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Biochemistry

इलेक्ट्रॉन क्रायोमाइक्रोस्कोपी से प्राप्त मानचित्रों में लिगैंड मॉडलिंग

Published: July 19, 2024 doi: 10.3791/66310
Automatic Translation
*1, *2, 1
1National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, 2Institute for Stem Cell Science and Regenerative Medicine
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल मैक्रोमोलेक्यूल्स के क्रायोईएम मानचित्रों में छोटे-अणु लिगेंड मॉडलिंग के लिए उपलब्ध उपकरणों का परिचय देता है।

Abstract

आणविक तंत्र, अंतर्निहित जैविक प्रक्रियाओं और दवा विकास को समझने के लिए एक मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स में प्रोटीन-लिगैंड इंटरैक्शन को समझना महत्वपूर्ण है। हाल के वर्षों में, क्रायोजेनिक नमूना इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) मैक्रोमोलेक्यूल्स की संरचनाओं को निर्धारित करने और निकट-परमाणु संकल्प पर लिगैंड बाध्यकारी के मोड की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक के रूप में उभरा है। क्रायोईएम मानचित्रों में गैर-प्रोटीन अणुओं की पहचान और मॉडलिंग अक्सर डेटा में ब्याज के अणु और अंतर्निहित शोर में अनिसोट्रोपिक रिज़ॉल्यूशन के कारण चुनौतीपूर्ण होती है। इस लेख में, पाठकों को वर्तमान में चयनित मैक्रोमोलेक्यूल्स का उपयोग करके लिगैंड पहचान, मॉडल निर्माण और परमाणु निर्देशांक के शोधन के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न सॉफ्टवेयर और विधियों से परिचित कराया जाता है। एक लिगैंड की उपस्थिति की पहचान करने के सबसे सरल तरीकों में से एक, जैसा कि एनोलेज़ एंजाइम के साथ दिखाया गया है, लिगैंड के साथ और बिना प्राप्त दो मानचित्रों को घटाना है। लिगैंड का अतिरिक्त घनत्व उच्च सीमा पर भी अंतर मानचित्र में बाहर खड़े होने की संभावना है। ऐसे उदाहरण हैं, जैसा कि मेटाबोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर एमजीएलयू5 के मामले में दिखाया गया है, जब इस तरह के सरल अंतर नक्शे उत्पन्न नहीं किए जा सकते हैं। Fo-Fc ओमिट मैप प्राप्त करने की हाल ही में शुरू की गई विधि लिगैंड की उपस्थिति को मान्य और प्रदर्शित करने के लिए एक उपकरण के रूप में काम कर सकती है। अंत में, एक उदाहरण के रूप में अच्छी तरह से अध्ययन किए गए β-गैलेक्टोसिडेज़ का उपयोग करते हुए, क्रायोईएम मानचित्रों में लिगैंड और विलायक अणुओं के मॉडलिंग पर संकल्प के प्रभाव का विश्लेषण किया जाता है, और दवा की खोज में क्रायोईएम का उपयोग कैसे किया जा सकता है, इस पर एक दृष्टिकोण प्रस्तुत किया जाता है।

Introduction

कोशिकाएं एक साथ और स्वतंत्र रूप से असंख्य रासायनिक प्रतिक्रियाओं को पूरा करके अपने कार्यों को पूरा करती हैं, प्रत्येक पर्यावरणीय संकेतों के जवाब में अपने अस्तित्व और अनुकूलन क्षमता को सुनिश्चित करने के लिए सावधानीपूर्वक विनियमित होती हैं। यह आणविक मान्यता द्वारा प्राप्त किया जाता है, जो बायोमोलेक्यूल्स, विशेष रूप से प्रोटीन को अन्य मैक्रोमोलेक्यूल्स के साथ-साथ छोटे अणुओं या लिगेंड1 के साथ क्षणिक या स्थिर परिसरों को बनाने में सक्षम बनाता है। इस प्रकार, प्रोटीन-लिगैंड इंटरैक्शन जीव विज्ञान में सभी प्रक्रियाओं के लिए मौलिक हैं, जिसमें प्रोटीन अभिव्यक्ति और गतिविधि का विनियमन, एंजाइमों द्वारा सब्सट्रेट और कॉफ़ैक्टर्स की मान्यता शामिल है, साथ ही साथ कोशिकाएंकैसे 1,2 संकेतों को समझती हैं और रिले करती हैं। प्रोटीन-लिगैंड कॉम्प्लेक्स के गतिज, थर्मोडायनामिक और संरचनात्मक गुणों की बेहतर समझ से लिगैंड इंटरैक्शन के आणविक आधार का पता चलता है और दवा बातचीत और विशिष्टता को अनुकूलित करके तर्कसंगत दवा डिजाइन की सुविधा भी मिलती है। प्रोटीन-लिगैंड इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक किफायती और तेज़ दृष्टिकोण आणविक डॉकिंग का उपयोग करना है, जो एक कम्प्यूटेशनल विधि है जो वस्तुतः छोटे अणुओं की एक विविध श्रेणी को स्क्रीन करती है और प्रोटीन3 को लक्षित करने के लिए इन लिगेंड के बाध्यकारी मोड और आत्मीयता की भविष्यवाणी करती है। हालांकि, एक्स-रे विवर्तन (एक्सआरडी), परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर), या इलेक्ट्रॉन क्रायोमाइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) द्वारा निर्धारित उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं से प्रयोगात्मक साक्ष्य इस तरह की भविष्यवाणियों के लिए आवश्यक प्रमाण प्रदान करते हैं और किसी दिए गए लक्ष्य के लिए नए और अधिक प्रभावी सक्रियकर्ताओं या अवरोधकों के विकास में सहायता करते हैं। यह लेख संक्षिप्त नाम 'क्रायोईएम' का उपयोग करता है क्योंकि तकनीक को आमतौर पर संदर्भित किया जाता है। हालांकि, सही नामकरण चुनने पर एक बहस चल रही है, और हाल ही में, क्रायोजेनिक-सैंपल ईलेक्ट्रॉन एमइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) शब्द को यह इंगित करने के लिए प्रस्तावित किया गया है कि नमूना क्रायोजेनिक तापमान पर है और इलेक्ट्रॉनों के साथ इमेज किया गया है4. इसी तरह, क्रायोईएम से प्राप्त मानचित्रों को इलेक्ट्रॉन क्षमता, इलेक्ट्रोस्टैटिक क्षमता, या कूलम्ब क्षमता कहा गया है, और सादगी के लिए, यहां हम क्रायोईएम मानचित्र 5,6,7,8,9,10 का उपयोग करते हैं।

हालांकि एक्सआरडी प्रोटीन-लिगैंड परिसरों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण में स्वर्ण मानक तकनीक रही है, पोस्ट रिज़ॉल्यूशन-क्रांति11 क्रायोईएम ने गति प्राप्त की है, जैसा कि पिछलेकुछ वर्षों में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डेटाबेस (ईएमडीबी)12,13में जमा कूलम्ब संभावित मानचित्रों या क्रायोईएम मानचित्रों की वृद्धि से संकेत मिलता है। नमूना तैयार करने, इमेजिंग और डेटा प्रोसेसिंग विधियों में प्रगति के कारण, क्रायोईएम को नियोजित करने वाले प्रोटीन डेटा बैंक (पीडीबी) 14 जमाओं की संख्या 0.7 और 17 के बीच 2010% से बढ़कर 2020% हो गई, 50 में लगभग 2020% रिपोर्ट की गई संरचनाएं 3.5 ए रिज़ॉल्यूशन या बेहतर15,16 पर निर्धारित की जा रही हैं। क्रायोईएम को फार्मास्युटिकल उद्योग सहित संरचनात्मक जीव विज्ञान समुदाय द्वारा तेजी से अपनाया गया है, क्योंकि यह लचीले और गैर-क्रिस्टलीय जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स, विशेष रूप से झिल्ली प्रोटीन और बहु-प्रोटीन परिसरों के अध्ययन की अनुमति देता है, निकट-परमाणु संकल्प पर, क्रिस्टलीकरण की प्रक्रिया पर काबू पाने और एक्सआरडी द्वारा उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए आवश्यक अच्छी तरह से विवर्तन क्रिस्टल प्राप्त करना।

क्रायोईएम मानचित्र में लिगैंड का सटीक मॉडलिंग सर्वोपरि है, क्योंकि यह आणविक स्तर पर प्रोटीन-लिगैंड कॉम्प्लेक्स के ब्लूप्रिंट के रूप में कार्य करता है। एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी में उपयोग किए जाने वाले कई स्वचालित लिगैंड-बिल्डिंग टूल हैं जो इलेक्ट्रॉन घनत्व 17,18,19,20में लिगैंड को फिट या बनाने के लिए लिगैंड घनत्व के आकार और टोपोलॉजी पर निर्भर करते हैं। फिर भी, यदि संकल्प 3 ए से कम है, तो ये दृष्टिकोण कम वांछनीय परिणाम उत्पन्न करते हैं क्योंकि टोपोलॉजिकल विशेषताएं जिन पर वे मान्यता और निर्माण के लिए निर्भर करते हैं, कम परिभाषित हो जाते हैं। कई उदाहरणों में, ये विधियां क्रायोईएम मानचित्रों में लिगेंड को सटीक रूप से मॉडलिंग करने में अप्रभावी साबित हुई हैं, क्योंकि इन मानचित्रों को निम्न-से-मध्यम रिज़ॉल्यूशन रेंज में निर्धारित किया गया है, आमतौर पर 3.5 Å-5 Å17 के बीच।

क्रायोईएम द्वारा प्रोटीन-लिगैंड कॉम्प्लेक्स के 3 डी संरचना निर्धारण में पहला कदम या तो प्रोटीन के साथ लिगैंड को सह-शुद्ध करना शामिल है (जब लिगैंड का प्रोटीन के लिए उच्च बाध्यकारी संबंध होता है) या ग्रिड तैयारी से पहले एक विशिष्ट अवधि के लिए लिगैंड के साथ प्रोटीन समाधान को इनक्यूबेट करना। इसके बाद, एक छोटा सा नमूना मात्रा एक प्लाज्मा-साफ छेद वाले टीईएम ग्रिड पर रखा जाता है, इसके बाद तरल ईथेन में फ्लैश फ्रीजिंग और अंततः क्रायो-टीईएम के साथ इमेजिंग होती है। मैक्रोमोलेक्यूल के 3-आयामी (3 डी) कूलम्ब संभावित मानचित्र के पुनर्निर्माण के लिए सैकड़ों हजारों से लाखों व्यक्तिगत कणों तक 2 डी प्रक्षेपण छवियों का औसत निकाला जाता है। इन मानचित्रों में लिगेंड और विलायक अणुओं की पहचान और मॉडलिंग करना मानचित्र में अनिसोट्रोपिक रिज़ॉल्यूशन के कारण कई मामलों में महत्वपूर्ण चुनौतियों का सामना करता है (यानी, रिज़ॉल्यूशन मैक्रोमोलेक्यूल में एक समान नहीं है), उस क्षेत्र में लचीलापन जहां लिगैंड बाध्य है, और डेटा में शोर। एक्सआरडी के लिए विकसित किए गए कई मॉडलिंग, शोधन और विज़ुअलाइज़ेशन टूल अब क्रायोईएम में उपयोग के लिए समान उद्देश्यों 18,19,20,21के लिए अनुकूलित किए जा रहे हैं। इस लेख में, वर्तमान में लिगेंड की पहचान करने, मॉडल बनाने और क्रायोईएम से प्राप्त निर्देशांक को परिष्कृत करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न तरीकों और सॉफ़्टवेयर का अवलोकन प्रस्तुत किया गया है। अलग-अलग रिज़ॉल्यूशन और जटिलता के साथ विशिष्ट प्रोटीन-लिगैंड कॉम्प्लेक्स का उपयोग करके लिगैंड मॉडलिंग में शामिल प्रक्रियाओं को चित्रित करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है।

क्रायोईएम मानचित्रों में लिगेंड मॉडलिंग में पहले चरण में मानचित्र में लिगैंड घनत्व (गैर-प्रोटीन) की पहचान शामिल है। यदि लिगैंड बाइंडिंग प्रोटीन में किसी भी रचनात्मक परिवर्तन को प्रेरित नहीं करता है, तो प्रोटीन-लिगैंड कॉम्प्लेक्स और एपो-प्रोटीन के बीच एक साधारण अंतर मानचित्र की गणना अनिवार्य रूप से अतिरिक्त घनत्व के क्षेत्रों को उजागर करती है, जो लिगैंड की उपस्थिति का सुझाव देती है। इस तरह के अंतर तुरंत देखे जा सकते हैं, क्योंकि इसके लिए केवल दो मानचित्रों की आवश्यकता होती है, और यहां तक कि 3 डी शोधन की प्रक्रिया के दौरान मध्यवर्ती मानचित्रों का उपयोग यह जांचने के लिए किया जा सकता है कि लिगैंड मौजूद है या नहीं। इसके अतिरिक्त, यदि रिज़ॉल्यूशन काफी अधिक है (<3.0 Å), तो अंतर मानचित्र पानी के अणुओं के स्थान के साथ-साथ लिगैंड और प्रोटीन अवशेषों के साथ बातचीत करने वाले आयनों में अंतर्दृष्टि भी प्रदान कर सकता है।

