartet filtrert til 2,3 Å-oppløsning avslører ligandtettheten med distinkte funksjoner, spesielt avslører stolkonformasjonen til iminosukkeret. Et betydelig antall små klumper som tilsvarer vannmolekyler er observert ved denne oppløsningen. Den automatiske B-faktorestimeringen/skjerpingen i Relion etterbehandling gir en verdi på -18 Å2 for kartene filtrert til 3 Å og 3,5 Å, mens verdien er -52 Å2 for kartet filtrert til 2,3 Å. Ulik B-faktor skarphet av EM-kart kan også utføres med Coot og nyttig i modellbygging. (D) Panelet illustrerer at liganden DGN (pinnerepresentasjon), Mg2+ og vannmolekyler (som kuler) som modellert i det aktive stedet og det skjerpede kartet ved 2,3 Å, vist i blått nett som omgir disse atomene. Figurene i paneler (A-D) ble generert med Pymol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forbedringene i mikroskopmaskinvare og -programvare har resultert i en økning i antall kryoEM-strukturer de siste årene. Selv om den høyeste oppløsningen som er oppnådd for øyeblikket i enkeltpartikkelkryoEM er 1,2 Å 57,58,59, blir flertallet av strukturene bestemt rundt 3-4 Å oppløsning. Modellering av ligander i kart med middels til lav oppløsning kan være vanskelig og ofte full av tvetydighet. Gitt den utbredte bruken av cryoEM i både akademia og farmasøytisk industri for translasjonsforskning og legemiddeloppdagelse, er det viktig å sikre at ligander modelleres riktig og uten tvetydighet. Derfor er det klokt å kvantifisere løseligheten til ligandatomer ved å beregne Q-score60, som nå er tilgjengelig i EMDB som en beregning for å evaluere kvaliteten på kartene og passformen til modellen så vel som i Chimera.

I det første eksemplet ble ChimeraX brukt til å beregne differansekartet i reelt rom mellom apo og de ligandbundne kartene i M. tuberculosis enolase-enzymet. Den ekstra tettheten ved høy terskel antyder tilstedeværelsen av liganden, fosfoenolpyruvat, i det aktive stedet og Mg2+ bundet til liganden. Det er viktig å merke seg at kartet i dette tilfellet har middels oppløsning (3,2 Å), og vannmolekyler kan ikke modelleres trygt (figur 1). Begrensningen knyttet til denne metoden er at den bare kan brukes når ligandbinding ikke induserer signifikante konformasjonsendringer i proteinet. Kartnormalisering ble ikke utført i dette tilfellet siden både apo- og ligandbundne datasett ble innhentet med samme pikselstørrelse og behandlet med identiske parametere i Relion. Det er imidlertid verdt å merke seg at når man sammenligner kart generert av forskjellige rekonstruksjonsprogrammer, som Relion46,47 og CryoSparc61, eller med ulik kvalitet, blir normalisering av kartene avgjørende før meningsfulle sammenligninger kan gjøres.

Det neste eksemplet er mGlu5, som gjennomgår stor molekylær omorganisering ved agonistbinding, som det fremgår av kryoEM-strukturene51,62 (figur 2). I dette scenariet er det ikke mulig å beregne et enkelt forskjellskart mellom de ubundne (apo) og ligandbundne reseptorene på grunn av betydelige forskjeller mellom kartene. Her ble Servalcat, som bruker uskarpe og uvektede halvavbildninger som input for foredling i gjensidig rom og deretter beregner et differansekart mellom det eksperimentelle kartet og kartet avledet fra modellen, brukt. Ved en høy terskel kan man visualisere forskjeller og fungere som en guide for korreksjon og forbedring av modellen. Flere umodellerte blobber i det ekstracellulære og nær det transmembrane domenet til mGlu5 ble observert og brukt som en guide til å modellere ligander (figur 2).

Det tredje eksemplet viser hvordan oppløsning (2,3 Å) spiller en avgjørende rolle i karttolkning og modellering av en fragmentstørrelse inhibitor i β-galaktosidase. Her var utfordringen å identifisere en veldig liten ligand (<200 Da) i Servalcat-differansekartet midt i den iboende støyen i dataene og modellere den nøyaktig. I tillegg til den høye globale oppløsningen bestemt ved hjelp av Fourier Shell Correlation (FSC), var den lokale oppløsningen som var spesifikk for liganden også tilstrekkelig høy til å sikre nøyaktig plassering av de kirale sentrene til ligandene (figur 3). Tetthet for løsningsmiddelmolekyler ble observert i differansekartet gjennom hele enzymet og spesielt rundt liganden. Effekten av oppløsning på modelleringsligander og løsningsmiddelatomer ble også demonstrert (figur 4). Det er viktig å utvise forsiktighet når du modellerer vann- eller løsemiddelmolekyler fordi støy ved lav terskel noen ganger kan ligne vann eller løsemiddelmolekyler, noe som fører til potensielle feiltolkninger.

En annen viktig vurdering er at kryoEM-kartene alene kanskje ikke er tilstrekkelig til å identifisere et metallion på egen hånd. Ytterligere biofysiske metoder som Extended X-ray Absorption Fine Structure (EXAFS) eller Energy-Dispersive X-ray Spectroscopy (EDX) er ofte nødvendige for å bekrefte tilstedeværelsen og identiteten til metallionet. I både enolase- og β-galaktosidaseenzymer ble Mg2+ modellert på grunn av mengden informasjon som allerede er tilgjengelig om disse proteinene, noe som bekrefter identiteten til metallionet. Også koordinasjonen av metallionene i disse tilfellene, eksemplifisert ved den klassiske oktaedriske geometrien og de nesten ideelle koordinasjonsavstandene til Mg2+, ga betydelig bevis på deres identitet.

Generelt bør noen viktige hensyn tas i betraktning når du modellerer ligander i kryoEM-kart. Til å begynne med er det viktig å velge riktig kart for ligandidentifikasjon og modellering. I alle tilfeller anbefales et uskarpt og uvektet kart eller halvkart over et skjerpet og vektet kart for å visualisere ligandtettheten, da skarphet og vekting kan resultere i underskjerpede eller overskjerpede (støy på grunn av serieavslutning) områder i kartet. Dette kan resultere i en suboptimal ligandtetthet, og bruk av forskjellig B-faktor sliping kan brukes for å evaluere tettheten under modellbygging i Coot. Selv om det er en risiko ved å bruke det skjerpede kartet til å identifisere ligander i et kryoEM-kart, kan det hende at det uskarpe kartet ikke viser alle detaljene i ligandtettheten, men kan brukes til demonstrasjonsformål, som vist i figur 1B,C.

Posituren til den modellerte liganden bør valideres, spesielt i tilfeller der dataene er svake. Som vist her for mGlu5, varierer den lokale oppløsningen på tvers av kryoEM-kartet, og objektiv modellering av liganden kan være utfordrende. Servalcat kan brukes som et verdifullt verktøy for å oppdage potensielle unøyaktigheter i protein- og ligandmodellering22.

Sammensetningsheterogenitet kan være tilstede i et protein-ligandkompleks der bare en spesifikk populasjon kan ha liganden tilstede (hvis liganden har lav molekylvekt, kan det hende at klassifiseringstrinnet ikke fjerner heterogeniteten). Likevel er det viktig å utføre 3D-klassifiseringen63 trinn iterativt under bildebehandling før ligandmodellering og verifisere om tettheten til liganden forbedres. Hvis flere kopier av protein er tilstede, bør det utvises forsiktighet når du bruker symmetri over kartet under innledende modellgenerering og foredling, da dette kan gjennomsnitte ligandtettheten i alle de symmetrirelaterte molekylene. Symmetri bør bare pålegges etter at kartet er grundig inspisert for å bekrefte tilstedeværelsen av ligandtetthet i alle proteinkjedene.