एपो-प्रोटीन मानचित्र की अनुपस्थिति में, अब सर्वलकैट22 का उपयोग करना संभव है, जो एक स्टैंडअलोन टूल के रूप में उपलब्ध है और इसे रेफमैक शोधन के हिस्से के रूप में सीसीपी-ईएम सॉफ्टवेयर सूट23,24 में और सीसीपी 4 8.0 रिलीज25,26 में भी एकीकृत किया गया है। Servalcat इनपुट के रूप में अनशार्प किए गए अर्ध-मानचित्रों और एपोप्रोटीन मॉडल का उपयोग करके FSC भारित अंतर (Fo-Fc) मानचित्र की गणना की अनुमति देता है। Fo-Fc लोप मानचित्र प्रायोगिक मानचित्र (Fo) और मॉडल (Fc) से प्राप्त मानचित्र के बीच असमानता का प्रतिनिधित्व करता है। मॉडल में एक लिगैंड की अनुपस्थिति में, एक Fo-Fc मानचित्र में एक सकारात्मक घनत्व जो प्रयोगात्मक EM मानचित्र के साथ ओवरलैप होता है, आमतौर पर लिगैंड की उपस्थिति का सुझाव देता है। यहां धारणा यह है कि प्रोटीन श्रृंखला मानचित्र में अच्छी तरह से फिट है, और शेष सकारात्मक घनत्व लिगैंड के स्थान को इंगित करता है। हालांकि, सावधानीपूर्वक जांच करना महत्वपूर्ण है कि क्या सकारात्मक घनत्व मॉडलिंग अशुद्धियों से उपजा है, जैसे कि प्रोटीन साइड-चेन का गलत रोटामर।

दूसरे चरण में उपलब्ध रासायनिक जानकारी से अच्छी तरह से परिभाषित ज्यामिति के साथ लिगैंड की एक कार्टेशियन समन्वय फ़ाइल प्राप्त करना या बनाना शामिल है। मानक लिगेंड (उदाहरण के लिए, एटीपी और एनएडीपी+) जो पहले से ही CCP4 मोनोमर लाइब्रेरी में उपलब्ध हैं, का उपयोग उनके मोनोमर परिग्रहण कोड के माध्यम से समन्वय और ज्यामिति फ़ाइलों को पुनः प्राप्त करके शोधन के लिए किया जा सकता है। हालांकि, अज्ञात या गैर-मानक लिगेंड के लिए, ज्यामिति फ़ाइलों को बनाने के लिए विभिन्न उपकरण उपलब्ध हैं। कुछ उदाहरणों में eLBOW27 - (इलेक्ट्रॉनिक लिगैंड बिल्डर और ऑप्टिमाइज़ेशन वर्कबेंच) फेनिक्स28 में, Lidia - Coot29 में एक इन-बिल्ट टूल, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Ligprep32-A मॉड्यूल शामिल हैं श्रोडिंगर सूट के भीतर ग्लाइड। लिगैंड समन्वय फ़ाइल को तब घनत्व में फिट किया जाता है, जो प्रयोगात्मक क्रायोईएम मानचित्र और कूट में अंतर मानचित्र दोनों द्वारा निर्देशित होता है। इसके बाद फेनिक्स28 में वास्तविक अंतरिक्ष शोधन या रेफमैक33 में पारस्परिक शोधन होता है। एक लिनक्स वर्कस्टेशन या एक अच्छे ग्राफिक्स कार्ड से लैस लैपटॉप और उपर्युक्त सॉफ्टवेयर की आवश्यकता होती है। इनमें से अधिकांश कार्यक्रम विभिन्न सुइट्स में शामिल हैं। CCP-EM24 और Phenix28 अकादमिक उपयोगकर्ताओं के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध हैं और इसमें इस लेख में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न प्रकार के उपकरण शामिल हैं, जिनमें Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, आदि शामिल हैं। इसी तरह, Chimera37, और ChimeraX38 अकादमिक उपयोगकर्ताओं को मुफ्त लाइसेंस प्रदान करते हैं।

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Protocol

1. माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस से एनोलेज में फॉस्फोनिओलफ्रूवेट (पीईपी) मॉडलिंग

  1. पीईपी-एनोलेज कॉम्प्लेक्स के क्रायोईएम मानचित्र में लिगैंड घनत्व की पहचान
    1. EMDB में अतिरिक्त डेटा से apo-enolase के अनशार्प किए गए अर्ध-मानचित्र (emd_30988_additional_1.map और emd_30988_additional_2.map) डाउनलोड करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. ChimeraX खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)। टूलबार से ओपन पर क्लिक करके और फ़ाइल नामों का चयन करके एपो-एनोलेस के आधे नक्शे खोलें। टाइप करें vop add #1 #2 कमांड लाइन में apo-enolase unsharpened map प्राप्त करने के लिए दोनों आधे-मानचित्रों को संयोजित करने के लिए।
      नोट: # 1 और # 2 एपो-एनोलेज एंजाइम के लिए दो आधे नक्शे को दर्शाते हैं, जैसा कि चरण 1.1.1 में उल्लेख किया गया है।
    3. # 3 Apo-enolase-unsharpened-map का नाम बदलकर संयुक्त मानचित्र (ChimeraX map ID: #3) का नाम बदलें। मॉडल पैनल से मानचित्र को ग्रे रंग दें। मानचित्र इंगित करता है कि एनोलेज डी 4 समरूपता के साथ समाधान में ऑक्टामेरिक है।
    4. PEP-enolase-unsharpened-map (मैप ID: #6) प्राप्त करने के लिए निम्न अर्ध-मानचित्र emd_30989_additional_1.map (मैप ID: 4) और emd_30989_additional_2.map (मैप ID: 5) का उपयोग करके चरण 1.1.1-1.1.3 दोहराएं।
    5. एक अंतर मानचित्र की गणना करने के लिए, पहले दो मानचित्रों (पीईपी-एनोलेज़ और एपो-एनोलेज़ चरण 1.1.3 और चरण 1.1.4 से शार्प किए गए मानचित्र) को एक दूसरे पर फ़िट करके फ़िट (मानचित्र में नक्शा) पर क्लिक करके फ़िट करें ChimeraX में मानचित्र पैनल (टूलबार)।
      नोट: दो मानचित्रों के बीच सामान्यीकरण नहीं किया जाता है। कुछ मामलों में, मानचित्रों को समान पैमाने पर लाने के लिए सामान्यीकरण की आवश्यकता हो सकती है।
    6. कमांड लाइन में vop घटाएं #6 # 3 टाइप करके एपो-एनोलेज़ मैप से PEP-enolase मैप घटाएं।
      नोट: # 6 = पीईपी-एनोलेज़ अनशार्प मैप, # 3 = एपो-एनोलेज़ अनशार्प मैप।
    7. घटाए गए मानचित्र (मानचित्र आईडी: 7) को हरे रंग में रंगें, सकारात्मक घनत्व को दर्शाते हुए (एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी में सम्मेलन के अनुसार)39.
    8. प्रोटीन डेटा बैंक (पीडीबी) से एम. ट्यूबरकुलोसिस ऑक्टामेरिक एनोलेज (पीडीबी: 7e4x) के निर्देशांक डाउनलोड करें, टूलबार से ओपन पर क्लिक करें और फ़ाइल नाम चुनें।
    9. कमांड लाइन में #8 Apo_enolase.pdb का नाम बदलकर मॉडल 7e4x.pdb का नाम बदलें। #8 ChimeraX में Apo_enolase.pdb को दर्शाता है।
    10. मॉडल पैनल से मॉडल का चयन करें। टूलबार से राइट माउस पर क्लिक करें। मॉडल को पीईपी-एनोलेस मैप (# 6) के निकटता में रखने के लिए मूव मॉलिक्यूल पर क्लिक करें और मैप के संबंध में मॉडल को संरेखित करें। कमांड लाइन में # 6 में फिट # 8 टाइप करके इस मॉडल को पीईपी-एनोलेस-अनशार्प-मैप में फिट करें। यहां, मानचित्र की संख्या 6 है, और मॉडल की संख्या 8 है।
      नोट: कुछ मामलों में, ChimeraX में स्थानीय फिट मॉडल को संरेखित करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है। इन मामलों में, वैश्विक फिटिंग का एक अतिरिक्त चरण (डॉकिनमैप, सामग्री की तालिकादेखें) फेनिक्स में किया जा सकता है।
    11. कमांड लाइन में सेव Apo-enolase.pdb #8 टाइप करके फिट किए गए मॉडल को सेव करें।
  2. बी-फैक्टर में पीईपी का मॉडलिंग और शोधन पीईपी-एनोलेज कॉम्प्लेक्स के क्रायोईएम मानचित्र को तेज किया
    1. टर्मिनल से ./Coot & टाइप करके "coot" (सामग्री की तालिका देखें) खोलें।
    2. फ़ाइल > ओपन निर्देशांक Apo-enolase.pdb पर क्लिक करके "Apo-enolase.pdb" प्रदर्शित करें। समन्वय फ़ाइल बांड (परमाणु द्वारा रंग) द्वारा प्रदर्शित की जाती है।
    3. ईएमडीबी से पीईपी-बाउंड एनोलेस शार्प मैप, यानी emd_30989.मैप डाउनलोड करें। File > Open Map > emd_30989.map पर क्लिक करके इसे प्रदर्शित करें। मध्य माउस बटन स्क्रॉल करके थ्रेशोल्ड को 7.00 σ पर सेट करें।
    4. Validate > Unmodeled Blobs > Find Blobs पर क्लिक करके Unmodeled blobs खोजें।
    5. सक्रिय साइट अवशेषों, सेर 42, Lys-386 और एनोलेस मॉडल के Arg-364 के पास unmodeled ligand घनत्व का पता लगाएँ।
    6. फ़ाइल > गेट मोनोमर पर क्लिक करके और पीईपी को 3 अक्षर कोड के रूप में दर्ज करके कूट मोनोमर लाइब्रेरी से पीईपी मोनोमर मॉडल फ़ाइल प्राप्त करें।
    7. साइडबार मेनू में रोटेट/ट्रांसलेट- ज़ोन/चेन/अणु विकल्प का उपयोग करके पीईपी अणु को घनत्व में ले जाएं। साइडबार मेनू में रियल स्पेस रिफाइन जोन पर क्लिक करके घनत्व में पीईपी अणु को फिट करने के लिए कूट में वास्तविक अंतरिक्ष शोधन का उपयोग करें। संपादित टैब में मर्ज अणु विकल्प का उपयोग करके Apo-enolase.pdb के साथ फिट लिगैंड को मर्ज करें। मॉडल को PEP-Enolase.pdb के रूप में सहेजें।
      नोट: लिगैंड को भी फिट करने के लिए लिगैंड> जिगल-फिट लिगैंड विकल्प का उपयोग कर सकते हैं।
    8. निर्देशांक फ़ाइल में बाकी मोनोमर्स में लिगेंड जोड़ने के लिए, NCS लिगेंड > > NCS टूल्स की गणना करें पर क्लिक करें। फाइंड एनसीएस-संबंधित लिगैंड नामक एक अलग विंडो दिखाई देगी। एनसीएस विकल्प के साथ प्रोटीन के लिए, एनसीएस मास्टर चेन के रूप में समन्वय फ़ाइल Apo-enolase.pdb और चेन आईडी ए का चयन करें।
      1. लिगैंड युक्त अणु के लिए, Apo-enolase.pdb को समन्वय फ़ाइल और चेन आईडी, जे, और अवशेष संख्या 1 से 1 के रूप में चुनें। Find Candidate Positions वर क्लिक करा. फिटेड लिगैंड नाम की एक विंडो उम्मीदवार पदों की सूची के साथ दिखाई देगी। व्यक्तिगत उम्मीदवार लिगेंड पर क्लिक करके फिटिंग का मूल्यांकन करें और नेत्रहीन फिट का विश्लेषण करें।
        नोट: Servalcat/Refmac में, केवल एक मोनोमर मॉडल प्रदान किया जा सकता है, और पुनर्निर्माण में उपयोग की जाने वाली समरूपता एक विस्तारित मॉडल प्राप्त करने के लिए दी जा सकती है।
    9. लिगैंड के पास विलायक अणुओं के लिए अतिरिक्त घनत्व भी देखा गया था। विभिन्न होमोलॉग से एनोलेज की उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रिस्टल संरचनाएं दो एमजी2+ आयनों40,41 की उपस्थिति का सुझाव देती हैं, जो संभवतः प्रतिक्रिया मध्यवर्ती के नकारात्मक चार्ज को स्थिर करती हैं। सूचक पर जगह परमाणु पर क्लिक करके और सूचक एटम प्रकार सूची से एमजी का चयन करके सक्रिय साइट घनत्व में मॉडल दो मिलीग्राम2+ आयनों.
      नोट: बंधन ज्यामिति और दूरी का उपयोग धातु आयन का चयन करने के लिए एक गाइड के रूप में किया जा सकता है। प्रोटीन अवशेषों में ऑक्सीजन परमाणुओं से बंधे Mg2+ के मामले में, अष्टफलकीय ज्यामिति के साथ बंधन दूरी 2.1 Å -2.4 Å के बीच भिन्न होती है। हालांकि, कम-रिज़ॉल्यूशन वाले मानचित्रों के मामले में, समन्वय क्षेत्र अक्सर अधूरा होता है, और रिज़ॉल्यूशन में सीमाओं के कारण दूरी भी भिन्न हो सकती है।
    10. समरूपता से संबंधित मोनोमर्स में एमजी2+ आयनों को जोड़ने के लिए चरण 1.2.8 दोहराएं।
    11. फ़ाइल > सहेजें निर्देशांक > फ़ाइल नाम > का चयन करें पर क्लिक करके और Enolase+PEP+Mg.pdb टाइप करके मॉडल को सहेजें।
    12. फेनिक्स जीयूआई खोलें (सामग्री की तालिकादेखें)। डिफ़ॉल्ट पैरामीटर का उपयोग करके क्रमशः Enolase + PEP + Mg.pdb और emd_30989.map के साथ इनपुट मॉडल और मैप के रूप में एक वास्तविक स्थान शोधन कार्य चलाएँ। यह कदम अच्छा मानचित्र-मॉडल फिट और ज्यामिति प्राप्त करने के लिए कूट के साथ पुनरावृत्त रूप से किया जाता है।
      नोट: बिना नुकीले अंतर मानचित्र का उपयोग लिगैंड की उपस्थिति को प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है, जैसे कि एक आकृति में। मॉडलिंग उद्देश्यों के लिए, बी-फैक्टर शार्प मैप का उपयोग किया गया है और इसकी सिफारिश की जाती है। बी-फैक्टर शार्प किए गए मैप का उपयोग प्रदर्शन उद्देश्यों के लिए अंतर मैप की गणना करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसा कि अनशार्प किए गए मैप के विपरीत है। हालांकि, यदि लिगैंड बाध्य क्षेत्र में रिज़ॉल्यूशन कम है, तो पूरे मानचित्र को तेज करने के लिए उपयोग किया जाने वाला एकल बी-कारक स्पष्ट रूप से लिगैंड घनत्व को प्रकट नहीं कर सकता है।
  3. मॉडलिंग किए गए लिगैंड का विज़ुअलाइज़ेशन और फिगर जनरेशन
    1. फ़ाइल खोलें पर क्लिक करके और फ़ाइल नाम का चयन करके PyMOL42 में अंतिम Phenix शोधन कार्य से परिष्कृत Enolase + PEP + Mg मॉडल खोलें खोलें (सामग्री की तालिका> खोलें।
    2. पर क्लिक करके emd-30989.map (PEP-बाउंड शार्प मैप को लोड करें) file खोलें > खोलें और फ़ाइल नाम का चयन करें।
    3. क्रियाओं पर क्लिक करके मानचित्र का नाम बदलें > emd_30989 ऑब्जेक्ट के खिलाफ नाम बदलें और पीईपी-तेज टाइप करें।
      नोट: ज्यादातर मामलों में, उदाहरण के लिए एनोलेज, पाइमोल में खोले जाने वाले नक्शे सामान्यीकृत होते हैं क्योंकि पाइमोल में डिफ़ॉल्ट रूप से सामान्यीकृत मानचित्र विकल्प की जांच की जाती है। चूंकि क्रायोईएम मानचित्र एक बड़े बॉक्स पर केंद्रित होते हैं, सामान्यीकरण में बॉक्स में सब कुछ शामिल होगा। इस प्रकार, पाइमोल में खोलने से पहले सामान्यीकरण बंद किया जा सकता है।
    4. प्रदर्शन > अनुक्रम पर क्लिक करके लिगेंड का चयन करें।
    5. कमांड लाइन में isomesh mesh_ligands, PEP-sharpened, 6.0, sele, carve=3.0 टाइप करें और एंटर दबाएं।
    6. mesh_ligand ऑब्जेक्ट के बगल में अंतिम बॉक्स, सी पर क्लिक करके mesh_ligand को नीला रंग दें।
    7. सक्रिय साइट अवशेषों, Ser-42, Asp-241, Glu-283, Asp-310, Arg-364 और Lys-386 क्रमशः छड़ी और क्षेत्र प्रतिनिधित्व में पीईपी और एमजी2 + के साथ बातचीत करते हुए, और कार्टून प्रतिनिधित्व में एनोलेस एंजाइम प्रदर्शित करें।
    8. प्रकाशन गुणवत्ता छवियों को उत्पन्न करने के लिए रे 3600, 3600 टाइप करके रे ट्रेस करें और फ़ाइल > पर क्लिक करके और फ़ाइल नाम के रूप में PEP.png चुनकर पीएनजी फ़ाइल के रूप में सहेजें।

2. मेटाबोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर mGlu 5 में लिगैंड की मॉडलिंग

  1. एगोनिस्ट और प्रतिपक्षी-बाध्य mGlu के क्रायोईएम मानचित्र में लिगैंड घनत्व की पहचान और मॉडलिंग5
    1. एगोनिस्ट बाउंड (EMD-31536, 7fd8.pdb) और प्रतिपक्षी बाउंड (EMD-31537,7fd9.pdb) mGlu5 कॉम्प्लेक्स में से प्रत्येक के लिए उनके संबंधित समन्वय फ़ाइलों के साथ दो आधे नक्शे डाउनलोड करें।
    2. ChimeraX खोलें
      1. समन्वय फ़ाइल खोलें, 7fd8.pdb ओपन पर क्लिक करके और 7fd8.pdb का चयन करके।
      2. कमांड लाइन में delete ligand टाइप करें और एंटर दबाएं।
      3. इसी तरह, श्रृंखला बी को हटाने के लिए कमांड हटाएं /
        नोट: लिगैंड और चेन को हटाने के >लिए परमाणुओं/बांडों > चयन और क्रियाओं का उपयोग करके शीर्ष पर ड्रॉप-डाउन मेनू का उपयोग करके हटाया जा सकता है।
      4. कमांड लाइन में निम्नलिखित टाइप करके अनलिगंड पीडीबी को सेव करें: 7fd8_noligand_chainA.पीडीबी #1 सेव करें। # 1 मॉडल आईडी को दर्शाता है।
      5. 7fd9.pdb के लिए चरण 2.1.2.1-2.1.2.4 दोहराएं।
    3. सीसीपी-ईएम खोलें। mGlu5 नामक एक नया प्रोजेक्ट बनाएं और प्रोजेक्ट निर्देशिका और उपयोगकर्ता नाम निर्दिष्ट करें।
      1. बाएं पैनल के विकल्पों में से Relion खोलें।
        1. मास्क निर्माण टैब पर जाएं।
        2. इनपुट के रूप में EMD-31536 के लिए आधे मानचित्रों में से एक प्रदान करें।
          नोट: Relion एक प्रत्यय के रूप में .mrc के साथ नक्शे स्वीकार करता है, और EMD नक्शे में .map प्रत्यय होता है। मानचित्र फ़ाइलों को जांच के लिए ChimeraX में खोला जा सकता है और .mrc प्रारूप में सहेजा जा सकता है।
        3. मास्क टैब में, पिक्सेल आकार 0.89 Å और प्रारंभिक बिनाराइजेशन थ्रेशोल्ड 0.007 के रूप में प्रदान करें।
        4. उपनाम 31536 (या किसी अन्य नाम का पालन करना आसान है) के साथ कार्य चलाएँ।
        5. इसी तरह, ईएमडी - 31537 हाफ मैप के लिए मास्क बनाएं।
      2. CCPEM में बाएं पैनल में विकल्पों से Refmac Servalcat प्रोग्राम खोलें।
        1. mGlu5_agonist नाम प्रदान करें।
        2. 7fd8_noligand_chainA .pdb फ़ाइल को मॉडल खंड 2.1.2.4 में वर्णित के रूप में आयात करें। दो आधे नक्शे और Relion में बनाए गए संबंधित मास्क का स्थान प्रदान करें।
        3. संकल्प को 3.8 Å के रूप में निर्दिष्ट करें।
        4. सख्त समरूपता > शोधन सेटिंग्स पर जाएं और C2 का उल्लेख रेलियन बिंदु समूह समरूपता के रूप में करें।
        5. शीर्ष पर स्टार्ट बटन दबाकर प्रोग्राम शुरू करें।
    4. एक बार काम समाप्त हो जाने के बाद, Coot में परिणाम खोलें (परिणाम अनुभाग में शीर्ष पर उपलब्ध विकल्प)। यह डिफ़ॉल्ट रूप से कूट में एक diffmap.mtz प्रदर्शित करेगा, जहां रंग लाल और हरे क्रमशः नकारात्मक और सकारात्मक घनत्व इंगित करते हैं।
      1. DELFWT PHDELWT लेबल वाले अंतर मानचित्र के प्रदर्शन प्रबंधक > गुणों पर जाएं और समोच्च स्तर को 4.0 (पूर्ण मान) में बदलें।
        नोट: थ्रेशोल्ड का चुनाव मानचित्र और रिज़ॉल्यूशन पर निर्भर करता है।
      2. FWT PHWT लेबल वाले मानचित्र और परिष्कृत लेबल वाले अणु को छिपाएं।
      3. सकारात्मक घनत्व (हरे रंग के) की कल्पना करने के लिए माउस का उपयोग करके मानचित्र को चारों ओर ले जाएं और केंद्र में बड़ी बूँद लाएं।
      4. फ़ाइल > मोनोमर प्राप्त करें पर जाएं, QUS टाइप करें, और एंटर दबाएं।
      5. कठोर बॉडी फिट अणु > > मॉडलिंग की गणना करने के लिए जाएं और Fo-Fc घनत्व में फिट होने के लिए अणु को समायोजित करने के लिए QUS मोनोमर पर डबल-क्लिक करें।
      6. समन्वय फ़ाइल में QUS अणु जोड़ने के लिए संपादन टैब में मर्ज अणु विकल्प का उपयोग करें, refined.pdb।
      7. क्रमशः बाह्य में और ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन के शीर्ष पर छोटे ब्लॉब में मोनोमर कोड एनएजी और सीएचएस के साथ लिगैंड को फिट करने के लिए चरण 2.1.4.3-2.1.4.6 दोहराएं।
      8. निर्देशांक को refined_ligands.pdb के रूप में सहेजें।
        नोट: ट्रांसमेम्ब्रेन (टीएम) डोमेन का रिज़ॉल्यूशन कम है, और इस प्रकार, यहां इसकी चर्चा नहीं की गई है।
  2. mGlu5 liganded संरचना का शोधन
    1. CCPEM खोलें और पिछले शोधन कार्य (चरण 2.1.3.2) को क्लोन करें और इसे refined_ligands.pdb और तेज मानचित्र (emd. 31536.mrc) इनपुट के रूप में, डिफ़ॉल्ट पैरामीटर और C2 समरूपता का उपयोग करके।
      नोट: यदि प्रोग्राम लिगैंड को नहीं पहचानता है, तो सीआईएफ फाइलें प्रदान करने की आवश्यकता है। इन सीआईएफ फाइलों को पीडीबी से डाउनलोड किया जा सकता है या विभिन्न कार्यक्रमों का उपयोग करके उत्पन्न किया जा सकता है (विवरण के लिए चरण 3.1.1 देखें)।
  3. PyMOL में विज़ुअलाइज़ेशन और फिगर जनरेशन
    1. PyMOL में नवीनतम Refmac शोधन कार्य से refined_expanded.pdb मॉडल खोलें।
    2. फ़ाइल खोलें >पर जाएं और diffmap_normalised_fofc.mrc (चरण 2.1.3.2 में Servalcat कार्य से अंतर मानचित्र) फ़ाइल लोड करने के लिए Refmac कार्य निर्देशिका में ब्राउज़ करें।
      नोट: यदि ब्राउज़ करते समय .mrc एक्सटेंशन फ़ाइलें दिखाई नहीं दे रही हैं, तो फ़ाइल प्रकार को सभी फ़ाइलों में बदलें और ब्राउज़ करें।
    3. प्रदर्शन > अनुक्रम का उपयोग करके लिगेंड का चयन करें।
    4. क्रियाएं बटन पर जाएं और चयन को लिगेंड के रूप में नाम दें।
    5. कमांड लाइन में निम्नलिखित टाइप करें और एंटर दबाएं: आइसोमेश mesh_ligands, diffmap_normalised_fofc, 6.0, लिगैंड, कार्व = 2.5।
      नोट: जाल चौड़ाई समायोजित किया जा सकता है। यहां, 0.2 जाल चौड़ाई का उपयोग किया जाता है, और यह निम्न कमांड का उपयोग करके सेट किया जाता है: सेट mesh_width=0.2।
    6. मोनोमर में से एक पर राइट-क्लिक करें और प्रत्येक मोनोमर के रंग को निर्दिष्ट करने के लिए चेन > रंग पर जाएं। लिगैंड और mesh_ligands ऑब्जेक्ट्स में सी लेबल वाले अंतिम बॉक्स का उपयोग करके लिगैंड और जाल को रंग दें। mGlu5 रिसेप्टर डिमर को कार्टून प्रतिनिधित्व में दिखाया गया है, और मोनोमर्स चैती और गेहूं में रंगे हुए हैं। लिगेंड को छड़ी में दिखाया गया है, और लिगेंड को समोच्च करने वाली जाली हरे रंग की है।
    7. वस्तुओं के खिलाफ ओरिएंट/सेंटर/ज़ूम विकल्प > क्रियाओं का उपयोग करें और जाल और स्पष्ट रूप से कल्पना करने के लिए मैन्युअल रूप से समायोजित करें। आस-पास के अवशेषों का चयन करें जो लिगैंड के साथ बातचीत कर सकते हैं, उदाहरण के लिए, QUS के लिए Tyr64, Trp100, और आवश्यकतानुसार, उनकी साइड चेन या मुख्य श्रृंखला या दोनों को स्टिक प्रतिनिधित्व के रूप में प्रदर्शित करें।
    8. उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को उत्पन्न करने और उन्हें png फ़ाइल के रूप में सहेजने के लिए रे ट्रेस।
      नोट: उपरोक्त चरणों को प्रतिपक्षी बाध्य मानचित्र EMD-31537 और संबंधित समन्वय फ़ाइल PDB-7fd9 के लिए दोहराया जाता है।

3. अवरोधक, डीऑक्सीगैलेक्टो-नोजिरिमाइसिन (डीजीएन), और विलायक अणुओं को β-गैलेक्टोसिडेज़ के उच्च-रिज़ॉल्यूशन तेज मानचित्र में मॉडलिंग करना

  1. क्रायोईएम से आधे नक्शे का उपयोग करके लिगैंड, डीजीएन की पहचान
    1. मॉडलिंग के लिए अज्ञात लिगैंड शब्दकोश की तैयारी [Deoxygalacto-nojirimycin (DGN)]
      नोट: Deoxygalacto-nojirimycin शब्दकोश फ़ाइल CCP4 मोनोमर लाइब्रेरी में DGJ (3 अक्षर लिगैंड आईडी) के रूप में शामिल है। फिर भी, यहां इसे अज्ञात लिगेंड के लिए शब्दकोश फ़ाइलों को उत्पन्न करने की प्रक्रिया को चित्रित करने के लिए एक नया और अज्ञात लिगैंड माना जाता है, डीजीएन का उपयोग 3 अक्षर कोड के रूप में किया जाता है।
      1. PubChem वेबपेज में deoxygalacto-nojirimycin (DGN) के लिए यौगिक सारांश खोलें और यौगिक deoxygalacto-nojirimycin के लिए मुस्कान स्ट्रिंग की प्रतिलिपि बनाएँ।
      2. ओपन Phenix > Ligands > eLBOW.
      3. इनपुट के रूप में मुस्कान स्ट्रिंग निर्दिष्ट करें।
      4. उपयुक्त लिगैंड निर्माण अनुकूलन विधि निर्दिष्ट करें। यहां, सरल अनुकूलन का उपयोग किया जाता है।
      5. लिगैंड परिभाषा अनुभाग में रासायनिक मुस्कान स्ट्रिंग पेस्ट करें।
      6. एक नौकरी शीर्षक, आउटपुट फ़ाइल उपसर्ग, और लिगैंड आईडी उचित रूप से प्रदान करें और रन दबाएं।
        नोट:: कार्य का आउटपुट समन्वय फ़ाइल, DGN.pdb, और एक शब्दकोश फ़ाइल, DGN.cif फ़ाइल है। जिगैंड29 का उपयोग सीआईएफ फाइल बनाने के लिए भी किया जा सकता है।
    2. पीडीबी से β-गैलेक्टोसिडेज़ समन्वय फ़ाइल (6tsh.pdb) डाउनलोड करें और पाठ संपादक का उपयोग करके प्रोटीन श्रृंखला (बी, सी, डी), लिगैंड, डीजीएन और अन्य विलायक अणुओं के निर्देशांक को हटा दें या कूट में श्रृंखला/ज़ोन विकल्प हटाएं। समन्वय फ़ाइल को apo-betaGal_chainA.pdb के रूप में सहेजें।
      नोट: काइमेराएक्स या पाइमोल का उपयोग लिगैंड/विलायक अणु को हटाने के लिए भी किया जा सकता है।
    3. EMDB से EMD-emd_10563_half_map_1 प्रविष्टि के अतिरिक्त डेटा से अर्ध-मानचित्र (emd_10563_half_map_2.map और .map) डाउनलोड करें।
    4. CCPEM खोलें और 0.01 की सीमा पर मानचित्र के लिए मास्क बनाने के लिए Relion का उपयोग करें (जैसा कि चरण 2.1.3.1.1-2.1.3.1.4 में वर्णित है)।
    5. चरण 3.1.3 में प्राप्त अर्ध-मानचित्रों और चरण 3.1.2 और D2 समरूपता में एपो-मॉडल के साथ Servalcat (चरण 2 में वर्णित CCPEM सूट के भीतर) चलाएं।
      नोट: लिगैंड घनत्व का पता लगाने के लिए मॉडल को आधे नक्शे या पूर्ण मानचित्रों में से एक के साथ संरेखित किया जाना चाहिए। यह ChimeraX का उपयोग करके मॉडल को मानचित्र में फिट करके और फिर आधे नक्शे के सापेक्ष निर्देशांक को सहेजकर किया जा सकता है। इस उदाहरण में, EMDB में अर्ध-मानचित्र और प्राथमिक मानचित्र में अलग-अलग बॉक्स आकार/ग्रिड होते हैं, और मॉडल को आधे-मानचित्र में रखने की आवश्यकता होती है।
    6. कूट खोलें।
      1. Phenix eLBOW के साथ चरण 3.1.1 में उत्पन्न के रूप में ligand शब्दकोश के लिए DGN.cif खोलें. यह File > Import CIF शब्दकोश में जाकर और eLBOW job निर्देशिका ब्राउज़ करके किया जाता है।
      2. प्रोटीन और लिगैंड समन्वय फ़ाइलों को खोलें, क्रमशः चरण 3.1.2 से apo-betaGal_chainA.pdb और चरण 3.1.6 से DGN.pdb खोलें।
      3. Servalcat कार्य (चरण 3.1.5) से diffmap.mtz फ़ाइल को स्वतः खोलें और Coot में DELFWT PHDELWT लेबल वाले मानचित्र की कल्पना करें। ~ 4 निरपेक्ष मूल्य की सीमा पर मानचित्र को समोच्च करें।
        नोट: हेडर map.mrc टाइप करके या Chimera में टूल का उपयोग करके मानचित्र के आँकड़ों की जाँच करना महत्वपूर्ण है। पिक्सेल आकार, बॉक्स आकार, न्यूनतम, माध्य और अधिकतम घनत्व, और औसत घनत्व से आरएमएस विचलन पर सभी आवश्यक जानकारी प्राप्त की जा सकती है। क्रायोईएम मानचित्रों के पिक्सेल आकार और बॉक्स आकार की जांच करना महत्वपूर्ण है। 3 डी मानचित्र 3 डी वोक्सल्स के ग्रिड में प्रोटीन-लिगैंड मैप वॉल्यूम का प्रतिनिधित्व करता है। प्रत्येक स्वर में, इलेक्ट्रॉन विभव मान या उस स्थान पर इलेक्ट्रॉन मिलने की प्रायिकता संचित होती है। जब एक निश्चित सीमा चुनी जाती है, तो वोक्सल्स, जिनका घनत्व निर्दिष्ट मान से कम होता है, शून्य पर सेट होते हैं। यह मानचित्र में प्रयोगात्मक शोर को कम करने और मानचित्र सुविधाओं को बेहतर43 की कल्पना करने में मदद करता है। इस प्रकार, मानचित्र को एक सीमा पर समोच्च किया जाना चाहिए जहां मानचित्र की विशेषताएं आसानी से दिखाई देती हैं और मानचित्र में शोर न्यूनतम होता है।
      4. लिगैंड पर जाएं > लिगैंड खोजें। दिखाई देने वाली नई विंडो में, लिगैंड, अंतर मानचित्र और apo-betaGal_chainA.pdb मॉडल चुनें। अन्य विकल्पों को उनकी डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स पर छोड़ दें और खोज शुरू करने के लिए फाइंड लिगैंड पर क्लिक करें।
      5. संभावित लिगैंड घनत्व दिखाने वाले शीर्ष हिट की एक सूची प्रत्येक घनत्व में रखी गई एक प्रति के साथ प्रदर्शित की जाती है। मैन्युअल रूप से सभी हिट जहां ligand रखा गया है की जाँच करें. सबसे संभावित हिट रखें और अस्पष्ट लोगों को हटा दें।
        नोट: एक उच्च सीमा पर मानचित्र घनत्व में अंतर स्पष्ट रूप से सक्रिय साइट में लिगैंड की उपस्थिति का सुझाव देता है।
  2. लिगैंड डीजीएन और विलायक अणुओं का मॉडलिंग
    1. अंतर घनत्व मानचित्र में लिगैंड (DGN.pdb) को फिट करने के लिए कूट में एक वास्तविक स्थान शोधन करें, और फिर apo-betaGal_chainA.pdb के साथ लिगैंड निर्देशांक को मर्ज करें और इसे betaGal_chainA+ligand.pdb के रूप में सहेजें।
      नोट: अन्य श्रृंखलाओं के क्षेत्रों में रखे गए लिगैंड को हटाया जा सकता है और मर्ज किए गए निर्देशांक फ़ाइल को सहेजते समय विलय नहीं किया जाता है। अन्य श्रृंखलाओं में लिगैंड एनसीएस लिगैंड द्वारा उत्पन्न किए जा सकते हैं जैसा कि उदाहरण 1, चरण 1.2.8, या समरूपता विस्तार का उपयोग करके रेफमैक /
    2. इनपुट मॉडल के रूप में betaGal_chainA + ligand.pdb के साथ ऊपर (चरण 3.1.5) के रूप में एक और Servalcat कार्य चलाएं और D2 समरूपता के साथ आधे नक्शे (चरण 3.1.3 से)।
    3. मॉडल किए गए लिगैंड के आसपास अंतर घनत्व (चरण 3.2.2 पर सर्वलकैट नौकरी से) लिगैंड अणु के साथ समन्वय करने वाले विलायक अणुओं की उपस्थिति का सुझाव देता है। लिगैंड के करीब केंद्रीय घनत्व पानी के अणुओं के लिए बहुत बड़ा प्रतीत होता है।
    4. उस स्थिति में Mg2+ की उपस्थिति का संकेत देने वाले पिछले जैव रासायनिक और संरचनात्मक डेटा के आधार पर, Mg2+ आयन को स्थान परमाणु विकल्प पर क्लिक करके और परमाणु को MGके रूप में निर्दिष्ट करके यहां मॉडलिंग की गई है।
    5. सक्रिय साइट में अंतर घनत्व में मॉडल पानी के अणु जो सूचक पर जगह परमाणु पर क्लिक करके और पानी का चयन करके विलायक अणु की उपस्थिति का संकेत देते हैं।
      नोट: कूट में पानी के अणुओं को स्वचालित रूप से लेने का विकल्प भी है। यहां, चूंकि फोकस केवल सक्रिय साइट पर है, इसलिए पानी के अणुओं को मैन्युअल रूप से जोड़ा जाता है।
    6. Mg2+ के निर्देशांक और betaGal+ligand.pdb फ़ाइल के साथ पानी मर्ज करें और इसे betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb के रूप में सहेजें।
    7. बीटागल + लिगैंड + solvent_chainA.पीडीबी के साथ, डी 2 समरूपता के साथ सर्वलकैट में रेफमैक शोधन करें।
      नोट: इस नौकरी से आउटपुट अंतर मानचित्र यह मान्य करने के साधन के रूप में काम कर सकता है कि क्या लिगैंड को सही ढंग से मॉडल किया गया है, क्योंकि अंतर मानचित्र को न्यूनतम अवशिष्ट सकारात्मक या नकारात्मक घनत्व दिखाना चाहिए।
  3. PyMOL के साथ विज़ुअलाइज़ेशन और फिगर जनरेशन
    नोट: नीचे उल्लिखित चरण मॉडल और मानचित्रों का उपयोग करके आंकड़े बनाने के कुछ उदाहरण प्रदान करते हैं जिनका उपयोग लिगेंड और सॉल्वैंट्स की उपस्थिति को दर्शाने के लिए किया जा सकता है।
    1. लिगैंड और विलायक मॉडलिंग के साथ अंतिम Servalcat नौकरी (चरण 3.2.6) से refined_expanded.pdb खोलें।
    2. उदाहरण 2 में वर्णित के रूप में उन्हें मैजेंटा, पीला, हरा और चैती रंग देने के लिए अलग-अलग श्रृंखलाओं का चयन करें।
    3. डिस्प्ले > सीक्वेंस पर जाएं, पानी के अणुओं, मैग्नीशियम और डीजीएन के लिए अलग-अलग चयन करें, और वस्तुओं को क्रमशः पानी, एमजी और डीजीएन के रूप में नाम दें।
    4. एमजी और पानी के अणुओं को वस्तुओं का चयन करके, राइट-क्लिक करके गोले के रूप में प्रदर्शित करें, और > क्षेत्र दिखाएं। इसी तरह, छड़ी प्रतिनिधित्व में लिगैंड प्रदर्शित करें और लिगैंड और सॉल्वैंट्स को उचित रूप से रंग दें। इस मामले में, लिगैंड को एक हेटरोटॉम द्वारा पीले रंग का रंग दिया गया है, मैग्नीशियम आयन बैंगनी रंग का है, और पानी के अणु लाल रंग के हैं।
    5. DGN, MG और पानी के अणुओं का चयन करें। राइट-क्लिक करें और ऑब्जेक्ट पर कॉपी > क्रियाओं का चयन करें और इसे लिगेंड नाम दें।
    6. चरण 3.2.6 में Servalcat कार्य से diffmap_normalised_fo.mrc खोलें और ligand_fo.mrc के रूप में नाम बदलें। निम्न कमांड टाइप करें: आइसोमेश mesh_ligands_fo, ligand_fo, 3, लिगैंड, कार्व = 2।
      नोट: 2 Å का नक्काशी विकल्प परमाणुओं के चारों ओर लागू होता है, और मानचित्रों के रिज़ॉल्यूशन और गुणवत्ता के आधार पर, 3-5 के मानों का उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, PyMOL में क्रायोईएम मानचित्र खोलते समय, normalize_ccp4_maps को बंद करने की सलाह दी जाती है।
    7. ओरिएंट/ज़ूम विकल्पों > क्रियाओं का उपयोग करें और चरण 2.3.7 में दिखाए गए लिगैंड और आस-पास के इंटरैक्टिंग अवशेषों (जहां भी लागू हो) की कल्पना करने के लिए मैन्युअल रूप से समायोजित करें।
    8. रे कमांड रे 3600, 3600 का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को सहेजने के लिए इन दृश्यों का पता लगाता है।
    9. दृश्य को .png फ़ाइल के रूप में सहेजें।
      नोट: निम्नलिखित चरण वैकल्पिक हैं और (1) अनमॉडेल्ड लिगैंड, डीजीएन के लिए अंतर घनत्व (एफओ-एफसी), (2) मॉडलिंग लिगैंड, डीजीएन के घनत्व (एफओ) के साथ-साथ अंतर घनत्व (एफओ-एफसी) को अनमॉडेल्ड सॉल्वैंट्स के लिए और अंत में (3) के लिए घनत्व (एफओ) मॉडल किए गए लिगैंड, डीजीएन और सक्रिय साइट में विलायक अणुओं के लिए (3) घनत्व (एफओ) की रूपरेखा तैयार करते हैं।
    10. अंतर मानचित्र का उपयोग करके लिगैंड, डीजीएन और आसपास के विलायक अणुओं की उपस्थिति को प्रदर्शित करने के लिए, चरण 3.1.5 में सर्वलकैट नौकरी से diffmap_normalised_fofc.mrc खोलें। क्रियाएँ क्लिक करके मैप फ़ाइल का नाम बदलें > मैप ऑब्जेक्ट के आगे नाम बदलें पर क्लिक करके मैप फ़ाइल का नाम बदलें unliganded_fofc.mrc के रूप में नाम बदलें। कमांड लाइन में निम्नलिखित टाइप करें: आइसोमेश mesh_ligands_fofc, unliganded_fofc, लिगेंड, लेवल = 6, कार्व = 2।
    11. मॉडलिंग किए गए लिगैंड, डीजीएन और आसपास के अनमॉडेल्ड सॉल्वेंट घनत्व के घनत्व को प्रदर्शित करने के लिए, चरण 3.2.2 में सर्वलकैट नौकरी से diffmap_normalised_fo.mrc के साथ-साथ diffmap_normalised_fofc.mrc खोलें। diffmap_normalised_fo.mrc को DGN_fo और diffmap_normalised_fofc.mrc को DGN_unmodelled_solvents_fofc नाम दें।
    12. एमजी और डिस्प्ले > सीक्वेंस से पानी का चयन करें, राइट-क्लिक करें और ऑब्जेक्ट को कॉपी > क्रियाओं का चयन करें, और उन्हें सॉल्वैंट्स के रूप में नाम दें।
    13. कमांड लाइन में निम्नलिखित टाइप करें: आइसोमेश mesh_DGN_fo, DGN_fo, डीजीएन, स्तर = 3, नक्काशी = 2; आइसोमेश mesh_solvent_fofc, DGN_unmodelled_solvents_fofc, सॉल्वैंट्स, स्तर = 6, नक्काशी = 2।
      नोट: mesh_DGN_fo लिगैंड का घनत्व दिखाएगा, और mesh_solvent_fofc एमजी और पानी के लिए छोड़े गए घनत्व को दिखाएगा।
    14. अंत में, मॉडलिंग किए गए लिगेंड के साथ-साथ सक्रिय साइट में आसपास के विलायक अणुओं की कल्पना करने के लिए, चरण 3.2.6 में सर्वलकैट नौकरी से diffmap_normalised_fo.mrc खोलें और इसे ligand_fo.mrc के रूप में नाम दें।
    15. कमांड लाइन में निम्नलिखित टाइप करें: आइसोमेश mesh_ligand_fo, ligand_fo, चयन = लिगैंड, स्तर = 3, कार्व = 2।
      नोट: यहां, हमने diffmap_normalised_fo.mrc का उपयोग किया, लेकिन अंतिम तेज मानचित्र का उपयोग लिगैंड और आसपास के अवशेषों के घनत्व को दिखाने के लिए किया जा सकता है। उपयोग किए गए मानचित्र के प्रकार, आकृति किंवदंती में बी-फैक्टर शार्पनिंग मानों का उल्लेख करना एक अच्छा अभ्यास है।
    16. जाल की चौड़ाई और गोले का आकार निम्नलिखित कमांड टाइप करके सेट किया जा सकता है: mesh_width=0.2 सेट करें और गोले के आकार को छोटा करने के लिए sphere_scale=0.25 सेट करें।
    17. फो मेश ब्लू और फोएफसी मेश ग्रीन को कलर करें।
    18. ओरिएंट/ज़ूम विकल्पों > क्रियाओं का उपयोग करें और लिगैंड और आस-पास के इंटरैक्टिंग अवशेषों (जहां भी लागू हो) की कल्पना करने के लिए मैन्युअल रूप से समायोजित करें, जैसा कि चरण 2.3.7 में दिखाया गया है।
    19. रे कमांड रे 3600, 3600 का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को सहेजने के लिए इन दृश्यों का पता लगाता है।
    20. अलग-अलग दृश्यों को .png फ़ाइलों के रूप में सहेजें।