Avhengig av tilstanden (krystall eller løsning) og plasseringen (nedgravd eller overflate), kan atomene være dynamiske, og i modellforedling blir dette referert til som atomforskyvningsparameteren (ADP). Sammen med differansekartet, som gir visuelle ledetråder til mulige unøyaktigheter i modellen, kan ADP-verdier brukes til å evaluere nøyaktigheten til ligandene etter foredling 64,65,66,67. Vanligvis bør liganden ha lignende ADP-verdier som de omkringliggende restene, det vil si hvis de er stabilt bundet og modellert nøyaktig. Imidlertid kan ligander i periferien eller atomene til en ligand (som lipider) som er langt fra makromolekyler ha høyere ADP-verdier. I tillegg til å avgrense koordinatene, tillater både Refmac33,34 og Phenix foredling av ADP-verdier 28,68. I Refmac brukes Mott-Bethe-tilnærmingen til å beregne elektronspredningsfaktoren til individuelle atomer under kartberegning. I den siste versjonen av Phenix har individuell B-faktorforedling, som ligner på krystallografi, blitt introdusert for å redegjøre for atomforstyrrelse. Svært ofte, i de raffinerte modellene avledet fra cryoEM, observeres et bredt spekter av ADP-verdier (noen ganger verdier nær null), og til og med Q-score som brukes i EMDB for å evaluere modellens tilpasning til kartet, avhenger av det primære kartet som er avsatt og arten av B-faktorskarphet60. I cryoEM-modellbygging brukes ofte flere kart, og derfor bør kartene som brukes i modellering og foredling tydelig nevnes i metodene, da på grunn av anisotropisk oppløsning i mange makromolekyler, kan det hende at ett enkelt kart ikke er tilstrekkelig til å forklare alle detaljene. 

Ved modellering av ligander i makromolekyler er en av hovedbegrensningene ved kryoEM-kart (som i krystallografi) at hvis ligandbindingsstedet har lav oppløsning eller hvis den bundne liganden er dynamisk, kan det vise seg vanskelig å fastslå riktig konformasjon. I tillegg har de fleste kryoEM-strukturer oppløsninger under 3 Å, og representasjonen av vannmolekyler i kartene er begrenset, noe som gjør det vanskelig å vurdere rollen til hydrering i ligand- eller medikamentbinding (som vist her med eksemplene på enolase og mGluR). Beregningsmetoder kan brukes i kombinasjon med kryoEM-data for å adressere disse begrensningene69. I motsetning til krystallografi er det bare modellen som gjennomgår foredling, ikke kartet. Foreløpig er den eneste metoden for å indikere tilstedeværelsen av en ligand eller sikre nøyaktig modellering ved å generere utelatte kart (ved hjelp av verktøy som Servalcat). Dermed finnes det en rekke verktøy for å hjelpe forskere med å bygge og evaluere modellen, men det er flere områder innen modellforedling der nyere tilnærminger eller modifikasjoner av nåværende tilnærminger kan forventes i nær fremtid.

I denne artikkelen har vi fokusert på dagens tilnærminger for modellering av ligander, som inkluderer manuell inspeksjon av ligandtettheten, generering av ligandgeometrifilen, etterfulgt av modellering av liganden i kryoEM-kartet. Dette er en spennende periode innen strukturbiologi og legemiddeloppdagelse, ettersom direkte elektrondetektorer med raskere bildefrekvenser og bruk av raskere datainnsamling70 har resultert i oppnåelse av høyoppløselige kart (<2,8 Å) av flere makromolekyler ofte bundet med små molekylære ligander på relativt kort tid. Den nylige introduksjonen av automatiserte ligandmodelleringsverktøy som GEMspot69 i Schrödinger-suiten og EMERALD17 i Rosetta-suiten, som forsøker å finne den mest sannsynlige bundne posituren til liganden mens de tar hensyn til de eksperimentelle kryoEM-dataene, lover å strømlinjeforme og automatisere denne prosessen. I likhet med røntgenkrystallografi er det tenkt at identifisering av bindingsmodusene til småmolekylære ligander ved hjelp av kryoEM, kanskje to eller flere på en enkelt dag, vil bli en realistisk mulighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