4. β-गैलेक्टोसिडेज़ में लिगैंड मॉडलिंग पर संकल्प का प्रभाव

  1. टर्मिनल खोलें और दो आधे-नक्शे वाली निर्देशिका पर जाएं।
  2. ChimeraX में .map प्रारूप में दो आधे नक्शे (चरण 3.1.3) खोलें, उन्हें कल्पना करें और उन्हें emd10563_half1_1_unfil.mrc और emd10563_half2_1_unfil.mrc के रूप में सहेजें।
  3. चरण 3.1.4 में बनाया गया मुखौटा एक इनपुट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  4. डिफ़ॉल्ट पैरामीटर के साथ चरण 4.2-4.3 से अर्ध-मानचित्र और मास्क का उपयोग करके Relion में पोस्टप्रोसेसिंग कार्य चलाएँ।
  5. दोहराएँ कदम 4.4, अब एक एफएससी वजन सक्षम छोड़ें के साथ और 3 ए के एक तदर्थ कम पास फिल्टर निर्दिष्ट.
  6. 3.5 Å के एक तदर्थ कम पास फिल्टर के साथ चरण 4.4 दोहराएँ.
  7. चरण 4.4-4.6 से नक्शे (postprocess.mrc) खोलें, विभिन्न प्रस्तावों पर फ़िल्टर करें, और मॉडल समन्वय, 6tsh.pdb (ChimeraX में आधे नक्शे के लिए संरेखित) PyMOL में चरण 3.1.2 से फ़ाइल। विभिन्न मानचित्रों को उनके संकल्पों द्वारा परिभाषित 3.0, 3.5 और 2.3 के रूप में पुनः नामबद्ध करें.
    नोट: कोई भी मानचित्रों के कम-पास फ़िल्टरिंग की पुष्टि उन्हें ChimeraX या Coot में देखकर कर सकता है।
  8. लिगैंड और विलायक अणुओं के घनत्व पर विभेदन के प्रभाव को 6σ की सीमा पर लिगैंड और विलायक अणुओं के चारों ओर 2 ए का जाल बनाकर कल्पना करें, जैसा कि चरण 3.3.6 में वर्णित है, जिसमें विभिन्न संकल्पों के लिए फ़िल्टर किए गए नक्शे हैं।

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Representative Results

उदाहरण 1
एम. तपेदिक से एंजाइम enolase ग्लाइकोलाइसिस के penultimate कदम उत्प्रेरित और कई चयापचय रास्ते44,45 के लिए एक आवश्यक मध्यवर्ती है जो phosphoenolpyruvate (पीईपी), के लिए 2-phosphoglycerate धर्मान्तरित. एपो-एनोलेज़ और पीईपी-बाउंड एनोलेस नमूनों के लिए क्रायोईएम डेटा 1.07 ए के समान पिक्सेल आकार में एकत्र किए गए थे, और छवि प्रसंस्करण रेलियन 3.146,47 के साथ किया गया था। एपो-एनोलेज और पीईपी-एनोलेस संरचनाएं क्रमशः 3.1 ए और 3.2 ए,48 पर निर्धारित की गई थीं। नक्शे और मॉडल EMDB और PDB49,50 (EMD-30988, EMD-30989, PDB-7e4x और PDB-7e51) में जमा किए गए थे। एंजाइम के क्रायोईएम मानचित्र से पता चलता है कि यह समाधान में एक ऑक्टेमर है (चित्र 1 ए)। पीईपी-एनोलेज़ मानचित्र में लिगैंड घनत्व की पहचान करने के लिए, एपोएंजाइम और पीईपी-बाउंड एंजाइम के अनियंत्रित मानचित्रों का चयन किया गया था, और एपोएंजाइम मानचित्र से पीईपी-एनोलेज़ मानचित्र को घटाकर चिमेराएक्स में एक अंतर मानचित्र की गणना की गई थी। एक उच्च दहलीज पर एक अलग घनत्व (हरा) मनाया गया था, जिसने लिगैंड(चित्रा 1बी)की उपस्थिति का सुझाव दिया था। बिना नुकीले नक्शे में प्रोटीन श्रृंखला मॉडलिंग ने स्पष्ट रूप से संकेत दिया कि अतिरिक्त घनत्व प्रोटीन की सक्रिय साइट (चित्रा 1सी)में मौजूद है। लिगैंड, पीईपी, को तब कूट का उपयोग करके बी-फैक्टर शार्प मैप में मॉडलिंग किया गया था, और प्रोटीन + लिगैंड मॉडल को फेनिक्स के साथ वास्तविक स्थान में परिष्कृत किया गया था। दो मिलीग्राम2+ आयनों को लिगैंड(चित्रा 1डी)के आसपास के क्षेत्र में देखे गए घनत्व में मॉडलिंग की गई थी। लिगैंड, पीईपी, एक समान अभिविन्यास को अपनाता है जैसा कि अन्य एनोलेज़ होमोलॉग में देखा गया है, और कई सक्रिय साइट अवशेष, जैसे कि Lys-386, Arg-364, लिगैंड पीईपी के साथ हाइड्रोजन बॉन्ड इंटरैक्शन बनाते हैं। एमजी2+ आयन एएसपी -241, ग्लू -283, एएसपी -310 और पीईपी के फॉस्फेट (चित्रा 1 डी) के साथ धातु समन्वय बंधन बनाते हैं।

उदाहरण 2
उपलब्ध एपो-प्रोटीन संरचना की अनुपस्थिति में या यदि प्रोटीन एक बड़े संरूपण परिवर्तन से गुजरता है, तो ऊपर वर्णित अंतर मानचित्रों की गणना करना संभव नहीं है। 2021 में, कैम्ब्रिज के लेबोरेटरी ऑफ मॉलिक्यूलर बायोलॉजी में गरीब मुर्शुदोव के समूह ने सर्वलकैट22 की शुरुआत की, जो रेफमैक का उपयोग करके एक शोधन वर्कफ़्लो लागू करता है और शोधन के बाद Fo-Fc अंतर मानचित्र की गणना भी करता है। एक सकारात्मक एफओ-एफसी अंतर घनत्व अणुओं / लिगेंड की उपस्थिति का सुझाव देता है जो शोधन के दौरान मॉडल में शामिल नहीं थे, अनिवार्य रूप से एक चूक मानचित्र। हालांकि, पहले सामान्य रूप से मानचित्र पर मॉडल के फिट का आकलन करने और फिर अंतर घनत्व मानचित्र का मूल्यांकन करने की सिफारिश की जाती है।