SJ er mottaker av ph.d.-stipendet fra DAE-TIFR, og støtten er anerkjent. KRV anerkjenner DBT B-Life-tilskuddet DBT/PR12422/MED/31/287/2014 og støtten fra Department of Atomic Energy, Indias regjering, under prosjektidentifikasjon nr. RTI4006.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CCP4-8.0 Consortium of several institutes https://www.ccp4.ac.uk Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography
CCP-EM Consortium of several institutes https://www.ccpem.ac.uk/download.php Free for academic users and includes Coot, Relion and many others
Coot  Paul Emsley, LMB, Cambridge https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ General software for model building but also available with other suites described above
DockinMap (Phenix) Consortium of several institutes https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps
Electron Microscopy Data Bank  Consortium of several institutes https://www.ebi.ac.uk/emdb/ Public Repository for Electron Microscopy maps
Falcon Thermo Fisher Scientific  https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf Commercial, camera from Thermo Fisher 
Phenix  Consortium of several institutes https://phenix-online.org/download Free for academic users and includes Coot
Protein Data Bank Consortium of several institutes https://rcsb.org Public database of macromolecular structures
Pymol Schrodinger https://pymol.org/2/ Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.
Relion MRC-LMB, Cambridge https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM
Titan Krios Thermo Fisher Scientific  https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&
gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA
AkZesWC4FYQSwIQRk
ZApkj08MfYG040DtiiuL8
RihoCebEQAvD_BwE		 Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF Chimera UCSF, USA https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html General purpose software for display, analysis and more
UCSF Chimera X UCSF, USA https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/ General purpose software for display, analysis and more

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Steinbrecher, T., Labahn, A. Towards accurate free energy calculations in ligand protein-binding studies. Curr Med Chem. 17, 767-785 (2010).
  2. Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: a case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 4, 3502514 (2018).
  3. Grinter, S. Z., Zou, X. Challenges, applications, and recent advances of protein-ligand docking in structure-based drug design. Molecules. 19 (7), 10150-10176 (2014).
  4. Henderson, R., Hasnain, S. Cryo-EM': electron cryomicroscopy, cryo electron microscopy or something else. IUCrJ. 10 (5), 519-520 (2023).
  5. Rosenthal, P. B. A potential difference for single-particle cryo-EM. IUCrJ. 6, 988-989 (2019).
  6. Wang, J., Moore, P. B. On the interpretation of electron microscopic maps of biological macromolecules. Prot Sci. 26 (1), 122-129 (2017).
  7. Murshudov, G. N. Refinement of atomic structures against cryo-EM Maps. Meth Enzymol. 579, 277-305 (2016).
  8. Kulik, M., Chodkiewicz, M. L., Dominiak, P. M. Theoretical 3D electron diffraction electrostatic potential maps of proteins modeled with a multipolar pseudoatom data bank. Acta Crystallogr D Struct Biol. 78 (8), 1010-1020 (2022).
  9. Yonekura, K., Kato, K., Ogasawara, M., Tomita, M., Toyoshima, C. Electron crystallography of ultrathin 3D protein crystals: Atomic model with charges. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (11), 3368-3373 (2015).
  10. Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED). Annu Rev Biochem. 90, 431-450 (2021).
  11. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  12. EMDB (the Electron Microscopy Data Bank. , Available from: www.ebi.ac.uk/emdb/ (2023).
  13. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Res. 44, 396-403 (2016).
  14. RCSB.org. , Available from: http://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2024).
  15. Lees, J. A., Dias, J. M., Han, S. Applications of Cryo-EM in small molecule and biologics drug design. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2627-2638 (2021).
  16. Robertson, M. J., Meyerowitz, J. G., Skiniotis, G. Drug discovery in the era of cryo-electron microscopy. Trends Biochem Sci. 47 (2), 124-135 (2022).
  17. Muenks, A., Zepeda, S., Zhou, G., Veesler, D., DiMaio, F. Automatic and accurate ligand structure determination guided by cryo-electron microscopy maps. Nat Commun. 14, 1164 (2023).
  18. Oldfield, T. J. X-ligand: An application for the automated addition of flexible ligands into electron density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 57 (5), 696-705 (2001).
  19. Zwart, P. H., Langer, G. G., Lamzin, V. S. Modelling bound ligands in protein crystal structures. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2230-2239 (2004).
  20. Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (8), 915-922 (2006).
  21. Casañal, A., Lohkamp, B., Emsley, P. Current developments in Coot for macromolecular model building of Electron Cryo-microscopy and Crystallographic Data. Prot Sci. 29 (4), 1069-1078 (2020).
  22. Yamashita, K., Palmer, C. M., Burnley, T., Murshudov, G. N. Cryo-EM single-particle structure refinement and map calculation using Servalcat. Acta Crystallogr D Struct Biol. 77 (10), 1282-1291 (2021).
  23. Wood, C. Collaborative computational project for electron cryo-microscopy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 123-126 (2015).
  24. Burnley, T., Palmer, C. M., Winn, M. Recent developments in the CCP-EM software suite. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (6), 469-477 (2017).
  25. Potterton, E., McNicholas, S., Krissinel, E., Cowtan, K., Noble, M. The CCP4 molecular-graphics project. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (11), 1955-1957 (2002).
  26. Agirre, J. The CCP4 suite: Integrative software for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 79 (6), 449-461 (2023).
  27. Moriarty, N. W., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Electronic ligand builder and optimization workbench (eLBOW): A tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (10), 1074-1080 (2009).
  28. Adams, P. D. A comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (2), 213-221 (2010).
  29. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (12), 2126-2132 (2004).
  30. Debreczeni, J. É, Emsley, P. Handling ligands with Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 425-430 (2012).
  31. Long, F., et al. AceDRG: A stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (2), 112-122 (2017).
  32. Schrödinger. LigPrep. Schrödinger Release 2022-1: Schrödinger, LLC. , Schrödinger, LLC. New York, NY. (2022).
  33. Brown, A. Tools for macromolecular model building and refinement into electron cryo-microscopy reconstructions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 136-153 (2015).
  34. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 53, 240-255 (1997).
  35. Kovalevskiy, O., Nicholls, R. A., Long, F., Carlon, A., Murshudov, G. N. Overview of refinement procedures within REFMAC 5: Utilizing data from different sources. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (3), 215-227 (2018).
  36. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67 (4), 235-242 (2011).