Refmac, mGlu5 के उपयोग का वर्णन करने के लिए, एक डिमेरिक जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर जो न्यूरोट्रांसमीटर से बांधता है, L-ग्लूटामेट को चुना गया था। एगोनिस्ट, एल-क्विसक्वालेट के बंधन पर, बाह्य डोमेन पुन: पेश होता है, जो 7 टीएम के रोटेशन को ट्रिगर करता है, उन्हें सक्रिय स्थिति को स्थिर करने के लिए करीब लाता है। इस प्रकार, एपीओ/प्रतिपक्षी बनाम के बीच एक बड़ा संरूपण परिवर्तन देखा गया है। एगोनिस्ट बाउंड स्टेट्स51 (चित्रा 2 ए और चित्रा 2 ई)। एगोनिस्ट (EMD-31536) और प्रतिपक्षी (EMD-31537) बाध्य परिसरों दोनों के लिए दो आधे नक्शे EMDB से प्राप्त किए गए थे, और क्रायोईएम मानचित्र अणु और बेहतर-हल बाह्य डोमेन में विभिन्न रिज़ॉल्यूशन दिखाते हैं। इसके बाद, इन्हें प्रत्येक डेटासेट के लिए अंतर या एफओ-एफसी मानचित्र की गणना करने के लिए मॉडल के रूप में एपो-प्रोटीन के साथ सर्वलकैट में इनपुट के रूप में उपयोग किया गया था। इस मानचित्र ने विभिन्न लिगैंड अणुओं (गैर-प्रोटीन) की उपस्थिति को स्पष्ट रूप से दिखाया। एगोनिस्ट और प्रतिपक्षी बाध्य परिसरों के लिए एफएससी (फूरियर शैल सहसंबंध) द्वारा अनुमानित संकल्प क्रमशः 3.8 ए और 4.0 ए थे। एगोनिस्ट-बाउंड एमजीएलयू5 के मामले में, सर्वलकैट एफओ-एफसी अंतर मानचित्र ने रिसेप्टर के ईसीडी में एगोनिस्ट (एल-क्विस्क्वालेट) (चित्रा 2 बी) और एन-एसिटाइलग्लुकोसामाइन (एनएजी) (चित्रा 2 सी) दोनों की उपस्थिति को दिखाया (टीएमडी के कम रिज़ॉल्यूशन के कारण, यहां हम केवल ईसीडी और टीएमडी के शीर्ष पर ध्यान केंद्रित करते हैं)। Tyr-64, Trp-100, Ser-151, और Thr-175 सहित प्रोटीन अवशेषों को एगोनिस्ट के साथ बातचीत करते देखा जाता है। एएसएन -210 अवशेषों के पास घनत्व ने एन-एसिटाइल ग्लूकोसामाइन (चित्रा 2सी) की उपस्थिति का सुझाव दिया। कोलेस्टेरिल हेमिसुकेट के अनुरूप एक घनत्व, जिसे एमजीएलयू 5 के शुद्धिकरण के दौरान जोड़ा गया था, ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स 1(चित्रा 2डी)के शीर्ष के पास देखा गया था। चूंकि संकल्प मध्यम है और लिगैंड, एल-क्विस्क्वालेट, को विभिन्न अभिविन्यासों में रखा जा सकता है, लिगैंड (पीडीबी -6 एन 50) के साथ बाह्य डोमेन की पूर्व संरचना का उपयोग लिगैंड को मॉडल करने के लिए एक गाइड के रूप में किया गया था। विरोधी बाध्यकारी रिसेप्टर (चित्रा 2ई) के खुले या आराम राज्य को स्थिर करता है। ईसीडी में वीनस फ्लाई ट्रैप डोमेन के लोब I और लोब II के काज पर प्रतिपक्षी LY341495 के अनुरूप घनत्व देखा गया था। प्रतिपक्षी एगोनिस्ट के समान अवशेषों के साथ बातचीत करता है। प्रतिपक्षी के साथ लोब II में Tyr-223 के बीच बातचीत स्टैकिंग रिसेप्टर को खुली अवस्था में स्थिर करता है (चित्र 2F)। एगोनिस्ट संरचना के समान, ग्लाइकोसिलेशन या एन-एसिटाइलग्लुकोसामाइन की उपस्थिति एएसएन-210(चित्रा 2जी)के पास देखी गई थी।

उदाहरण 3
तीसरा उदाहरण उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायोईएम मानचित्रों में टुकड़े-आकार या छोटे आकार के लिगेंड और विलायक अणुओं को मॉडल करने के लिए प्रोटोकॉल को स्पष्ट करता है। फ्रैगमेंट-आधारित ड्रग डिस्कवरी (एफबीडीडी) विभिन्न रोग क्षेत्रों में लक्ष्य-आधारित उपन्यास चिकित्सा विज्ञान के विकास में एक शक्तिशाली और अभिनव विधि के रूप में उभरा है, जिससे यह फार्मा आर एंड डी52,53 में एक आशाजनक एवेन्यू बन गया है। एफबीडीडी अणुओं के छोटे, अत्यधिक घुलनशील, कम-आणविक-भार वाले टुकड़ों की स्क्रीनिंग और सावधानीपूर्वक चयन के साथ शुरू होता है जो विशिष्ट लक्ष्य प्रोटीन या ब्याज के बायोमोलेक्यूल्स से बंधते हैं। इन प्रोटीन-टुकड़ा परिसरों की संरचनाओं का निर्धारण इन टुकड़ों के बंधन के तरीके को प्रकट करता है, जो लक्ष्यप्रोटीन 54 के प्रति बढ़ती आत्मीयता और विशिष्टता के साथ बड़े और अधिक जटिल दवा जैसे अणुओं को डिजाइन करने के लिए एक मार्गदर्शक के रूप में कार्य करता है। हालांकि, इस विधि सही मुद्रा निर्धारित करने और सही ढंग से ligand15 के कार्यात्मक समूहों जगह के लिए एक उच्च संकल्प ligand घनत्व की मांग.

β-गैलेक्टोसिडेज़, क्रायोईएम प्रौद्योगिकी में प्रगति से निर्धारित होने वाली पहली उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं में से एक, एक अच्छी तरह से अध्ययन किया गया 450kDa होमोटेट्रामेरिक एंजाइम है जो लैक्टोज के हाइड्रोलिसिस को ग्लूकोज और गैलेक्टोज55 में उत्प्रेरित करता है। FBDD, Astex, UK में क्रायोEM के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए, सक्रिय साइट (EMDB-10563, PDB:6tsh)56में बंधे एक टुकड़े-आकार के अवरोधक, डीऑक्सीगैलेक्टो-नोजिरिमाइसिन (DGN) के साथ β-गैलेक्टोसिडेज़ की संरचना निर्धारित की। इस डेटासेट का उपयोग उच्च-रिज़ॉल्यूशन मानचित्रों में लिगैंड और सॉल्वैंट्स को स्पष्ट रूप से मॉडल करने के लिए प्रोटोकॉल को चित्रित करने के लिए किया जाता है। लिगैंड मॉडलिंग और विज़ुअलाइज़ेशन पर रिज़ॉल्यूशन के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए, मानचित्रों को रिलायन में पोस्ट-प्रोसेसिंग चरण में 3.0 Å और 3.5 Å तक फ़िल्टर किया गया था। यह विभिन्न प्रस्तावों पर मानचित्र घनत्व की गुणवत्ता पर प्रकाश डालता है और लिगैंड और सॉल्वैंट्स मॉडलिंग के लिए उच्च रिज़ॉल्यूशन की आवश्यकता को रेखांकित करता है।

एंजाइम समाधान में डी 2 समरूपता के साथ एक टेट्रामर है (चित्रा 3 ए)। अंतर मानचित्र (मानचित्र और मॉडल के बीच), जैसा कि सर्वलकैट द्वारा गणना की गई है, ने एंजाइम की सक्रिय साइट में डीजीएन और कई विलायक अणुओं की उपस्थिति का सुझाव दिया (चित्र 3बी)। 2.3 ए के अनुमानित रिज़ॉल्यूशन पर, घनत्व ने उच्च-रिज़ॉल्यूशन सुविधाओं को दिखाया, जिसने प्रोटीन सक्रिय साइट में अवरोधक के सटीक मॉडलिंग में मदद की। DGN और Tyr-503 और His-540 के बीच बातचीत देखी गई(चित्र 3C)। अंतर घनत्व ने विलायक अणुओं की उपस्थिति का भी सुझाव दिया जो डीजीएन के साथ-साथ प्रोटीन अवशेषों के साथ बातचीत करते हैं। एमजी2+ और कई पानी के अणुओं को घनत्व (चित्रा 3डी) में मॉडलिंग किया गया था। एमजी2+ और ग्लू -416, ग्लू -461, और कई पानी के अणुओं के बीच धातु समन्वय बांड (चित्रा 3डी) मनाया जाता है। एमजी2+ को पानी के अणु के माध्यम से डीजीएन के साथ बातचीत करते देखा गया था।

3.5 ए और 3.0 ए के कम रिज़ॉल्यूशन पर, लिगैंड घनत्व एक बूँद जैसा दिखता है और लिगैंड के सटीक मॉडलिंग के लिए महत्वपूर्ण उच्च-रिज़ॉल्यूशन सुविधाओं का अभाव है (चित्र 4ए, बी)। इन संकल्पों पर पानी के अणुओं के लिए घनत्व लगभग न के बराबर था। सारांश में, बढ़ते संकल्प के साथ, विशेष रूप से 3.0 ए से अधिक, घनत्व ने पानी के अणुओं की एक बड़ी संख्या के मॉडलिंग को सक्षम किया (चित्र 4सी,डी)। लिगैंड के चिरल केंद्र की सही स्थिति ~ 2.3 ए(चित्रा 4सी, डी) पर प्राप्त करने योग्य हो गई, क्योंकि मानचित्र में अलग-अलग विशेषताओं की उपस्थिति के कारण प्लेसमेंट के साथ-साथ पानी के अणुओं और एमजी2+ के मॉडलिंग को निर्देशित किया गया था। इसकी तुलना में, एमजी2+ के लिए घनत्व संकल्प सीमा (चित्रा 4ए-सी) में स्पष्ट रहा।

Figure 1
चित्रा 1: एम तपेदिक एनोलेज में लिगैंड फॉस्फोनिओलपाइरूवेट मॉडलिंग। (ए) पीईपी-बाउंड एनोलेज एंजाइम के बी-फैक्टर तेज मानचित्र को दर्शाता है। मानचित्र से पता चलता है कि एनोलेज़ समाधान में ऑक्टामेरिक है, और मानचित्र में प्रत्येक मोनोमर को अलग तरह से रंगा गया है। (बी) हरे रंग में मढ़ा हुआ अंतर मानचित्र (पीईपी-बाउंड और एपो-एनोलेज़ अनशार्प किए गए नक्शे के बीच) के साथ ग्रे में एपो-एनोलेज़ एंजाइम का एक अनियंत्रित क्रायोईएम मानचित्र प्रदर्शित करता है, जो लिगैंड, पीईपी की उपस्थिति का सुझाव देता है। यह लिगेंड की उपस्थिति दिखाने के लिए एक प्रदर्शन मानचित्र है। (सी) प्रोटीन के सापेक्ष अंतर घनत्व की स्थिति को उजागर करते हुए, बिना तेज क्रायोईएम मानचित्र में एनोलेस मॉडल के फिट को प्रदर्शित करता है। प्रोटीन मॉडल को कार्टून प्रतिनिधित्व में दिखाया गया है और चेनबो में रंगा गया है। यह आंकड़ा दर्शाता है कि प्रत्येक मोनोमर की सक्रिय साइट में अतिरिक्त घनत्व (हरा) मौजूद है। (डी) लिगैंड, पीईपी, बी-फैक्टर शार्प मैप में संलग्न दिखाता है, नीले रंग का। इसके अतिरिक्त, दो Mg2+ आयनों के लिए घनत्व भी देखा गया, जो Ser-42, Asp 241, Glu-283, Asp-310, और ligand परमाणुओं सहित कई सक्रिय साइट अवशेषों के साथ धातु समन्वय बंधन बनाता है। लिगैंड Lys-386, Lys-335 और Arg-364 के साथ हाइड्रोजन बॉन्ड इंटरैक्शन बनाता है। प्रोटीन अवशेषों छड़ी प्रतिनिधित्व में दिखाया जाता है, और मिलीग्राम2+ आयनों बैंगनी गोले के रूप में दिखाया जाता है. पैनलों (ए-डी) में आंकड़े पाइमोल के साथ उत्पन्न किए गए थे। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एमजीएलयू5 रिसेप्टर में विभिन्न लिगेंड की पहचान, मॉडलिंग और दृश्य। Fo-Fc छोड़े गए नक्शे Servalcat का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे। (ए) कार्टून प्रतिनिधित्व में एमजीएलयू5 रिसेप्टर डिमर संरचना (पीडीबी -7 एफडी 8) दिखाता है, प्रत्येक मोनोमर क्रमशः चैती और गेहूं में रंगा हुआ है, और एगोनिस्ट एल-क्विस्क्लेट से बंधा हुआ है। सभी लिगेंड जिन्हें बाह्य कोशिकीय में और रिसेप्टर के ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन के शीर्ष पर पहचाना गया था, Fo-Fc ओमिट मैप में संलग्न हैं, हरे रंग का है, और 6σ पर समोच्च है। (बी) अंतर मानचित्र में संलग्न एगोनिस्ट, एल-क्विस्क्लेट के फिट पर प्रकाश डालता है। L-quisqualate Tyr-64, Trp-100, Ser-151, Thr-175 और Gly-280 सहित कई mGlu5 अवशेषों के साथ इंटरैक्ट करता है। एच-बॉन्ड इंटरैक्शन को लाल डैश द्वारा दर्शाया जाता है। (सी) में, एएसएन -210 के पास एक अतिरिक्त घनत्व स्पष्ट है, जो रिसेप्टर के बाह्य डोमेन में मौजूद है, और एन-एसिटाइलग्लुकोसामाइन अणु (एनएजी) को इस घनत्व में मॉडलिंग किया गया था। स्पष्टता के लिए, एनएजी वर्तमान आंकड़े में एएसएन से जुड़ा नहीं है। (डी) रिसेप्टर की लिपिड-उजागर सतह के पास हरे रंग में कोलेस्ट्रॉल हेमिसुक्सीनेट (सीएचएस) के लिए घनत्व में अंतर दिखाता है। सीएचएस अणु, जिसे लाठी में दर्शाया गया था, इस घनत्व में मॉडलिंग की गई थी। (ई) कार्टून प्रतिनिधित्व में प्रतिपक्षी LY341495 से बंधे mGlu5 रिसेप्टर संरचना (PDB-7fd9) को दर्शाता है। In (F), बाह्य कोशिकीय डोमेन के लोब I और लोब II के बीच काज पर स्थित Fo-Fc अंतर मानचित्र में एक अतिरिक्त घनत्व प्रतिपक्षी की उपस्थिति को इंगित करता है। प्रतिपक्षी के चारों ओर प्रमुख अवशेष (Tyr-64, Trp-100, Ser-152, Ser-173, Thr-175, और Tyr-223) छड़ी अभ्यावेदन में दिखाए जाते हैं, और प्रतिपक्षी के साथ संभावित हाइड्रोजन बॉन्ड इंटरैक्शन लाल डैश में दिखाए जाते हैं। (जी) प्रतिपक्षी-बाध्य संरचना में एएसएन -210 के पास नाग अणु की उपस्थिति के घनत्व में अंतर को दर्शाता है (ध्यान दें, एनएजी स्पष्टता के लिए एएसएन से जुड़ा नहीं है)। आंकड़े पाइमोल के साथ उत्पन्न किए गए थे। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: β-गैलेक्टोसिडेज़ (ईएमडी-10563) के उच्च-रिज़ॉल्यूशन मानचित्र में एक छोटे अवरोधक और विलायक अणुओं की पहचान, मॉडलिंग और शोधन। (ए) कार्टून प्रतिनिधित्व में 2.3 ए (पीडीबी: 6 टीएसएच) के लिए हल किए गए β-गैलेक्टोसिडेज़ मॉडल को दिखाता है, जहां प्रत्येक मोनोमर को स्पष्ट रूप से रंगीन किया जाता है। ग्रे बॉक्स लिगैंड बाइंडिंग साइट को हाइलाइट करता है। (बी) एंजाइम की सक्रिय साइट में हरे जाल में एफओ-एफसी अंतर घनत्व (सर्वलकैट से) प्रदर्शित करता है। घनत्व में अंतर सक्रिय साइट में अवरोधक (DGN) और कई विलायक अणुओं की उपस्थिति का सुझाव देता है। (सी) दर्शाता है कि एफओ-एफसी मानचित्र द्वारा निर्देशित, अवरोधक डीऑक्सीगैलेक्टो-नोजिरिमाइसिन (डीजीएन) को सक्रिय साइट में मॉडलिंग किया गया है। इस मॉडलिंग किए गए लिगैंड को स्टिक प्रारूप में दर्शाया गया है और फो घनत्व (सर्वलकैट द्वारा) में संलग्न किया गया है, जो blue_mesh में रंगीन है। DGN और Tyr-503 और His-540 सहित कई प्रोटीन अवशेषों के बीच हाइड्रोजन बॉन्ड इंटरैक्शन देखा जाता है। लिगैंड (हरा) के चारों ओर अतिरिक्त Fo-Fc अंतर घनत्व विलायक अणुओं का संकेत है। (डी) मानचित्र पानी और एमजी2+ सहित कई विलायक अणुओं को दिखाता है, क्रमशः लाल और बैंगनी गोले के रूप में दर्शाया गया है, यह सुनिश्चित करने के बाद सक्रिय साइट में मॉडलिंग की जाती है कि प्रत्येक विलायक अणु या तो प्रोटीन (ग्लू -416, हिज -418, और ग्लू -461) या लिगैंड अवशेषों से बंधा हुआ है। पानी के अणु और Mg2+ Fo घनत्व (नीले जाल) में संलग्न हैं। Mg2+ को पानी के अणु के माध्यम से लिगैंड, DGN के साथ बातचीत करते देखा जाता है। पैनलों (बी, सी) में एफओ-एफसी मानचित्र (हरा जाल) 6σ पर समोच्च है, जबकि फो घनत्व - सी और डी में नीला जाल (मॉडलिंग के बाद सर्वलकैट शोधन से) 3σ पर समोच्च है। पैनलों (ए-डी) में आंकड़े पाइमोल के साथ उत्पन्न किए गए थे। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: β-गैलेक्टोसिडेज़ में लिगैंड मॉडलिंग पर संकल्प का प्रभाव। EMD-10563 से आधे नक्शे Relion के बाद प्रक्रिया कदम में इनपुट के रूप में इस्तेमाल किया गया, और संयुक्त बाद प्रक्रिया नक्शे संकल्प 2.3 Å, 3.0 ए, और 3.5 अलग बी कारकों के साथ फ़िल्टर किए गए. सभी पैनलों में दिखाया गया नक्शा 6σ पर समोच्च है। स्पष्टता के लिए, केवल प्रोटीन रीढ़ की हड्डी पैनलों ए, बी, और सी में कोई पक्ष श्रृंखला, ligand या विलायक अणुओं के साथ दिखाया गया है (ए) नक्शा 3.5 Å करने के लिए फ़िल्टर किया गया है, और β galactosidase के सक्रिय साइट दिखाया गया है. लिगैंड, डीजीएन जैसा दिखने वाला एक बूँद, इस संकल्प पर देखा जाता है, आसपास के क्षेत्र में कुछ छोटे बूँदों के साथ। मानचित्र में विशिष्ट विशेषताओं की कमी के कारण लिगैंड को सही अभिविन्यास में मॉडलिंग करना चुनौतीपूर्ण साबित होता है। (बी) 3.0 ए रिज़ॉल्यूशन के लिए फ़िल्टर किया गया नक्शा दिखाया गया है। यहां, लिगैंड बूँद थोड़ा अधिक परिभाषित हो जाता है लेकिन अभी भी सामान्य रूप से सुविधाओं का अभाव है। विलायक अणुओं के विचारोत्तेजक कुछ और छोटे बूँदें भी देखे जाते हैं। (सी) 2.3 ए रिज़ॉल्यूशन के लिए फ़िल्टर किए गए मानचित्र से अलग-अलग विशेषताओं के साथ लिगैंड घनत्व का पता चलता है, विशेष रूप से इमिनोसुगर की कुर्सी रचना का पता चलता है। इस संकल्प पर पानी के अणुओं के अनुरूप छोटे बूँदों की एक महत्वपूर्ण संख्या देखी जाती है। Relion पोस्ट-प्रोसेस में स्वचालित B-फैक्टर अनुमान/शार्पनिंग 3 Å और 3.5 Å तक फ़िल्टर किए गए मानचित्रों के लिए -18 Å2 का मान देता है, जबकि 2.3 Å तक फ़िल्टर किए गएमानचित्र के लिए मान -52 Å 2 है। EM मानचित्रों का विभिन्न B-फैक्टर शार्पनिंग भी Coot के साथ किया जा सकता है और मॉडल निर्माण में उपयोगी हो सकता है। (डी) पैनल दिखाता है कि लिगैंड डीजीएन (छड़ी प्रतिनिधित्व), एमजी2+, और पानी के अणु (गोले के रूप में) सक्रिय साइट में मॉडलिंग के रूप में और 2.3 ए पर तेज नक्शा, इन परमाणुओं के आसपास नीले जाल में दिखाया गया है। पैनलों (ए-डी) में आंकड़े पाइमोल के साथ उत्पन्न किए गए थे। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

माइक्रोस्कोप हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर में सुधार के परिणामस्वरूप हाल के वर्षों में क्रायोईएम संरचनाओं की संख्या में वृद्धि हुई है। हालांकि एकल कण क्रायोईएम में इस समय प्राप्त उच्चतम रिज़ॉल्यूशन 1.2 Å 57,58,59 है, अधिकांश संरचनाएं 3-4 Å रिज़ॉल्यूशन के आसपास निर्धारित की जा रही हैं। मध्यम से कम-रिज़ॉल्यूशन वाले मानचित्रों में लिगेंड मॉडलिंग मुश्किल हो सकती है और अक्सर अस्पष्टता से भरा हो सकता है। ट्रांसलेशनल रिसर्च और ड्रग डिस्कवरी के लिए अकादमिक और फार्मा उद्योग दोनों में क्रायोईएम के व्यापक उपयोग को देखते हुए, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि लिगेंड सही ढंग से और अस्पष्टता के बिना मॉडलिंग किए गए हैं। इस प्रकार, क्यू-स्कोर60 की गणना करके लिगैंड परमाणुओं की समाधान क्षमता को निर्धारित करना विवेकपूर्ण है, जो अब ईएमडीबी में नक्शे की गुणवत्ता और मॉडल के फिट होने के साथ-साथ चिमेरा में मूल्यांकन करने के लिए एक मीट्रिक के रूप में उपलब्ध है।

पहले उदाहरण में, चिमेराएक्स का उपयोग एम. ट्यूबरकुलोसिस एनोलेज एंजाइम में एपो और लिगैंड-बाउंड मानचित्रों के बीच वास्तविक स्थान में अंतर मानचित्र की गणना करने के लिए किया गया था। एक उच्च सीमा पर अतिरिक्त घनत्व लिगैंड की उपस्थिति का सुझाव देता है, phosphoenolpyruvate, सक्रिय साइट में और, Mg2+ ligand से बंधे. यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि, इस मामले में, मानचित्र मध्यम रिज़ॉल्यूशन (3.2 ए) का है, और पानी के अणुओं को आत्मविश्वास से मॉडलिंग नहीं किया जा सकता है (चित्र 1)। इस पद्धति से जुड़ी सीमा यह है कि इसे केवल तभी लागू किया जा सकता है जब लिगैंड बाइंडिंग प्रोटीन में महत्वपूर्ण संरूपण परिवर्तन को प्रेरित नहीं करता है। इस मामले में मानचित्र सामान्यीकरण नहीं किया गया था क्योंकि एपीओ और लिगैंड-बाउंड डेटासेट दोनों को एक ही पिक्सेल आकार में अधिग्रहित किया गया था और रिलायन में समान मापदंडों के साथ संसाधित किया गया था। हालांकि, यह ध्यान देने योग्य है कि विभिन्न पुनर्निर्माण कार्यक्रमों, जैसे कि Relion46,47 और CryoSparc61, या विभिन्न गुणवत्ता के साथ उत्पन्न मानचित्रों की तुलना करते समय, सार्थक तुलना करने से पहले मानचित्रों का सामान्यीकरण आवश्यक हो जाता है।

अगला उदाहरण एमजीएलयू5 है, जो एगोनिस्ट बाइंडिंग पर बड़े आणविक पुनर्गठन से गुजरता है, जैसा कि क्रायोईएम संरचनाओं51,62(चित्रा 2)से स्पष्ट है। इस परिदृश्य में, मानचित्रों के बीच पर्याप्त अंतर के कारण अनबाउंड (एपीओ) और लिगैंड-बाउंड रिसेप्टर्स के बीच एक साधारण अंतर मानचित्र की गणना करना संभव नहीं है। यहां, सर्वलकैट, जो पारस्परिक अंतरिक्ष में शोधन के लिए इनपुट के रूप में अनशार्प और अनवेटेड हाफ-मैप का उपयोग करता है और बाद में प्रयोगात्मक मानचित्र और मॉडल से प्राप्त मानचित्र के बीच एक अंतर मानचित्र की गणना करता है, का उपयोग किया गया था। उच्च सीमा पर, कोई भी अंतर की कल्पना कर सकता है और मॉडल के सुधार और सुधार के लिए एक मार्गदर्शक के रूप में कार्य कर सकता है। बाह्य कोशिकीय में और एमजीएलयू5 के ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन के पास कई अनमॉडेल्ड ब्लॉब्स देखे गए और लिगेंड्स (चित्रा 2)के मॉडल के लिए एक गाइड के रूप में उपयोग किए गए।

तीसरा उदाहरण दिखाता है कि कैसे रिज़ॉल्यूशन (2.3 Å) मानचित्र की व्याख्या और β-गैलेक्टोसिडेज़ में एक टुकड़े के आकार के अवरोधक के मॉडलिंग में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यहां, चुनौती डेटा में निहित शोर के बीच सर्वलकैट अंतर मानचित्र में एक बहुत छोटे लिगैंड (<200 दा) की पहचान करना और इसे सटीक रूप से मॉडल करना था। फूरियर शैल सहसंबंध (एफएससी) का उपयोग करके निर्धारित उच्च वैश्विक संकल्प के अलावा, लिगैंड के लिए विशिष्ट स्थानीय संकल्प भी लिगैंड्स (चित्रा 3) के चिरल केंद्रों के सटीक प्लेसमेंट को सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त रूप से उच्च था। विलायक अणुओं के लिए घनत्व पूरे एंजाइम में और विशेष रूप से लिगैंड के आसपास अंतर मानचित्र में देखा गया था। मॉडलिंग लिगेंड और विलायक परमाणुओं पर संकल्प का प्रभाव भी प्रदर्शित किया गया था(चित्रा 4)। पानी या विलायक अणुओं को मॉडलिंग करते समय सावधानी बरतना महत्वपूर्ण है, क्योंकि इस अवसर पर, कम सीमा पर शोर पानी या विलायक अणुओं के समान हो सकता है, जिससे संभावित गलत व्याख्याएं हो सकती हैं।

एक अन्य महत्वपूर्ण विचार यह है कि क्रायोईएम मानचित्र अकेले धातु आयन की सटीक पहचान करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकते हैं। धातु आयन की उपस्थिति और पहचान की पुष्टि करने के लिए विस्तारित एक्स-रे अवशोषण ठीक संरचना (EXAFS) या ऊर्जा-फैलाने वाले एक्स-रे स्पेक्ट्रोस्कोपी (EDX) जैसे अतिरिक्त बायोफिजिकल तरीके अक्सर आवश्यक होते हैं। एनोलेस और β-गैलेक्टोसिडेज़ एंजाइम दोनों में, एमजी2+ को इन प्रोटीनों पर पहले से उपलब्ध जानकारी के धन के कारण मॉडलिंग की गई थी, जो धातु आयन की पहचान की पुष्टि करता है। इसके अलावा, इन मामलों में धातु आयनों का समन्वय, क्लासिक ऑक्टाहेड्रल ज्यामिति और एमजी2+ की निकट-आदर्श समन्वय दूरी द्वारा अनुकरणीय, उनकी पहचान का पर्याप्त प्रमाण प्रदान करता है।

सामान्य तौर पर, क्रायोईएम मानचित्रों में लिगेंड मॉडलिंग करते समय कुछ महत्वपूर्ण विचारों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। आरंभ करने के लिए, लिगैंड पहचान और मॉडलिंग के लिए सही मानचित्र चुनना महत्वपूर्ण है। सभी मामलों में, लिगैंड घनत्व की कल्पना करने के लिए एक तेज और भारित मानचित्र पर एक अनियंत्रित और भारित मानचित्र या आधा-मानचित्र की सलाह दी जाती है, क्योंकि शार्पनिंग और वेटिंग के परिणामस्वरूप मानचित्र में कम-तेज या अधिक तेज (श्रृंखला समाप्ति के कारण शोर) क्षेत्र हो सकते हैं। इसके परिणामस्वरूप एक उप-इष्टतम लिगैंड घनत्व हो सकता है, और कूट में मॉडल निर्माण के दौरान घनत्व का मूल्यांकन करने के लिए विभिन्न बी-फैक्टर शार्पनिंग का उपयोग किया जा सकता है। यद्यपि क्रायोईएम मानचित्र में लिगेंड की पहचान करने के लिए तेज मानचित्र का उपयोग करने में जोखिम है, लेकिन बिना नुकीला नक्शा लिगैंड घनत्व का पूरा विवरण नहीं दिखा सकता है, लेकिन प्रदर्शन उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसा कि चित्र 1बी, सी में दिखाया गया है।

मॉडलिंग किए गए लिगैंड की मुद्रा को मान्य किया जाना चाहिए, खासकर उन मामलों में जहां डेटा कमजोर है। जैसा कि mGlu5 के लिए यहां दिखाया गया है, स्थानीय रिज़ॉल्यूशन क्रायोईएम मानचित्र में भिन्न होता है, और लिगैंड का निष्पक्ष मॉडलिंग चुनौतीपूर्ण हो सकता है। Servalcat प्रोटीन और ligand मॉडलिंग22 में संभावित अशुद्धियों का पता लगाने के लिए एक मूल्यवान उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

संरचनात्मक विषमता एक प्रोटीन-लिगैंड कॉम्प्लेक्स में मौजूद हो सकती है जहां केवल एक विशिष्ट आबादी में लिगैंड मौजूद हो सकता है (यदि लिगैंड कम आणविक भार का है, तो वर्गीकरण चरण विषमता को हटा नहीं सकता है)। फिर भी, लिगैंड मॉडलिंग से पहले छवि प्रसंस्करण के दौरान 3 डी वर्गीकरण63 चरण को पुनरावृत्त रूप से करना महत्वपूर्ण है और सत्यापित करें कि लिगैंड का घनत्व बेहतर होता है या नहीं। यदि प्रोटीन की कई प्रतियां मौजूद हैं, तो प्रारंभिक मॉडल पीढ़ी और शोधन के दौरान मानचित्र में समरूपता लागू करते समय सावधानी बरतनी चाहिए, क्योंकि यह सभी समरूपता से संबंधित अणुओं में लिगैंड घनत्व को औसत कर सकता है। समरूपता केवल तभी लगाई जानी चाहिए जब सभी प्रोटीन श्रृंखलाओं में लिगैंड घनत्व की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए मानचित्र का पूरी तरह से निरीक्षण किया गया हो।

राज्य (क्रिस्टल या समाधान) और स्थान (दफन या सतह) के आधार पर, परमाणु गतिशील हो सकते हैं, और मॉडल शोधन में, इसे परमाणु विस्थापन पैरामीटर (एडीपी) के रूप में जाना जाता है। अंतर मानचित्र के साथ, जो मॉडल में संभावित अशुद्धियों के लिए दृश्य सुराग प्रदान करता है, एडीपी मूल्यों का उपयोगशोधन 64,65,66,67के बाद लिगैंड की सटीकता का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। आमतौर पर, लिगैंड में आसपास के अवशेषों के समान एडीपी मान होना चाहिए, अर्थात, यदि वे स्थिर रूप से बंधे हुए हैं और सटीक रूप से मॉडलिंग किए गए हैं। हालांकि, परिधि पर लिगैंड या एक लिगैंड (जैसे लिपिड) के परमाणु जो मैक्रोमोलेक्यूल्स से बहुत दूर हैं, उनमें उच्च एडीपी मान हो सकते हैं। निर्देशांक को परिष्कृत करने के अलावा, Refmac33,34 और Phenix दोनों ADP मूल्यों 28,68 के शोधन की अनुमति देते हैं. Refmac में, Mott-Bethe सन्निकटन का उपयोग मानचित्र गणना के दौरान व्यक्तिगत परमाणुओं के इलेक्ट्रॉन प्रकीर्णन कारक की गणना करने के लिए किया जाता है। फेनिक्स के हालिया संस्करण में, क्रिस्टलोग्राफी के समान व्यक्तिगत बी-कारक शोधन को परमाणु विकार के लिए पेश किया गया है। बहुत बार, क्रायोईएम से प्राप्त परिष्कृत मॉडल में, एडीपी मूल्यों की एक विस्तृत श्रृंखला देखी जाती है (कभी-कभी शून्य के करीब मान), और यहां तक कि क्यू-स्कोर जो मानचित्र के साथ मॉडल के फिट का मूल्यांकन करने के लिए ईएमडीबी में उपयोग किया जाता है, जमा किए गए प्राथमिक मानचित्र और बी-फैक्टर शार्पनिंग60 की प्रकृति पर निर्भर करता है। क्रायोईएम मॉडल निर्माण में, अक्सर कई मानचित्रों का उपयोग किया जाता है, और इस प्रकार, मॉडलिंग और शोधन में उपयोग किए जाने वाले मानचित्रों का विधियों में स्पष्ट रूप से उल्लेख किया जाना चाहिए, क्योंकि कई मैक्रोमोलेक्यूल्स में अनिसोट्रोपिक रिज़ॉल्यूशन के कारण, एक एकल मानचित्र सभी विवरणों की व्याख्या करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है। 

मैक्रोमोलेक्यूल्स में लिगेंड के मॉडलिंग में, क्रायोईएम मानचित्रों (जैसे क्रिस्टलोग्राफी में) की मुख्य सीमाओं में से एक यह है कि यदि लिगैंड बाइंडिंग साइट कम रिज़ॉल्यूशन की है या यदि बाध्य लिगैंड गतिशील है, तो सही रचना का पता लगाना मुश्किल साबित हो सकता है। इसके अलावा, अधिकांश क्रायोईएम संरचनाओं में 3 ए से नीचे के संकल्प होते हैं, और मानचित्रों में पानी के अणुओं का प्रतिनिधित्व सीमित होता है, जिससे लिगैंड या ड्रग बाइंडिंग में जलयोजन की भूमिका का आकलन करना मुश्किल हो जाता है (जैसा कि एनोलेज़ और एमजीएलआर के उदाहरणों के साथ यहां दिखाया गया है)। कम्प्यूटेशनल विधियों का उपयोग क्रायोईएम डेटा के संयोजन में इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए किया जा सकताहै। क्रिस्टलोग्राफी के विपरीत, केवल मॉडल शोधन से गुजरता है, मानचित्र नहीं। वर्तमान में, लिगैंड की उपस्थिति को इंगित करने या सटीक मॉडलिंग सुनिश्चित करने का एकमात्र तरीका ओमिट मैप (सर्वलकैट जैसे टूल का उपयोग करके) उत्पन्न करना है। इस प्रकार, शोधकर्ताओं को मॉडल बनाने और मूल्यांकन करने में मदद करने के लिए कई उपकरण हैं, लेकिन मॉडल शोधन में कई क्षेत्र हैं जहां निकट भविष्य में नए दृष्टिकोण या वर्तमान दृष्टिकोणों के संशोधनों की उम्मीद की जा सकती है।

इस लेख में, हमने लिगैंड मॉडलिंग के लिए वर्तमान दृष्टिकोणों पर ध्यान केंद्रित किया है, जिसमें लिगैंड घनत्व का मैनुअल निरीक्षण शामिल है, लिगैंड ज्यामिति फ़ाइल उत्पन्न करना, इसके बाद क्रायोईएम मानचित्र में लिगैंड मॉडलिंग करना। यह संरचनात्मक जीव विज्ञान और दवा की खोज में एक रोमांचक अवधि है, क्योंकि तेज फ्रेम दर के साथ प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टरों और तेजी से डेटा अधिग्रहण70 के उपयोग के परिणामस्वरूप कई मैक्रोमोलेक्यूल्स के उच्च-रिज़ॉल्यूशन मानचित्र (<2.8 ए) प्राप्त हुए हैं जो अक्सर अपेक्षाकृत कम समय में छोटे अणु लिगेंड से बंधे होते हैं। श्रोडिंगर सूट में GEMspot69 और रोसेटा सूट में EMERALD17 जैसे स्वचालित लिगैंड मॉडलिंग टूल की हालिया शुरूआत, जो प्रयोगात्मक क्रायोईएम डेटा में फैक्टरिंग करते हुए लिगैंड की सबसे संभावित बाध्य मुद्रा खोजने का प्रयास करती है, इस प्रक्रिया को सुव्यवस्थित और स्वचालित करने का वादा करती है। एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के समान, यह कल्पना की गई है कि क्रायोईएम द्वारा छोटे-अणु लिगेंड के बाध्यकारी मोड की पहचान करना, शायद एक ही दिन में दो या अधिक, एक यथार्थवादी संभावना बन जाएगी।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

SJ DAE-TIFR से पीएचडी छात्रवृत्ति का प्राप्तकर्ता है, और धन स्वीकार किया जाता है। केआरवी डीबीटी बी-लाइफ ग्रांट डीबीटी/PR12422/एमईडी/31/287/2014 और परमाणु ऊर्जा विभाग, भारत सरकार के समर्थन को परियोजना पहचान संख्या 2014 के तहत स्वीकार करता है। RTI4006।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CCP4-8.0 Consortium of several institutes https://www.ccp4.ac.uk Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography
CCP-EM Consortium of several institutes https://www.ccpem.ac.uk/download.php Free for academic users and includes Coot, Relion and many others
Coot  Paul Emsley, LMB, Cambridge https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ General software for model building but also available with other suites described above
DockinMap (Phenix) Consortium of several institutes https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps
Electron Microscopy Data Bank  Consortium of several institutes https://www.ebi.ac.uk/emdb/ Public Repository for Electron Microscopy maps
Falcon Thermo Fisher Scientific  https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf Commercial, camera from Thermo Fisher 
Phenix  Consortium of several institutes https://phenix-online.org/download Free for academic users and includes Coot
Protein Data Bank Consortium of several institutes https://rcsb.org Public database of macromolecular structures
Pymol Schrodinger https://pymol.org/2/ Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.
Relion MRC-LMB, Cambridge https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM
Titan Krios Thermo Fisher Scientific  https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&
gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA
AkZesWC4FYQSwIQRk
ZApkj08MfYG040DtiiuL8
RihoCebEQAvD_BwE		 Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF Chimera UCSF, USA https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html General purpose software for display, analysis and more
UCSF Chimera X UCSF, USA https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/ General purpose software for display, analysis and more

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इलेक्ट्रॉन क्रायोमाइक्रोस्कोपी से प्राप्त मानचित्रों में लिगैंड मॉडलिंग
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Jha, S., Bose, S., Vinothkumar, K.… More

Jha, S., Bose, S., Vinothkumar, K. R. Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy. J. Vis. Exp. (209), e66310, doi:10.3791/66310 (2024).

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