  37. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera - A visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  38. Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Prot Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
  39. Lamb, A. L., Kappock, T. J., Silvaggi, N. R. You are lost without a map: Navigating the sea of protein structures. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 1854 (4), 256-268 (2015).
  40. Ehinger, S., Schubert, W. D., Bergmann, S., Hammerschmidt, S., Heinz, D. W. Plasmin(ogen)-binding α-Enolase from streptococcus pneumoniae: Crystal structure and evaluation of plasmin(ogen)-binding sites. J Mol Biol. 343 (4), 997-1005 (2004).
  41. Tjia-Fleck, S., Readnour, B. M., Ayinuola, Y. A., Castellino, F. J. High-Resolution single-particle cryo-EM hydrated structure of streptococcus pyogenes enolase offers insights into its function as a plasminogen receptor. Biochemistry. 62 (3), 735-746 (2023).
  42. DeLano, W. L. The PyMOL molecular graphics system. Schrödinger LLC wwwpymolorg. Version 1. , Available from: http://www.pymol.org (2002).
  43. Pfab, J., Si, D. Automated threshold selection for cryo-EM density maps. ACM-BCB 2019. Proceedings of the 10th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology and Health Informatics. , 161-166 (2019).
  44. Rahi, A., et al. Enolase of Mycobacterium tuberculosis is a surface exposed plasminogen binding protein. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 1861 (1), 3355-3364 (2017).
  45. Henderson, B., Martin, A. Bacterial virulence in the moonlight: Multitasking bacterial moonlighting proteins are virulence determinants in infectious disease. Infect Immun. 79 (9), 3476-3491 (2011).
  46. Scheres, S. H. W. A bayesian view on cryo-EM structure determination. J Mol Biol. 415 (2), 406-418 (2012).
  47. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
  48. Mohammed, A., et al. Structural snapshots of Mycobacterium tuberculosis enolase reveal dual mode of 2PG binding and its implication in enzyme catalysis. IUCrJ. 10 (6), 738-753 (2023).
  49. RCSB Protein Data Bank (RCSB PDB). , Available from: http://www.rcsb.org (2023).
  50. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 3-21 (2000).
  51. Nasrallah, C. Agonists and allosteric modulators promote signaling from different metabotropic glutamate receptor 5 conformations. Cell Rep. 36 (9), 109648 (2021).
  52. Doak, B. C., Norton, R. S., Scanlon, M. J. The ways and means of fragment-based drug design. Pharmacol Ther. 167, 28-37 (2016).
  53. Baker, M. Fragment-based lead discovery grows up. Nat Rev Drug Discov. 12 (1), 5-7 (2013).
  54. Kirsch, P., Hartman, A. M., Hirsch, A. K. H., Empting, M. Concepts and core principles of fragment-based drug design. Molecules. 24 (3), 4309 (2019).
  55. Bartesaghi, A., et al. 2.2 Å resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science. 348 (6239), 1147-1151 (2015).
  56. Saur, M. Fragment-based drug discovery using cryo-EM. Drug Discov Today. 25 (3), 485-490 (2020).
  57. Maki-Yonekura, S., Kawakami, K., Takaba, K., Hamaguchi, T., Yonekura, K. Measurement of charges and chemical bonding in a cryo-EM structure. Commun Chem. 6 (1), 98 (2023).
  58. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  59. Nakane, T. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  60. Pintilie, G. Measurement of atom resolvability in cryo-EM maps with Q-scores. Nat Methods. 17 (3), 328-334 (2020).
  61. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  62. Koehl, A. Structural insights into the activation of metabotropic glutamate receptors. Nature. 566 (7742), 79-84 (2019).
  63. Scheres, S. H. W. Classification of structural heterogeneity by maximum-likelihood methods. Meth Enzymol. 482, 295-320 (2010).
  64. Carugo, O. Atomic displacement parameters in structural biology. Amino Acids. 50 (7), 775-786 (2018).
  65. Wlodawer, A., Li, M., Dauter, Z. High-resolution Cryo-EM maps and models: A crystallographer's perspective. Structure. 25 (10), 1589-1597 (2017).
  66. Masmaliyeva, R. C., Babai, K. H., Murshudov, G. N. Local and global analysis of macromolecular atomic displacement parameters. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (10), 926-937 (2020).
  67. Merritt, E. A. To B or not to B: A question of resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 468-477 (2012).
  68. Afonine, P. V., et al. Real-space refinement in PHENIX for cryo-EM and crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (60), 531-544 (2018).
  69. Roberts on, M. J., van Zundert, G. C. P., Borrelli, K., Skiniotis, G. GemSpot: A pipeline for robust modeling of ligands into Cryo-EM maps. Structure. 28 (6), 707-716 (2020).
  70. Weis, F., Hagen, W. J. H. Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (8), 724-728 (2020).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 209
Modellering av ligander til kart avledet fra elektronkryomikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jha, S., Bose, S., Vinothkumar, K.… More

Jha, S., Bose, S., Vinothkumar, K. R. Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy. J. Vis. Exp. (209), e66310, doi:10.3791/66310 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter